CN105671204B - Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂 - Google Patents

Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂 Download PDF

Info

Publication number
CN105671204B
CN105671204B CN201610145803.5A CN201610145803A CN105671204B CN 105671204 B CN105671204 B CN 105671204B CN 201610145803 A CN201610145803 A CN 201610145803A CN 105671204 B CN105671204 B CN 105671204B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
pcr
ndv
primer
ibv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610145803.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105671204A (zh
Inventor
陈静
徐聪
张向东
王苗利
杨鹏
马慧玲
王贵升
孙圣福
张月
孔祥华
于青海
李玉杰
徐鸿
刘丽平
蔺晓月
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
SHANDONG ANIMAL EPIDEMIC DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Original Assignee
BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
SHANDONG ANIMAL EPIDEMIC DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD, SHANDONG ANIMAL EPIDEMIC DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER filed Critical BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
Priority to CN201610145803.5A priority Critical patent/CN105671204B/zh
Publication of CN105671204A publication Critical patent/CN105671204A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105671204B publication Critical patent/CN105671204B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种NDV/H9‑AIV/IBV三重荧光PCR检测试剂，属于动物检疫技术领域。本发明分别选择新城疫病毒M基因编码区特定序列、禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列、鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%‑60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用，探针的长度仅为13个碱基，采用LAN修饰，以提高其Tm值；其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

Description

NDV/H9-AIV/IBV三重荧光PCR检测试剂
技术领域
本发明涉及一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法，属于动物检疫技术领域。
背景技术
新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎是危害养禽业的重要传染病，属于急性高度接触性呼吸道传染病。新城疫是纳入养禽场日常免疫程序的防控传染病，虽然疫苗覆盖范围广，但是由于种种原因，新城疫疫情时常发生，只不过死亡率比不用疫苗来说大幅降低。禽流感H9亚型对养禽业的影响较大，疫苗使用较普遍，但是由于禽流感H9亚型毒株变异快，经常出现新的变异株，导致禽类发病。鸡传染性支气管炎也具有很强的变异性，常规疫苗保护率不高，禽群感染发病的情况时有发生。在鸡场使用疫苗的前提下，这三种传染病发生导致鸡的死亡率一般都在30%以内，由于这三种传染病都属于呼吸道传染病，临床症状相似，仅凭肉眼很难区分。再者临床上经常出现两种传染病混合感染情况，给疫病的诊断带来困难。
实验室传统的诊断新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎的方法为鸡胚病毒分离鉴定，该方法耗时长，需要在一定安全级别的实验室内进行。当出现两种以上传染病混合感染时，鸡胚病毒分离鉴定更为困难，一种病毒的增殖会掩盖另一种病毒的增殖，最后往往只能鉴定出一种病毒，忽略了其它病毒的存在，造成发生疾病的误诊，给防治工作带来难度。
随着分子生物学技术的发展，一批核酸检测技术如普通RT-PCR和荧光RT-PCR应用到新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎检测诊断工作中，特别是荧光RT-PCR技术以敏感、特异、耗时短受到广大科研和检测技术人员的青睐，对于混合感染的禽群，也很容易用该方法检出，真正做到了早发现、早确诊。国内外报道单一荧光RT-PCR方法较多，将新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒同时检测的三重荧光RT-PCR技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是建立同时检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法，为快速鉴别这三种病毒提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂，含有以下引物：
NDV-F：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’，如SEQ ID NO.1所示，
NDV-R为：5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’，如SEQ ID NO.2所示，
NDV-P：5’FAM -TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA 3’，如SEQ ID NO.3所示，
H9-F：5’ATGGGGTTTGCTGCC 3’ ，如SEQ ID NO.4所示，
H9-R：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG 3’，如SEQ ID NO.5所示，
H9-P：5’ HEX- TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.6所示，
IBV-F：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’，如SEQ ID NO.7所示，
IBV-R：5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’，如SEQ ID NO.8所示，
IBV-P：5’CY5- CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.9所示，
其中，NDV-P：5’FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA-3’中“+”后面的碱基代表LNA修饰。
一种上述新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂，由荧光RT-PCR反应液和酶混合物按照20:1的体积比组成；
所述荧光RT-PCR反应液的组成：
10μmol/L的NDV-F：1μl，
10μmol/L的NDV-R：1μl，
10μmol/L的NDV-P：0.5μl，
10μmol/L的H9-F：1.2μl，
10μmol/L的H9-R：1.2μl，
10μmol/L的H9-P：1μl，
10μmol/L的IBV-F：1μl，
10μmol/L的IBV-R：1μl，
10μmol/L的IBV-P：0.5μl，
5× RT缓冲液：3.75μl，
10×PCR 缓冲液：1.875μl，
25mmol/L的MgCl2：2.125μl，
10mmol/L的dNTP：2μl，
DEPC处理水：1.85μl；
所述酶混合物：由200 U/μL的M-MLV反转录酶、5 U/μL的Taq DNA 聚合酶、40 U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
所述DEPC处理水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, 得 Millipore-Q纯化水；然后向 Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟，即可。
一种含有上述新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
上述试剂盒，还含有阴性对照、阳性对照；
所述阴性对照：正常SPF鸡的肝脏，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；
所述阳性对照：为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2（A/chicken/Shandong/96【H9N2】）、鸡传染性支气管炎病毒H52株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体积比混合而成。
上述试剂盒，由提取试剂盒和检测试剂盒组成：
所述提取试剂盒的组成如下：
Buffer A为裂解液，含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、30%(v/v)乙醇。
Buffer B为洗液，含有10mmol/L Tris-HCI、1mmol/LEDTA、70%(v/v)乙醇。
Buffer C为溶解液，主要由DEPC水组成；
所述检测试剂盒的组成如下：
。
一种新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法，
取待测样品的核酸5ul与20ul本发明的上述检测试剂配成25ul的反应体系，或者，
取待测样品的核酸5ul置于本发明的上述试剂盒中；
然后进行荧光定量RT-PCR反应，读取结果；
所述荧光定量PCR反应：
第一阶段：反转录，42℃/30 min；
第二阶段：预变性，92℃/3 min；
第三阶段：预扩增，92℃ 15sec，45℃ 30sec，72℃ 60sec;
第四阶段：92℃ 10sec，52℃ 15sec，60℃ 30sec，40个循环，在第,四阶段每次循环的60 ℃退火延伸时收集荧光；
所述读取结果：
如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有新城疫病毒；
如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有禽流感病毒H9亚型；
如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线，且Ct值小于30，则样品中含有鸡传染性支气管炎病毒。
上述检测方法，利用FAM（465-510）通道、HEX（VIC）（533-580）和CY5（618-660）通道读取结果；
阴性结果：三个检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒；
单阳性结果：
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而HEX/VIC检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新城疫病毒；
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而FAM检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型；
如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而FAM检测通道和HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒；
双阳性结果：
如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型；
如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒；
如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。
上述检测方法，
阴性对照用三个检测通道读取数据时，应均无Ct/Cp值并且无扩增曲线；
阳性对照用三个检测通道读取数据时，应出现三条相应的特征性扩增曲线，且Ct/Cp值均应小于等于28。
如阴性或阳性对的检测结果照不满足以上条件，此次实验视为无效。
上述检测方法，任一通道Ct/Cp值大于30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验；复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
本发明选择新城疫病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行新城疫病毒通用引物和探针设计；选择禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上，进行禽流感病毒H9亚型引物和探针设计；选择鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行鸡传染性支气管炎病毒引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用，探针的长度仅为13个碱基，采用LAN修饰，以提高其Tm值；其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。
新城疫病毒通用探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭基团TAMRA；禽流感病毒H9亚型探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX（5-hexachloro-荧光素），3’端标记淬灭荧光基团BHQ1；鸡传染性支气管炎病毒探针序列的5’端标记报告荧光基团CY5，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2。
采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，以减少相互间的干扰，达到对三种病毒模板在相同条件下同时扩增的效果。三重荧光RT-PCR检测技术与单个相比，不仅节省了时间，一次试验又能同时检测三种病毒。本发明就是利用三重荧光RT-PCR的优点，建立同时检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法，为快速鉴别检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒提供一种简便方法。
本发明通过实验证明，本发明提供的检测试剂、检测试剂盒及检测方法，可以一步法确认待检样品中是否存在新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。本发明的检测试剂、试剂盒不仅适用于禽类组织样本中新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的检测，还可适用于禽类咽喉/泄殖腔拭子中新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的快速筛查。
本发明的优点是：本发明选择新城疫病毒M基因、禽流感病毒H9亚型的H基因和鸡传染性支气管炎病毒M基因作为靶序列，分别设计引物和探针建立并优化了新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂、试剂盒，取得了优异的技术效果：
1）快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果，且较单重荧光RT-PCR检测方法省时，具有快速、一步即可鉴别的优势。
2）灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，试剂盒的灵敏度可达100拷贝/反应。
3）特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于普通RT-PCR方法；用新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法检测禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒病毒等，均无交叉反应，表明特异性良好。
4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验，变异系数小于5%。
5）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。
附图说明
图1，以新城疫病毒Lasota株感染尿囊液为样本的检测结果；曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后， FAM检测通道扩增曲线；
图2，以禽流感病毒H9亚型感染尿囊液为样本的检测结果；曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后， HEX检测通道扩增曲线；
图3，以鸡传染性支气管炎病毒H52感染尿囊液为样本的检测结果；曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后， CY5检测通道扩增曲线；
图4，以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以新城疫病毒Lasota株为阳性对照，检测结果；“S”型曲线为通过FAM检测通道读取的阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过FAM检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果；
图5，以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以禽流感病毒H9亚型为阳性对照，检测结果；“S”型曲线为通过HEX检测通道读取的阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过HEX检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果；
图6，以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以鸡传染性支气管炎病毒H52株为阳性对照，检测结果；“S”型曲线为通过CY5检测通道读取的阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过CY5检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 引物、探针的设计
根据Genbank登录的已发表的新城疫病毒M基因序列（Genbank登录号AP014968.1），禽流感病毒H9亚型H基因序列（Genbank登录号 KP417167.1），鸡传染性支气管炎病毒M基因序列（Genbank登录号KJ435285.1）设计新城疫病毒通用引物、探针，禽流感病毒H9亚型引物、探针和鸡传染性支气管炎病毒引物、探针。新城疫病毒通用探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭基团TAMRA；禽流感病毒H9亚型探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX（5-hexachloro-荧光素），3’端标记淬灭荧光基团BHQ1；鸡传染性支气管炎病毒探针序列的5’端标记荧光报告基团CY5，3’端标记淬灭荧光基团BHQ2。通过分析实验，得到以下引物、探针：
新城疫-上游引物：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG 3’，如SEQ ID NO.1所示，
新城疫-下游引物：5’ GCTTTCACRTGCTTVACTG 3’，如SEQ ID NO.2所示，
新城疫-探针：5’[FAM]-TA+G TG+C AG+G CA+C C-[TAMRA]-3’(+后面碱基代表LNA修饰；LNA即锁核酸，修饰的目的提高探针的Tm值)；如SEQ ID NO.3所示，
禽流感病毒H9-上游引物 ：5’ATGGGGTTTGCTGCC3’，如SEQ ID NO.4所示，
禽流感病毒H9-下游引物：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’，如SEQ ID NO.5所示，
禽流感病毒H9-探针：5’[HEX]- TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-[BHQ1]-3’；如SEQ IDNO.6所示，
鸡传染性支气管炎-上游引物：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC 3’，如SEQ ID NO.7所示，
鸡传染性支气管炎-下游引物：5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC 3’，如SEQ ID NO.8所示，
鸡传染性支气管炎-探针：5’ [CY5]-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-[BHQ2]-3’，如SEQ ID NO.9所示。
实施例2 柱式提取操作方法提取RNA
1、取灭菌的1.5 mL离心管，加入Buffer A 500 mL、样本（待测样本及阴阳性对照样本）各200 mL，充分混匀，室温放置10分钟；
2、取与离心管等量的RNase-Free吸附柱；将离心管中的溶液和絮状沉淀转移至Rnase-Free吸附柱，吸附柱套上收集管（为避免堵塞吸附柱，尽量不要吸悬浮杂质（样本中的杂质）；13000转室温离心30秒；弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中；
3、吸附柱内加入600uL Buffer B，13000转离心30秒；弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中；
4、重复步骤3；13000转空柱离心2分钟，去除残留液；
5、将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入50uL Buffer C，室温静置1分钟，13000转离心30秒，离心管中液体即为模板RNA。
获得的RNA溶液，冰上保存备用（注意提取的RNA须在2 h内进行RT-PCR 扩增，若需长期保存须放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融）；
Buffer A为裂解液，含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、30%（V/V）乙醇；
Buffer B为洗液，含有10mmol/L Tris-HCI、1mM EDTA、70%（V/V）乙醇；
Buffer C为溶解液，主要由DEPC水组成；
所述DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, 得 Millipore-Q纯化水；然后向 Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟，即可。
为避免RNA酶污染及保护操作者，进行下述操作时，操作者必须带口罩和一次性手套。
实施例3 配置PCR扩增反应体系
20μL荧光RT-PCR反应液和1.0 μL 酶混合物加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，取20μL作为检测试剂；将检测试剂装入PCR管中，然后再加入5ul模板RNA，最终配成25ul的反应体系（1头份）。
（1）荧光RT-PCR反应液（1头份，20μL）
；
10×PCR缓冲液、25mmol/L MgCl2购于Promega 公司；5×RT-缓冲液，10mmol/LdNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成。其中10×PCR缓冲液的有效成分为：500mmol/L KCl 、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0%Triton X-100。5×RT-缓冲液有效成分为375 mmol/L KCl、15mmol/L MgCl2、50mmol/L DTT、250 mmol/L Tris-HCl（pH8.3，25℃）。所述DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水, 得 Millipore-Q纯化水；然后向 Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2 (1.034×105Pa) 高压蒸汽灭菌15分钟，即可。
（2）酶混合物：由200 U/μL的M-MLV反转录酶、5 U/μL的Taq DNA 聚合酶、40 U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
实施例4 荧光定量RT-PCR
荧光定量PCR的反应参数如下设置：
第一阶段： 反转录，42℃/30 min；
第二阶段：预变性，92℃/3 min；
第三阶段：预扩增，92℃ 15sec，45℃ 30sec，72℃ 60sec；
第四阶段：92℃ 10sec，52℃ 15sec，60℃ 30sec，40个循环，在第四阶段每次循环的60 ℃退火延伸时收集荧光。
结果读取：对于多通道PCR仪，利用FAM（465-510）通道、HEX（VIC）（533-580）和CY5（618-660）通道读取结果；
阴性：三个检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒；
单阳性：如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而HEX/VIC检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在新城疫病毒；
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而FAM检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型；
如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线，且Cp/Ct值≤30.0，而FAM检测通道和HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线，表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒；
双阳性：如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型；
如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒；
如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线，且Ct/Cp值均≤30.0，表示样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒；
上述检测方法，阴性对照（用SPF鸡的肝脏作为阴性对照）用三个检测通道读取数据时，应均无Ct/Cp值并且无扩增曲线；
阳性对照用三个检测通道读取数据时，应出现三条相应的特征性扩增曲线，且Ct/Cp值均应小于等于28；如阴性或阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。
上述检测方法，任一通道Ct/Cp值大于30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验；复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
实施例5 可行性实验
以新城疫病毒Lasota株（Lasota株是指疫苗株）感染尿囊液为样本，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行荧光定量PCR；结果为：FAM检测通道Ct/Cp值均≤30.0，且出现典型的扩增曲线，而HEX/VIC、CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
以禽流感病毒H9亚型感染尿囊液为样本，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行荧光定量PCR；结果为：HEX/VIC检测通道Ct/Cp值均≤30.0，且出现典型的扩增曲线，而FAM、CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
以鸡传染性支气管炎病毒感染尿囊液为样本，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行荧光定量PCR；结果为：CY5检测通道Ct/Cp值均≤30.0，且出现典型的扩增曲线，而FAM、HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
说明，实施例3的检测试剂能够用于检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性支气管炎病毒，且能将三者区分开来。
实施例6 特异性实验
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以新城疫病毒Lasota株为阳性对照，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR；结果为：HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反应， FAM检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过FAM检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果，见图4，表明特异性良好。
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以禽流感病毒H9亚型为阳性对照，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR；结果为：FAM检测通道和CY5检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反应， HEX/VIC检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过HEX/VIC检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果，见图5，表明特异性良好。
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本，以鸡传染性支气管炎病毒H52株为阳性对照，采用实施例2的方法提取RNA为模板，按照实施例3的方法配置反应体系，按照实施例4的方法进行PCR；结果为：FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均无Ct/Cp值，且无特征性扩增曲线；均无交叉反应，CY5检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线，底部直线为通过CY5检测通道读取上述其他病毒（样本）的检测结果，见图6，表明特异性良好。
序列表
<110> 山东省动物疫病预防与控制中心
北京森康生物技术开发有限公司
<120> NDV/H9-AIV/IBV三重荧光PCR检测试剂
<130> 2016101458035
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 1
tatgrtgrta acwtgcaaga agag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 2
gctttcacrt gcttvactg 19
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
tagtgcaggc acc 13
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 4
atggggtttg ctgcc 15
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 5
aattatatac aaatgttgca yctg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 6
ttctgggcya tgtcyaaygg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 7
ctatcgccag ggaaatgtc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 8
gcgtcctagt gctgtaccc 19
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 9
cctggaaacg aacggtagac cct 23

Claims (6)

1.一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，含有以下引物：
NDV-F：5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’，
NDV-R：5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’，
NDV-P：5’FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA-3’，
H9-F：5’ATGGGGTTTGCTGCC3’，
H9-R：5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’，
H9-P：5’HEX-TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’，
IBV-F：5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’，
IBV-R：5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’，
IBV-P：5’CY5-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-BHQ2-3’，
其中，NDV-P：5’FAM-TA+G TG+C AG+G CA+C C-TAMRA-3’中“+”后面的碱基代表LNA修饰。
2.根据权利要求1所述的三重荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于，由荧光RT-PCR反应液和酶混合物按照20:1的体积比组成；
所述荧光RT-PCR反应液的组成：
10μmol/L的NDV-F：1μL，
10μmol/L的NDV-R：1μL，
10μmol/L的NDV-P：0.5μL，
10μmol/L的H9-F：1.2μL，
10μmol/L的H9-R：1.2μL，
10μmol/L的H9-P：1μL，
10μmol/L的IBV-F：1μL，
10μmol/L的IBV-R：1μL，
10μmol/L的IBV-P：0.5μL，
5×RT缓冲液：3.75μL，
10×PCR缓冲液：1.875μL，
25mmol/L的MgCl2：2.125μL，
10mmol/L的dNTP：2μL，
DEPC处理水：1.85μL；
所述酶混合物：由200U/μL的M-MLV反转录酶、5U/μL的Taq DNA聚合酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
3.一种含有权利要求1所述三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
4.一种含有权利要求2所述三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还含有阴性对照、阳性对照；
所述阴性对照：正常SPF鸡的肝脏，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐水制成20％悬液，70℃作用1小时；
所述阳性对照：为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2、鸡传染性支气管炎病毒H52株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体积比混合而成。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，由提取试剂盒和检测试剂盒组成：
所述提取试剂盒的组成如下：
组成 量 Buffer A 25mL×1瓶 Buffer B 60mL×1瓶 Buffer C 1250μL×2管 RNase-Free吸附柱和收集管 50套
Buffer A为裂解液，含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt％十二烷基肌氨酸钠、4.5wt％氯化钠、30％乙醇v/v；
Buffer B为洗液，含有10mmol/L Tris-HCI、1mmol/LEDTA、70％乙醇v/v；
Buffer C为溶解液，为DEPC处理水；
所述检测试剂盒的组成如下：
荧光RT-PCR反应液 1000μL×1管 酶混合物 50μL×1管 DEPC处理水 1mL×1管 阳性对照 1mL×1管 阴性对照 1mL×1管
。
CN201610145803.5A 2016-03-15 2016-03-15 Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂 Expired - Fee Related CN105671204B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610145803.5A CN105671204B (zh) 2016-03-15 2016-03-15 Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610145803.5A CN105671204B (zh) 2016-03-15 2016-03-15 Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105671204A CN105671204A (zh) 2016-06-15
CN105671204B true CN105671204B (zh) 2019-07-02

Family

ID=56310411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610145803.5A Expired - Fee Related CN105671204B (zh) 2016-03-15 2016-03-15 Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105671204B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106191312B (zh) * 2016-07-19 2018-05-04 广东省实验动物监测所 一种快速区分aiv、ndv、mg和ms的多重荧光免疫分析方法及试剂
CN106086241B (zh) * 2016-07-19 2018-05-25 广东省实验动物监测所 一种快速区分4种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析的引物、试剂盒及方法
CN106191319B (zh) * 2016-07-27 2018-07-06 广东省实验动物监测所 一种快速区分6种禽呼吸道病原的多重荧光免疫分析方法
CN106435030B (zh) * 2016-11-10 2019-12-31 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN108085413B (zh) * 2017-12-06 2021-09-21 南京农业大学 一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用
CN108624716B (zh) * 2018-05-18 2021-08-24 南京农业大学 一种同时检测七种水禽易感病毒的七重pcr引物组及其检测方法
CN108977582B (zh) * 2018-08-20 2019-08-09 中国动物卫生与流行病学中心 一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN109554504A (zh) * 2018-12-20 2019-04-02 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种鸡传染性支气管炎病毒含量的测定方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659952A (zh) * 2009-07-14 2010-03-03 上海之江生物科技有限公司 锁核酸和小沟结合物共修饰核酸片段
CN102851392A (zh) * 2012-07-20 2013-01-02 宁波检验检疫科学技术研究院 动物疫病三色荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
CN104531901A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 四川圣迪乐村生态食品股份有限公司 一种同时检测禽4种呼吸道疾病病原的pcr检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659952A (zh) * 2009-07-14 2010-03-03 上海之江生物科技有限公司 锁核酸和小沟结合物共修饰核酸片段
CN102851392A (zh) * 2012-07-20 2013-01-02 宁波检验检疫科学技术研究院 动物疫病三色荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
CN104531901A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 四川圣迪乐村生态食品股份有限公司 一种同时检测禽4种呼吸道疾病病原的pcr检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一步法多重RT―PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究;赵建梅 等;《中国动物检疫》;20030101;第20卷(第01期);第22-23页
一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用;吕长荣 等;《西北农林科技大学学报(自然科学版)》;20070425;第35卷(第04期);第63-66页
基于M基因的新城疫病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对临床样品中新城疫病毒检测的研究;曹军平 等;《畜牧兽医学报》;20090715;第40卷(第07期);第1120-1125页
禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增;张文慧 等;《江苏农业科学》;20081215(第06期);第60-61页

Also Published As

Publication number Publication date
CN105671204A (zh) 2016-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105671204B (zh) Ndv/h9-aiv/ibv三重荧光pcr检测试剂
CN111254228B (zh) 一种检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒
EP4012050A1 (en) Composition, kit and method for detecting and typing viruses causing respiratory tract infection and application of composition, kit and method
WO2005121367A1 (en) Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
CN113881812B (zh) 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
JP7064473B2 (ja) インフルエンザａウイルスおよびインフルエンザｂウイルスを検出する方法
CN106884012B (zh) 用于检测6种呼吸道病毒的lamp引物组合及其应用
Nakauchi et al. Real-time RT-PCR assays for discriminating influenza B virus Yamagata and Victoria lineages
CN104232798A (zh) 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒
CN114369688A (zh) 检测SARS-CoV-2奥密克戎变异株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN105441586A (zh) 一种a型h5n6亚型禽流感病毒双通道实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法
US20230203603A1 (en) Rt-pcr detection reagent for detecting novel coronavirus, kit and detection method thereof
CN110343784A (zh) 基于熔解曲线的四重流感病毒核酸检测的组合物及试剂盒
CN110656163A (zh) 一种双标记报告荧光多重病原体核酸检测方法
Steyer et al. A diagnostic method based on MGB probes for rapid detection and simultaneous differentiation between virulent and vaccine strains of avian paramyxovirus type 1
CN102586487B (zh) 鸭i型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN116024386B (zh) 用于检测新型冠状病毒及区分Omicron不同突变株的引物探针组合和试剂盒
EP2499264B1 (en) Oligonucleotides and process for detection of swine flu virus
WO2006132601A1 (en) Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
CN105525038A (zh) 新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光rt-pcr检测试剂盒
CN104073571B (zh) H7n9亚型禽流感病毒双重荧光rt-pcr引物、探针及其检测试剂盒和检测方法
CN104278106B (zh) 鸭坦布苏病毒和减蛋综合症病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN109913589B (zh) 一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN111647683A (zh) 一种新冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及其应用
CN112011644A (zh) 甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190702

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee