CN110373496A

CN110373496A - 用于i亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110373496A
Application number: CN201910510373.6A
Authority: CN
Inventors: 尹丽娟; 周庆丰; 彭鹏; 曹永长; 陈丽
Original assignee: Winson Food Group Ltd By Share Ltd
Current assignee: Winson Food Group Ltd By Share Ltd; Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2019-10-25

Abstract

本发明提供一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法，试剂盒包括PCR引物对和探针，所述PCR引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。检测的方法包括：以待检I亚群血清8型禽腺病毒样品DNA为模板，利用上述PCR引物对和探针进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。本发明最低可以检测模板浓度为10copies/μL，比常规的PCR方法高出约100倍，其他常见的家禽病毒均无特异性扩增，没有发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于1％。

Description

用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种可以感染各种日龄家禽的急性、高度接触传染性病原。该病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，分为3个亚群。其中，I亚群FAdV被分成5个毒种及12个血清型。该亚群FAdV可引起不同日龄禽类发生多种疾病，包括包涵体肝炎、心包积液-肝炎综合症和肌胃糜烂症等疾病。FAdV广泛流行于世界各地，给养禽业造成了巨大的经济损失。Wang等人(Wang J,Wang S,Zou K,et al.Variant Serotypes of FowlAdenovirus Isolated from Commercial Poultry Between 2007and 2017in SomeRegions of China[J].Avian Dis.2018,62(2):171-176)对我国2007-2017年间FAdV的流行情况进行了详细分析，研究结果表明2007-2014年血清11型禽腺病毒(FAdV-11)为国内优势毒株，2014年6月至2016年血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为国内优势毒株，而2017年上半年血清8型禽腺病毒(FAdV-8)为国内优势毒株。自FAdV-8广泛流行以来，尚无一种有效快速的诊断方法。目前主要通过接种SPF鸡胚和普通PCR扩增等传统方法检测FAdV-8感染。由于病料接种SPF鸡胚繁毒周期长且操作复杂，同时普通PCR方法很难监测到病毒含量很低的病料样品，因此急需建立一种操作简便、快速、灵敏高、特异性好的检测技术。

发明内容

有鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒，包括PCR引物对和探针，所述PCR引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述探针的5’端结合有FAM，3’端结合有BHQ。

进一步的，所述试剂盒还包括含有FAdV-8hexon基因的阳性重组质粒标准品。

第二个方面，本发明还提供了上述试剂盒在制备检测或诊断I亚群血清8型禽腺病毒的制剂中的用途。

第三个方面，本发明提供一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的方法，包括：以待检I亚群血清8型禽腺病毒样品DNA为模板，利用上述PCR引物对和探针进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。

进一步的，在所述荧光定量PCR扩增的反应体系中，每20μL中含有如SEQ ID NO:1所示的引物6pmol，如SEQ ID NO:2所示的引物6pmol，所述探针4pmol。

在本发明的一种实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×Master Mix(Probe qPCR)10μL，Rox reference dye(50×)0.04μL，DNA模板2μL，SEQ ID NO:1引物(6pmol)0.2μL，SEQ ID NO:2引物(6pmol)0.2μL，SEQ ID NO:3探针(4pmol)0.1μL，用灭菌双蒸水补至20μL。

进一步的，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性60sec，95℃变性15sec，60℃退火/延伸40sec，共40个循环。

本发明的优势和有益效果是：

(1)本发明根据FAdV-8的hexon基因序列，在保守区域设计了特异性扩增引物和探针，建立了可用于检测FAdV-8的特异性方法。

(2)特异性试验结果表明，与其他几种家禽主要疾病(FAdV-4、H9亚型AIV、NDV、IBV和ILTV)均无交叉反应。

(3)灵敏度试验结果表明，本发明的检测方法最低可以检测模板浓度为10copies/μL，比常规的PCR方法高出约100倍，其他常见的家禽病毒均无特异性扩增，没有发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于1％，说明本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1的标准质粒PCR扩增结果图，其中M：DNA分子量标准(DL2000)；1-3：标准质粒；4：阳性对照；5：阴性对照。

图2是本发明实施例1的普通PCR扩增结果图，其中1-10：质粒浓度分别为1.0×10⁹copies/μL、1.0×10⁸copies/μL、1.0×10⁷copies/μL、1.0×10⁶copies/μL、1.0×10⁵copies/μL、1.0×10⁴copies/μL、1.0×10³copies/μL、1.0×10²copies/μL、1.0×10¹copies/μL、1.0×10⁰copies/μL；11：阴性对照。

图3是本发明实施例1的FAdV-8TaqMan荧光定量PCR标准曲线图。

图4是本发明实施例1的FAdV-8TaqMan荧光定量PCR动力学曲线图，其中1-9：标准质粒浓度分别为1.0×10⁸copies/μL、1.0×10⁷copies/μL、1.0×10⁶copies/μL、1.0×10⁵copies/μL、1.0×10⁴copies/μL、1.0×10³copies/μL、1.0×10²copies/μL、1.0×10¹copies/μL、1.0×10⁰copies/μL。

图5是本发明实施例2的FAdV-8TaqMan荧光定量PCR方法的特异性扩增曲线图。

图6是本发明实施例3的FAdV-8攻毒后试验鸡排毒情况结果图。

图7是本发明实施例3的FAdV-8攻毒后试验鸡各组织病毒载量结果图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

FAdV-8TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

1.材料

1.1毒株

血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、H9亚型禽流感病毒(AIVH9)、新城疫病毒(NDV)、马立克氏病病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)均通过市售途径获得。

1.2主要试剂和仪器

体液病毒DNA/RNA提取试剂盒购自Magen公司， Probe qPCRMix购自TOYOBO公司，Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪购自ABI公司，RNA反转录试剂盒PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒和pMD-19T载体购自Takara公司。

2.方法

2.1引物设计与合成

经大量比对GenBank中Ⅰ亚群血清8型禽腺病毒hexon基因的DNA序列，筛选出FAdV-8hexon基因高度保守的特异性区域，设计检测FAdV-8hexon基因的特异性引物对和TaqMan探针。特异性引物对分别命名为FAdV-8-F(SEQ ID NO:1)、FAdV-8-R(SEQ ID NO:2)，探针命名为Probe(SEQ ID NO:3)。所设计的引物对和探针序列如下：

FAdV-8-F(SEQ ID NO:1)：5'-CTACCCTAATCCCAACTC-3'

FAdV-8-R(SEQ ID NO:2)：5'-TGTCCATGACGTAGTAAG-3'

Probe(SEQ ID NO:3)：5'-FAM-ACTGAGAGCCGTCGTTCTTCA-BHQ-3'

2.2样品的核酸提取

对组织样品研磨液(参见实施例4)和病毒液进行核酸提取，提取方法参照Magen生物公司体液病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒说明书。具体实验步骤包括：向1.5mL无菌离心管中加入200μL组织匀浆离心后的上清液和20μL蛋白酶K，旋涡震荡10sec；再加入500μLBuffer GRP涡旋震荡20sec，室温静置10min以便充分裂解组织；把柱子装入收集管中，将混合溶液转入到柱子内，12,000rpm离心1min，弃去收集管内的液体；将500μL Buffer GW1加到柱子内，12,000rpm离心1min，弃去收集管内液体；接着将650μL Buffer RW2加到柱子内，12,000rpm离心1min，弃去收集管内液体；然后把柱子装回到收集管中，12,000rpm离心2min，甩干柱子，弃去收集管，将柱子转入到一个全新的1.5mL无菌离心管中；最后加入35μLNuclease-free水，至柱子的膜中央，室温静置约2min，12,000rpm离心1min；弃去柱子后，将核酸样品保存于-20℃冰箱备用。

2.3反转录

将提取得到的RNA样品按照PrimeScript^TM RT-PCR试剂盒进行反转录得到cDNA。取4μL RNA模板、0.5μL dNTP Mixture及0.5μL Random 6mers加入PCR管内，65℃作用5min，4℃保存在PCR仪上进行变性、退火反应；之后在上述反应液中依次加入2μL 5×PrimeScriptBuffer、0.25μL RNase Inhibitor、0.25μL PrimeScript RTase、2.5μL RNase Free dH₂O，接着于PCR仪上，按照如下反应程序：30℃10min，42℃1h，95℃5min，4℃保存。

2.4标准质粒构建

筛选FAdV-8hexon基因的保守区域，设计FAdV-8hexon基因的标准质粒引物对，分别命名为hexon-F(SEQ ID NO.4)和hexon-R(SEQ ID NO.5)。所设计的标准质粒引物序列如下：

hexon-F(SEQ ID NO.4)：5'-CCTCGCGAAGCCTTCTTTAACAACT-3'

hexon-R(SEQ ID NO.5)：5'-TTCATCACCCCGGTATTGACCGTTC-3'

提取FAdV-8毒株DNA，经PCR扩增片段大小为472bp(图1)，回收阳性扩增产物，将阳性扩增产物克隆入pMD-19T载体中，筛选阳性重组质粒送金维智生物公司测序鉴定。测序正确阳性重组质粒命名为pMD-19T-hexon，使用紫外分光光度仪测定pMD-19T-hexon的OD260/OD 280比值为1.86，核酸浓度为1.0×10⁹copies/uL。将其进行10倍倍比稀释，共稀释8个梯度(10^-1-10^-8)，然后以FAdV-8-F(SEQ ID NO:1)和FAdV-8-R(SEQ ID NO:2)为引物进行PCR扩增。参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pMD-19T-hexon质粒DNA溶液的浓度。

2.5qPCR反应体系和条件

FAdV-8TaqMan荧光定量PCR扩增反应体系为：2×Master Mix(Probe qPCR)10μL，Rox reference dye(50×)0.04μL，DNA模板2μL，SEQ ID NO:1引物(6pmol)0.2μL，SEQ IDNO:2引物(6pmol)0.2μL，SEQ ID NO:3探针(4pmol)0.1μL以及用灭菌双蒸水补至20μL。优化后的反应条件为：95℃预变性60sec；95℃变性15sec，60℃退火/延伸40sec，共40个循环。

3.结果

3.1pMD-19T-hexon标准质粒的构建及PCR结果

图1提供了pMD-19T-hexon标准质粒PCR扩增结果图，可以看出经PCR扩增片段大小为472bp。普通PCR扩增结果如图2所示，PCR最低能检测到1.0×10³copies/μL。普通PCR是以FAdV-8-F(SEQ ID NO:1)和FAdV-8-R(SEQ ID NO:2)为引物，标准质粒10倍比稀释为模板，检测普通PCR扩增最低检测浓度，从侧面可以突出定量PCR具有高灵敏性。

3.2qPCR标准曲线

将标准质粒pMD-19T-hexon按照10倍比例进行倍比稀释，共稀释8个梯度(10^-1-10^-8)，用梯度稀释后的质粒做模板绘制qPCR标准曲线(图3)。结果显示：y＝-4.1181x+43.385(R²＝0.998)，qPCR扩增结果显示不同梯度对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系。

实施例2

灵敏度与重复性检测

用梯度稀释后的标准质粒pMD-19T-hexon为模板，按照1.0×10⁸～1.0×100copies/uL分别进行荧光定量PCR扩增，Ct值大于38视为阴性。绘制不同浓度的qPCR标准曲线。结果如图4所示，该方法具有很高的灵敏度，可检测到的最低模板浓度为1.0×10¹copies/μL，比普通PCR灵敏度高100倍。

以1.0×10⁵copies/μL和1.0×10⁶copies/μL两个浓度的标准质粒pMD-19T-hexon作为模板，对这两个稀释度在不同时间段进行3次重复实验测定，每次对同一模板同时进行3次重复测定，并设置3个重复孔，按照实施例1的扩增体系和条件进行实时荧光定量PCR。结果表明，批内和批间变异系数均小于1％，说明建立的FAdV-8TaqMan荧光定量PCR方法具有较好的重复性，结果稳定可靠(表1)。

表1 FAdV-8TaqMan荧光定量PCR方法的重复性结果

实施例3

FAdV-8 TaqMan荧光定量PCR检测方法的特异性实验

收集实验室引起家禽患病的常见病毒包括血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、H9亚型禽流感病毒(AIV H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克氏病病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)，用于检测本发明血清8型禽腺病毒实时荧光定量PCR方法的特异性，反应体系和扩增反应条件参考实施例1进行扩增。结果如图5所示，FAdV-4、MDV、AIVH9、NDV、IBV、ILTV和无菌双蒸水均无扩增曲线，为阴性，只有FAdV-8样品能扩增阳性曲线。说明该荧光定量PCR方法具有很高的特异性。

实施例4

采用本发明建立的FAdV-8 TaqMan荧光定量PCR方法进行临床样品检测

血清8型禽腺病毒稀释成2×10⁶ TCID ₅₀/0.1mL，以肌肉注射方式感染10只3日龄SPF鸡。于攻毒前和攻毒后每隔2天采集试验鸡的腔拭子，添加1mL无菌PBS震荡混匀后离心收集上清液。另外于攻毒后第4天采集3只试验鸡的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胰腺、小肠、腺胃和肌胃等组织样品，制备组织研磨液。参考体液病毒核酸提取试剂盒提取DNA，利用建立的FAdV-8TaqMan实时荧光定量PCR方法检测FAdV-8在鸡体内增殖以及排毒情况。

结果表明FAdV-8感染后的试验鸡存在排毒现象，说明生产上粪口传播是FAdV-8重要的传播方式(图6)。同时对采集各组织脏器进行病毒含量的检测发现，病毒在试验鸡各组织脏器中均能够复制增殖，其中肝脏中病毒含量最高，其次为胰腺和肌胃，心脏中病毒含量最低(图7)。

综上，本发明根据FAdV-8的hexon基因序列，在保守区域设计了特异性扩增引物和探针，建立了可用于检测FAdV-8的特异性方法，并且本发明的检测方法对于I亚群血清8型禽腺病毒具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，最低可以检测模板浓度为10copies/μL，比常规的PCR方法高出约100倍，其他常见的家禽病毒均无特异性扩增，没有发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于1％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司

<120> 用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒及检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaccctaat cccaactc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtccatgac gtagtaag 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgagagcc gtcgttcttc a 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctcgcgaag ccttctttaa caact 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcatcaccc cggtattgac cgttc 25

Claims

1.一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒，其特征在于：包括PCR引物对和探针，所述PCR引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针的序列如SEQ IDNO:3所示。

2.根据权利要求1所述的一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述探针的5’端结合有FAM，3’端结合有BHQ。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括含有FAdV-8hexon基因的阳性重组质粒标准品。

4.一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的方法，其特征在于：以待检I亚群血清8型禽腺病毒样品DNA为模板，利用权利要求1～3任意一项权利要求所述的PCR引物对和探针进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。

5.根据权利要求4所述的一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的方法，其特征在于：在所述荧光定量PCR扩增的反应体系中，每20μL中含有如SEQ ID NO:1所示的引物6pmol，如SEQ ID NO:2所示的引物6pmol，所述探针4pmol。

6.根据权利要求4或5所述的一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性60sec，95℃变性15sec，60℃退火/延伸40sec，共40个循环。

7.权利要求1～3任意一项权利要求所述的一种用于I亚群血清8型禽腺病毒检测的试剂盒在制备检测或诊断I亚群血清8型禽腺病毒的制剂中的用途。