CN109554504A - 一种鸡传染性支气管炎病毒含量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎病毒含量的检测方法，该方法使用荧光定量PCR法来检测病毒的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线来确定鸡胚的感染情况判定EID50。本方法可针对鸡胚被感染后无临床症状或症状不明显的病毒进行定量检测，克服了传统EID50无法准确客观测定不能引起临床病变的病毒含量的不足。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒含量的测定方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及兽用病毒含量检测领域。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性、病毒性呼吸道传染病，它可以侵害肾脏和泌尿生殖系统，引起雏鸡死亡，还可使感染鸡生长受阻，产蛋量和蛋品质下降，死淘率增加，给养禽业造成严重的经济损失。
目前，疫苗免疫是防治IB的主要方法。在兽用生物制品生产中,常用病毒半数感染量(EID50)来表示病毒类疫苗及其半成品抗原的效价，在实际生产过程中，疫苗生产厂家也常用EID50来衡量活疫苗的活性，并用于定期对产品进行质检，或者出场检验。EID50测定过程中的关键技术在于，如何快速、有效、准确的确定受试胚胎是否被病毒感染。传统的EID50测定是通过观察胚胎病变和称重来确定感染与否，由于受试胚胎存在个体差异，加之实验人员的评判带有主观性，尤其是在测定病毒感染的临界值时，传统的EID50测定方法更加难以保证测试结果的准确性和客观性。除此之外，绝大多数IBV灭活疫苗及部分血清型的IBV感染鸡胚后，存在不能引起鸡胚病变或病变不明显的现象，根本不能利用传统的EID50测定方法来完成病毒定量和疫苗质检的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能通过病毒半数感染量(EID50)来快速、准确、客观测定IBV含量的方法。
本发明的目的还在于提供一种在(EID50)测定过程中，由于病毒特定的理化特性导致被感染胚胎无症状或症状不明显时，如何确定其是否被感染的方法。
本发明技术方案的优点在于：特异性强，灵敏度高，检测时间短，测试结果客观合理可信度高。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)含量测定方法，具体包含如下实验步骤：
1)10倍系列稀释IBV，将不同稀释倍数的IBV分别接种10～11日龄鸡胚；
2)将接种后的鸡胚正常孵育48-60h，分别收获尿囊液并提取RNA；
3)用荧光定量PCR法测定RNA中IBV的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线判定各受试鸡胚的IBV感染情况；
4)根据受试鸡胚的感染情况，计算EID50。
进一步的，所述的荧光定量PCR的标准曲线是通过以下步骤制备的：
1)利用IBV国标引物对M基因进行PCR扩增并进行测序验证；
2)将测序验证无误的M基因克隆至原核载体构建成质粒；
3)将上述质粒进行体外反转录制备获得标准RNA；
4)10倍系列稀释标准RNA并以之作为模板进行荧光定量PCR反应，以模板的浓度和Ct值，绘制出荧光定量标准曲线。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的反应参数为：反转录反应：42℃5min，95℃，10s，1循环；PCR反应：95℃，5s，60℃，20S，40个循环，末点收集荧光信号。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的引物和探针为：
引物：M-N-F：5’-ATGTCTTTAGGCAAGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.1)
M-N-R：5’-GAATCTAACGCCGTAGGTTCAATA-3’(SEQ ID NO.2)
荧光探针：5’-GCAAGCCACTGACCCTCACAATAAAGA-3’(SEQ ID NO.3)
荧光探针的5’端标记为荧光报告基团FAM，3’端标记为荧光报告基团为TAMRA。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV感染鸡胚后无明显的临床症状。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV为天津渤海农牧产业联合研究院有限公司提供的IBV 4/91株。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的鸡胚为SPF鸡胚。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的10倍系列稀释IBV是指将IBV进行104、105、106、107、108、109倍稀释。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的接种是指给每只鸡胚注射0.1mL稀释好的不同浓度的IBV。
进一步的，所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的原核载体是pMD18-T载体。
采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：
1.本发明提供了一种新的EID50的检测方法，通过荧光定量PCR技术与EID50相结合的方式，克服了传统EID50不能对未发病或者症状不明显的感染鸡胚进行准确定量的问题。
2.本发明只检测活毒不被死毒干扰，更适合活疫苗质检。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：荧光定量PCR标准曲线的建立
提取IBV的RNA，利用IBV外引物进行RT-PCR扩增，获得目的基因，按琼脂糖凝胶回收试剂盒说明进行PCR产物回收，将其克隆至pMD18-T载体，构建质粒。
外引物：M-W-F：5’-CCTTTTCTTATTTCCGCTTTGG-3’；
M-W-R：5’-ACACAGGAGGTCTTGTCGCAG-3’。
按照体外转录试剂盒(Invitrogen)说明书操作将质粒反转录成RNA，命名为S-RNA，小量分装后-80℃保存备用。
将S-RNA进行定量，按照拷贝数计算公式将其换算为拷贝数(拷贝/uL，换算公式为拷贝数＝6.02×1023(拷贝/mol×浓度(g/uL)/质量分数(g/mol))，将其做10倍系列稀释，取浓度为3.5×101-3.5×107拷贝/uL作为标准品。
以浓度为3.5×101-3.5×107拷贝/uL标准品为模板，进行荧光定量PCR的反应，反应体系见表1。参数为(步骤1反转录反应：42℃5min，95℃，10s，1个循环，步骤2PCR反应：95℃，5s，60℃，20S，40个循环，末点收集荧光信号)。根据标准品的浓度和Ct值，仪器软件自动绘制出荧光定量标准曲线和相关系数R2(R2＝0.9986)。反应所用的引物和探针为：
引物：M-N-F：5’-ATGTCTTTAGGCAAGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.1)；
M-N-R：5’-GAATCTAACGCCGTAGGTTCAATA-3’(SEQ ID NO.2)；
荧光探针：5’-GCAAGCCACTGACCCTCACAATAAAGA-3’(-SEQ ID NO.3)；
荧光探针的5’端标记为荧光报告基团FAM，3’端标记为荧光报告基团为TAMRA。
表1.荧光定量PCR反应体系
试剂 使用量
2×One Step RT-PCR Buffer III 10μl
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl) 0.4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4μl
PCR Forward Primer(10μM) 0.4μl
PCR Reverse Primer(1OμM) 0.4μl
Probe 0.8μl
ROX Reference Dye or Dye II(50×)<sup>＊3</sup> 0.4μl
Total RNA 2μl
RNase Free dH<sub>2</sub>O 5.2μl
Total 20μl<sup>＊5</sup>
2.IBV病毒含量的判定；
1)病毒的增殖：鸡传染性支气管病毒来源于天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，4/91型，命名为4/91株IBV。
将4/91株IBV做100～1000倍稀释，通过鸡胚尿囊腔方式接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL。弃去24h非特异死亡胚，收获24h-48h死胚或活胚尿囊液，命名为IBV-E1。按照同样方法繁2代毒，分别命名为IBV-E2和IBV-E3。
2)分别将IBV-E1、IBV-E2和IBV-E3做10-5、10-6、10-7和10-8倍稀释，然后接种10～11日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，每个稀释度接种5枚胚，同时设5枚胚不接种病毒作为对照。
3)将B中接种的鸡胚置于37℃孵育48-60h；
4)收获尿囊液，提取RNA；
5)利用一步法荧光定量PCR试剂盒(TAKARA，RR064A，TaqMan探针检测)；
以标准品最低浓度对应的Ct值及其扩增曲线作为判定依据，当待测样品荧光信号超过阈值且Ct值≤35.0，则判定待测样品中含有IBV，检测结果为阳性，标记为“+”，否则样品中无IBV，检测结果为阴性，标记为“-”。结果见表2。
表2 3批IBV病毒含量测定结果
3.荧光定量PCR的特异性、灵敏性和重复性检测
(1)特异性检测
分别以H9亚型禽流感(H9AIV)、鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、腺病毒(FAV)、禽呼肠孤病毒(REOV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、禽网内病毒(REV)作为模板进行荧光定量PCR扩增，扩增结果均为阴性，证明该方法特异性强。
(2)灵敏性检测
将标准品做不同倍数稀释，利用建立的荧光定量PCR方法进行检测，同时以普通PCR检测作为对比。结果发现本发明的方法能够检测101个拷贝的标准品，而普通PCR只能检测到103个拷贝数的标准品，证明该方法灵敏度高。
(3)重复性检测
取4个稀释度的标准品分别做3个组内和组间重复试验，统计结果显示组内和组间变异系数均小于1％，证明重复性高。

Claims (10)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)含量测定方法，具体包含如下实验步骤：
1)10倍系列稀释IBV，将不同稀释倍数的IBV分别接种10～11日龄鸡胚；
2)将接种后的鸡胚继续孵育48-60h，分别收获尿囊液并提取RNA；
3)用荧光定量PCR法测定RNA中IBV的含量，并结合荧光定量PCR的标准曲线判定各受试鸡胚的IBV感染情况；
4)根据受试鸡胚的感染情况，计算EID50。
2.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的标准曲线是通过以下步骤制备的：
1)利用IBV国标引物对M基因进行PCR扩增并进行测序验证；
2)将测序验证无误的M基因克隆至原核载体构建成质粒；
3)将上述质粒进行体外反转录制备获得标准RNA；
4)10倍系列稀释标准RNA并以之作为模板进行荧光定量PCR反应，以模板的浓度和Ct值，绘制出荧光定量标准曲线。
3.根据权利要求1或2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的反应参数为：
反转录反应：42℃5min，95℃，10s，1循环；
PCR反应：95℃，5s，60℃，20S，40个循环，末点收集荧光信号。
4.根据权利要求1或2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的荧光定量PCR的引物和探针为：
引物：M-N-F：5’-ATGTCTTTAGGCAAGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.1)
M-N-R：5’-GAATCTAACGCCGTAGGTTCAATA-3’(SEQ ID NO.2)
荧光探针：5’-GCAAGCCACTGACCCTCACAATAAAGA-3’(SEQ ID NO.3)
荧光探针的5’端标记为荧光报告基团FAM，3’端标记为荧光报告基团为TAMRA。
5.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV感染鸡胚后无明显的临床症状。
6.根据权利要求1或5中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的IBV为天津渤海农牧产业联合研究院有限公司提供的IBV 4/91株。
7.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的鸡胚为SPF鸡胚。
8.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的10倍系列稀释IBV是指将IBV进行104、105、106、107、108、109倍稀释。
9.根据权利要求1中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的接种是指给每只鸡胚注射0.1ml稀释好的不同浓度的IBV。
10.根据权利要求2中所述的IBV含量测定方法，其特征在于所述的原核载体是pMD18-T载体。
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