CN105671204A - 新城疫病毒/禽流感病毒h9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量检测试剂及检测方法 - Google Patents
新城疫病毒/禽流感病毒h9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量检测试剂及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法,属于动物检疫技术领域。本发明分别选择新城疫病毒M基因编码区特定序列、禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列、鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上,进引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右,GC含量为50%—60%,引物内无二级结构和重复性,引物间和引物内无互补序列,引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用,探针的长度仅为13个碱基,采用LAN修饰,以提高其Tm值;其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右,Tm值比引物Tm值高5℃左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法,属于动物检疫技术领域。
背景技术
新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎是危害养禽业的重要传染病,属于急性高度接触性呼吸道传染病。新城疫是纳入养禽场日常免疫程序的防控传染病,虽然疫苗覆盖范围广,但是由于种种原因,新城疫疫情时常发生,只不过死亡率比不用疫苗来说大幅降低。禽流感H9亚型对养禽业的影响较大,疫苗使用较普遍,但是由于禽流感H9亚型毒株变异快,经常出现新的变异株,导致禽类发病。鸡传染性支气管炎也具有很强的变异性,常规疫苗保护率不高,禽群感染发病的情况时有发生。在鸡场使用疫苗的前提下,这三种传染病发生导致鸡的死亡率一般都在30%以内,由于这三种传染病都属于呼吸道传染病,临床症状相似,仅凭肉眼很难区分。再者临床上经常出现两种传染病混合感染情况,给疫病的诊断带来困难。
实验室传统的诊断新城疫、禽流感和鸡传染性支气管炎的方法为鸡胚病毒分离鉴定,该方法耗时长,需要在一定安全级别的实验室内进行。当出现两种以上传染病混合感染时,鸡胚病毒分离鉴定更为困难,一种病毒的增殖会掩盖另一种病毒的增殖,最后往往只能鉴定出一种病毒,忽略了其它病毒的存在,造成发生疾病的误诊,给防治工作带来难度。
随着分子生物学技术的发展,一批核酸检测技术如普通RT-PCR和荧光RT-PCR应用到新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎检测诊断工作中,特别是荧光RT-PCR技术以敏感、特异、耗时短受到广大科研和检测技术人员的青睐,对于混合感染的禽群,也很容易用该方法检出,真正做到了早发现、早确诊。国内外报道单一荧光RT-PCR方法较多,将新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒同时检测的三重荧光RT-PCR技术还未见报道。
发明内容
本发明的目的是建立同时检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法,为快速鉴别这三种病毒提供技术支撑。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂,含有以下引物:
NDV-F:5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’,如SEQIDNO.1所示,
NDV-R为:5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’,如SEQIDNO.2所示,
NDV-P:5'FAM-TA+GTG+CAG+GCA+CC-TAMRA3',如SEQIDNO.3所示,
H9-F:5’ATGGGGTTTGCTGCC3’,如SEQIDNO.4所示,
H9-R:5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’,如SEQIDNO.5所示,
H9-P:5’HEX-TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’,如SEQIDNO.6所示,
IBV-F:5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’,如SEQIDNO.7所示,
IBV-R:5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’,如SEQIDNO.8所示,
IBV-P:5’CY5-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-BHQ2-3’,如SEQIDNO.9所示,
其中,NDV-P:5'FAM-TA+GTG+CAG+GCA+CC-TAMRA3'中“+”后面的碱基代表LNA修饰。
一种上述新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂,由荧光RT-PCR反应液和酶混合物按照20:1的体积比组成;
所述荧光RT-PCR反应液的组成:
10μmol/L的NDV-F:1μl,
10μmol/L的NDV-R:1μl,
10μmol/L的NDV-P:0.5μl,
10μmol/L的H9-F:1.2μl,
10μmol/L的H9-R:1.2μl,
10μmol/L的H9-P:1μl,
10μmol/L的IBV-F:1μl,
10μmol/L的IBV-R:1μl,
10μmol/L的IBV-P:0.5μl,
5×RT缓冲液:3.75μl,
10×PCR缓冲液:1.875μl,
25mmol/L的MgCl2:2.125μl,
10mmol/L的dNTP:2μl,
DEPC处理水:1.85μl;
所述酶混合物:由200U/μL的M-MLV反转录酶、5U/μL的TaqDNA聚合酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
所述DEPC处理水:自来水两次蒸馏,经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化,收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水,得Millipore-Q纯化水;然后向Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%,37℃搅拌处理12hr,15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟,即可。
一种含有上述新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
上述试剂盒,还含有阴性对照、阳性对照;
所述阴性对照:正常SPF鸡的肝脏,用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐水制成20%悬液,70℃作用1小时;
所述阳性对照:为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2(A/chicken/Shandong/96【H9N2】)、鸡传染性支气管炎病毒H52株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体积比混合而成。
上述试剂盒,由提取试剂盒和检测试剂盒组成:
所述提取试剂盒的组成如下:
BufferA为裂解液,含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、30%(v/v)乙醇。
BufferB为洗液,含有10mmol/LTris-HCI、1mmol/LEDTA、70%(v/v)乙醇。
BufferC为溶解液,主要由DEPC水组成;
所述检测试剂盒的组成如下:
。
一种新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法,
取待测样品的核酸5ul与20ul本发明的上述检测试剂配成25ul的反应体系,或者,
取待测样品的核酸5ul置于本发明的上述试剂盒中;
然后进行荧光定量RT-PCR反应,读取结果;
所述荧光定量PCR反应:
第一阶段:反转录,42℃/30min;
第二阶段:预变性,92℃/3min;
第三阶段:预扩增,92℃15sec,45℃30sec,72℃60sec;
第四阶段:92℃10sec,52℃15sec,60℃30sec,40个循环,在第,四阶段每次循环的60℃退火延伸时收集荧光;
所述读取结果:
如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有新城疫病毒;
如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有禽流感病毒H9亚型;
如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有鸡传染性支气管炎病毒。
上述检测方法,利用FAM(465-510)通道、HEX(VIC)(533-580)和CY5(618-660)通道读取结果;
阴性结果:三个检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线,表明样品中无新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒;
单阳性结果:
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而HEX/VIC检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在新城疫病毒;
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型;
如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒;
双阳性结果:
如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型;
如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;
如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。
上述检测方法,
阴性对照用三个检测通道读取数据时,应均无Ct/Cp值并且无扩增曲线;
阳性对照用三个检测通道读取数据时,应出现三条相应的特征性扩增曲线,且Ct/Cp值均应小于等于28。
如阴性或阳性对的检测结果照不满足以上条件,此次实验视为无效。
上述检测方法,任一通道Ct/Cp值大于30.0,且出现典型的扩增曲线的样品建议复验;复验仍出现上述结果的,判为阳性,否则判为阴性。
本发明选择新城疫病毒M基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上,进行新城疫病毒通用引物和探针设计;选择禽流感病毒H9亚型H基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上,进行禽流感病毒H9亚型引物和探针设计;选择鸡传染性支气管炎病毒M基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上,进行鸡传染性支气管炎病毒引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右,GC含量为50%—60%,引物内无二级结构和重复性,引物间和引物内无互补序列,引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。为保证新城疫病毒探针的通用,探针的长度仅为13个碱基,采用LAN修饰,以提高其Tm值;其它两种病毒探针的长度在25个碱基左右,Tm值比引物Tm值高5℃左右。
新城疫病毒通用探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素),3’端标记淬灭基团TAMRA;禽流感病毒H9亚型探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX(5-hexachloro-荧光素),3’端标记淬灭荧光基团BHQ1;鸡传染性支气管炎病毒探针序列的5’端标记报告荧光基团CY5,3’端标记淬灭荧光基团BHQ2。
采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒,对反应的各种条件进行了优化,其中包括引物探针的筛选,Mg2+使用浓度的优化,引物探针浓度的优化,以减少相互间的干扰,达到对三种病毒模板在相同条件下同时扩增的效果。三重荧光RT-PCR检测技术与单个相比,不仅节省了时间,一次试验又能同时检测三种病毒。本发明就是利用三重荧光RT-PCR的优点,建立同时检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法,为快速鉴别检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒提供一种简便方法。
本发明通过实验证明,本发明提供的检测试剂、检测试剂盒及检测方法,可以一步法确认待检样品中是否存在新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。本发明的检测试剂、试剂盒不仅适用于禽类组织样本中新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的检测,还可适用于禽类咽喉/泄殖腔拭子中新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的快速筛查。
本发明的优点是:本发明选择新城疫病毒M基因、禽流感病毒H9亚型的H基因和鸡传染性支气管炎病毒M基因作为靶序列,分别设计引物和探针建立并优化了新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂、试剂盒,取得了优异的技术效果:
1)快速:该方法对PCR产物进行实时监控,RT-PCR结束即可获得结果,且较单重荧光RT-PCR检测方法省时,具有快速、一步即可鉴别的优势。
2)灵敏:由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪,使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100~1000倍;对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示,试剂盒的灵敏度可达100拷贝/反应。
3)特异:由于不仅采用了特异性的引物,而且采用了特异性的探针,使该方法的特异性高于普通RT-PCR方法;用新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法检测禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒病毒等,均无交叉反应,表明特异性良好。
4)稳定:重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好;对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验,变异系数小于5%。
5)不易污染:全封闭反应,无需PCR后处理,操作安全。
附图说明
图1,以新城疫病毒Lasota株感染尿囊液为样本的检测结果;曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后,FAM检测通道扩增曲线;
图2,以禽流感病毒H9亚型感染尿囊液为样本的检测结果;曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后,HEX检测通道扩增曲线;
图3,以鸡传染性支气管炎病毒H52感染尿囊液为样本的检测结果;曲线A-F依次为样本进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释后,CY5检测通道扩增曲线;
图4,以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以新城疫病毒Lasota株为阳性对照,检测结果;“S”型曲线为通过FAM检测通道读取的阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过FAM检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果;
图5,以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以禽流感病毒H9亚型为阳性对照,检测结果;“S”型曲线为通过HEX检测通道读取的阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过HEX检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果;
图6,以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以鸡传染性支气管炎病毒H52株为阳性对照,检测结果;“S”型曲线为通过CY5检测通道读取的阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过CY5检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1引物、探针的设计
根据Genbank登录的已发表的新城疫病毒M基因序列(Genbank登录号AP014968.1),禽流感病毒H9亚型H基因序列(Genbank登录号KP417167.1),鸡传染性支气管炎病毒M基因序列(Genbank登录号KJ435285.1)设计新城疫病毒通用引物、探针,禽流感病毒H9亚型引物、探针和鸡传染性支气管炎病毒引物、探针。新城疫病毒通用探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carboxy-荧光素),3’端标记淬灭基团TAMRA;禽流感病毒H9亚型探针序列的5’端标记报告荧光基团HEX(5-hexachloro-荧光素),3’端标记淬灭荧光基团BHQ1;鸡传染性支气管炎病毒探针序列的5’端标记荧光报告基团CY5,3’端标记淬灭荧光基团BHQ2。通过分析实验,得到以下引物、探针:
新城疫-上游引物:5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’,如SEQIDNO.1所示,
新城疫-下游引物:5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’,如SEQIDNO.2所示,
新城疫-探针:5'[FAM]-TA+GTG+CAG+GCA+CC-[TAMRA]3'(+后面碱基代表LNA修饰;LNA即锁核酸,修饰的目的提高探针的Tm值);如SEQIDNO.3所示,
禽流感病毒H9-上游引物:5’ATGGGGTTTGCTGCC3’,如SEQIDNO.4所示,
禽流感病毒H9-下游引物:5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’,如SEQIDNO.5所示,
禽流感病毒H9-探针:[HEX]-TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-[BHQ1]-3’;如SEQIDNO.6所示,
鸡传染性支气管炎-上游引物:5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’,如SEQIDNO.7所示,
鸡传染性支气管炎-下游引物:5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’,如SEQIDNO.8所示,
鸡传染性支气管炎-探针:5’CY5-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-[BHQ2]-3’,如SEQIDNO.9所示。
实施例2柱式提取操作方法提取RNA
1、取灭菌的1.5mL离心管,加入BufferA500mL、样本(待测样本及阴阳性对照样本)各200mL,充分混匀,室温放置10分钟;
2、取与离心管等量的RNase-Free吸附柱;将离心管中的溶液和絮状沉淀转移至Rnase-Free吸附柱,吸附柱套上收集管(为避免堵塞吸附柱,尽量不要吸悬浮杂质(样本中的杂质);13000转室温离心30秒;弃去收集管液体,将吸附柱放回收集管中;
3、吸附柱内加入600uLBufferB,13000转离心30秒;弃去收集管液体,将吸附柱放回收集管中;
4、重复步骤3;13000转空柱离心2分钟,去除残留液;
5、将吸附柱移入新的1.5mL离心管中,向柱中央加入50uLBufferC,室温静置1分钟,13000转离心30秒,离心管中液体即为模板RNA。
获得的RNA溶液,冰上保存备用(注意提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存须放置-70℃冰箱,但应避免反复冻融);
BufferA为裂解液,含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、30%(V/V)乙醇;
BufferB为洗液,含有10mmol/LTris-HCI、1mMEDTA、70%(V/V)乙醇;
BufferC为溶解液,主要由DEPC水组成;
所述DEPC水:自来水两次蒸馏,经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化,收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水,得Millipore-Q纯化水;然后向Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%,37℃搅拌处理12hr,15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟,即可。
为避免RNA酶污染及保护操作者,进行下述操作时,操作者必须带口罩和一次性手套。
实施例3配置PCR扩增反应体系
20μL荧光RT-PCR反应液和1.0μL酶混合物加入一适当体积小管中,充分混合均匀后,取20μL作为检测试剂;将检测试剂装入PCR管中,然后再加入5ul模板RNA,最终配成25ul的反应体系(1头份)。
(1)荧光RT-PCR反应液(1头份,20μL)
;
10×PCR缓冲液、25mmol/LMgCl2购于Promega公司;5×RT-缓冲液,10mmol/LdNTP购自大连宝生物生物工程有限公司,引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成。其中10×PCR缓冲液的有效成分为:500mmol/LKCl、100mmol/LTris-HCl(pH9.0,25℃)、1.0%TritonX-100。5×RT-缓冲液有效成分为375mmol/LKCl、15mmol/LMgCl2、50mmol/LDTT、250mmol/LTris-HCl(pH8.3,25℃)。所述DEPC水:自来水两次蒸馏,经过MilliporeMILLI-QPFPLUS纯水仪纯化,收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水,得Millipore-Q纯化水;然后向Millipore-Q纯化水中加入DEPC至终浓度为0.1%,37℃搅拌处理12hr,15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟,即可。
(2)酶混合物:由200U/μL的M-MLV反转录酶、5U/μL的TaqDNA聚合酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
实施例4荧光定量RT-PCR
荧光定量PCR的反应参数如下设置:
第一阶段:反转录,42℃/30min;
第二阶段:预变性,92℃/3min;
第三阶段:预扩增,92℃15sec,45℃30sec,72℃60sec;
第四阶段:92℃10sec,52℃15sec,60℃30sec,40个循环,在第四阶段每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。
结果读取:对于多通道PCR仪,利用FAM(465-510)通道、HEX(VIC)(533-580)和CY5(618-660)通道读取结果;
阴性:三个检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线,表明样品中无新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒;
单阳性:如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而HEX/VIC检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在新城疫病毒;
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型;
如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒;
双阳性:如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型;
如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;
如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒;
上述检测方法,阴性对照(用SPF鸡的肝脏作为阴性对照)用三个检测通道读取数据时,应均无Ct/Cp值并且无扩增曲线;
阳性对照用三个检测通道读取数据时,应出现三条相应的特征性扩增曲线,且Ct/Cp值均应小于等于28;如阴性或阳性对照不满足以上条件,此次实验视为无效。
上述检测方法,任一通道Ct/Cp值大于30.0,且出现典型的扩增曲线的样品建议复验;复验仍出现上述结果的,判为阳性,否则判为阴性。
实施例5可行性实验
以新城疫病毒Lasota株(Lasota株是指疫苗株)感染尿囊液为样本,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行荧光定量PCR;结果为:FAM检测通道Ct/Cp值均≤30.0,且出现典型的扩增曲线,而HEX/VIC、CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
以禽流感病毒H9亚型感染尿囊液为样本,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行荧光定量PCR;结果为:HEX/VIC检测通道Ct/Cp值均≤30.0,且出现典型的扩增曲线,而FAM、CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
以鸡传染性支气管炎病毒感染尿囊液为样本,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行荧光定量PCR;结果为:CY5检测通道Ct/Cp值均≤30.0,且出现典型的扩增曲线,而FAM、HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线。
说明,实施例3的检测试剂能够用于检测新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型、鸡传染性支气管炎病毒,且能将三者区分开来。
实施例6特异性实验
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以新城疫病毒Lasota株为阳性对照,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行PCR;结果为:HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线;均无交叉反应,FAM检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过FAM检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果,见图4,表明特异性良好。
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以禽流感病毒H9亚型为阳性对照,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行PCR;结果为:FAM检测通道和CY5检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线;均无交叉反应,HEX/VIC检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过HEX/VIC检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果,见图5,表明特异性良好。
分别以禽流感病毒H7、H5亚型、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、禽网状内皮组织增生病毒为样本,以鸡传染性支气管炎病毒H52株为阳性对照,采用实施例2的方法提取RNA为模板,按照实施例3的方法配置反应体系,按照实施例4的方法进行PCR;结果为:FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线;均无交叉反应,CY5检测通道出现“S”型曲线为阳性对照的扩增曲线,底部直线为通过CY5检测通道读取上述其他病毒(样本)的检测结果,见图6,表明特异性良好。
<110>山东省动物疫病预防与控制中心、北京森康生物技术开发有限公司
<120>新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂及检测方法
<160>9
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cctggaaacgaacggtagaccct23
Claims (9)
1.一种新城疫病毒/禽流感病毒H9亚型/传染性支气管炎病毒三重荧光定量RT-PCR检测试剂,其特征在于,含有以下引物:
NDV-F:5’TATGRTGRTAACWTGCAAGAAGAG3’,
NDV-R为:5’GCTTTCACRTGCTTVACTG3’,
NDV-P:5'FAM-TA+GTG+CAG+GCA+CC-TAMRA3',
H9-F:5’ATGGGGTTTGCTGCC3’,
H9-R:5’AATTATATACAAATGTTGCAYCTG3’,
H9-P:5’HEX-TTCTGGGCYATGTCYAAYGG-BHQ1-3’,
IBV-F:5’CTATCGCCAGGGAAATGTC3’,
IBV-R:5’GCGTCCTAGTGCTGTACCC3’,
IBV-P:5’CY5-CCTGGAAACGAACGGTAGACCCT-BHQ2-3’,
其中,NDV-P:5'FAM-TA+GTG+CAG+GCA+CC-TAMRA3'中“+”后面的碱基代表LNA修饰。
2.根据权利要求1所述的三重荧光RT-PCR检测试剂,其特征在于,由荧光RT-PCR反应液和酶混合物按照20:1的体积比组成;
所述荧光RT-PCR反应液的组成:
10μmol/L的NDV-F:1μl,
10μmol/L的NDV-R:1μl,
10μmol/L的NDV-P:0.5μl,
10μmol/L的H9-F:1.2μl,
10μmol/L的H9-R:1.2μl,
10μmol/L的H9-P:1μl,
10μmol/L的IBV-F:1μl,
10μmol/L的IBV-R:1μl,
10μmol/L的IBV-P:0.5μl,
5×RT缓冲液:3.75μl,
10×PCR缓冲液:1.875μl,
25mmol/L的MgCl2:2.125μl,
10mmol/L的dNTP:2μl,
DEPC处理水:1.85μl;
所述酶混合物:由200U/μL的M-MLV反转录酶、5U/μL的TaqDNA聚合酶、40U/μL的RNA酶抑制剂按2:1:1的体积比混合而成。
3.一种含有权利要求1或2所述三重荧光定量RT-PCR检测试剂的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,还含有阴性对照、阳性对照;
所述阴性对照:正常SPF鸡的肝脏,用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐水制成20%悬液,70℃作用1小时;
所述阳性对照:为灭活的新城疫病毒Lasota株、禽流感病毒H9N2、鸡传染性支气管炎病毒H52株尿囊液分别1:1000倍稀释后按1:1:1体积比混合而成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,由提取试剂盒和检测试剂盒组成:
所述提取试剂盒的组成如下:
BufferA为裂解液,含有4mol/L异硫氰酸胍、10wt%十二烷基肌氨酸钠、4.5wt%氯化钠、30%乙醇v/v;
BufferB为洗液,含有10mmol/LTris-HCI、1mmol/LEDTA、70%乙醇v/v;
BufferC为溶解液,主要由DEPC水组成;
所述检测试剂盒的组成如下:
。
6.一种新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒的三重荧光RT-PCR检测方法,其特征在于,
取待测样品的核酸5ul与20ul权利要求1或2所述的检测试剂配成25ul的反应体系,或者,
取待测样品的核酸5ul置于权利要求3、4或5所述试剂盒中;
然后进行荧光定量RT-PCR反应,读取结果;
所述荧光定量PCR反应:
第一阶段:反转录,42℃/30min;
第二阶段:预变性,92℃/3min;
第三阶段:预扩增,92℃15sec,45℃30sec,72℃60sec;
第四阶段:92℃10sec,52℃15sec,60℃30sec,40个循环,在第,四阶段每次循环的60℃退火延伸时收集荧光;
所述读取结果:
如果FAM检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有新城疫病毒;
如果HEX或VIC检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有禽流感病毒H9亚型;
如果CY5检测通道出现“S”形扩增曲线,且Ct值小于30,则样品中含有鸡传染性支气管炎病毒。
7.根据权利要求6所述检测方法,其特征在于,利用FAM(465-510)通道、HEX(VIC)(533-580)和CY5(618-660)通道读取结果;
阴性结果:三个检测通道均无Ct/Cp值,且无特征性扩增曲线,表明样品中无新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒;
单阳性结果:
如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而HEX/VIC检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在新城疫病毒;
如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和CY5检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在禽流感病毒H9亚型;
如仅CY5检测通道出现特征性扩增曲线,且Cp/Ct值≤30.0,而FAM检测通道和HEX/VIC检测通道无Cp/Ct值并且无扩增曲线,表示样本中仅存在鸡传染性支气管炎病毒;
双阳性结果:
如FAM检测通道和HEX/VIC检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和禽流感病毒H9亚型;
如FAM检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;
如HEX/VIC检测通道和CY5检测通道均出现典型的扩增曲线,且Ct/Cp值均≤30.0,表示样品中存在禽流感病毒H9亚型和鸡传染性支气管炎病毒。
8.根据权利要求7所述检测方法,其特征在于,
阴性对照用三个检测通道读取数据时,应均无Ct/Cp值并且无扩增曲线;
阳性对照用三个检测通道读取数据时,应出现三条相应的特征性扩增曲线,且Ct/Cp值均应小于等于28。
9.根据权利要求8所述检测方法,其特征在于,任一通道Ct/Cp值大于30.0,且出现典型的扩增曲线的样品建议复验;复验仍出现上述结果的,判为阳性,否则判为阴性。
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