CN112301168A

CN112301168A - 一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112301168A
Application number: CN202011335431.5A
Authority: CN
Inventors: 李宁求; 付小哲; 罗明菊; 林强; 刘礼辉; 牛银杰; 罗霞; 梁红茹
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112301168B

Abstract

本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT‑PCR试剂盒及方法。本发明的试剂盒包括引物对和TaqMan探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：TZ‑F：5’‑AATCCAAAAACAACACGCTAAACA‑3’；TZ‑R：5’‑GCGCCTCATGATTGAGTCAAG‑3’；Probe：5’‑(FAM)‑ATGGGTTCAATCCCTTCAACGGCG‑(Eclipse)‑3’。本发明针对LBBV建立的TaqMan实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒和方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。

Description

一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及双RNA病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒及方法。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，隶属于太阳鱼科(Centrarchidae)、黑鲈属(Micropterus)。肉质鲜美细嫩，无肌间刺，营养丰富，是一种优质淡水鱼类。

自19世纪以来，水产动物双RNA病毒病频繁暴发，其代表种传染性胰脏坏死病(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)已在我国山西、甘肃、辽宁、四川等地流行，患病稚鱼死亡率高达95％，给我国水产养殖业带来巨大损害。徐晔、Rodriguez Saint-Jean等人就曾针对水生动物双RNA病毒建立了qPCR检测方法。

发明人从发病的大口黑鲈组织中分离得到一株新型的双RNA病毒，主要临床症状为肠道充满黄色黏液、肝脏出血、有腹水；病毒无囊膜，具有二十面体结构；基因组由双节段双链RNA构成，A节段分别编码VP2、VP4、VP3三种蛋白，B节段编码VP1蛋白；基因同源性分析显示，该病毒与双RNA病毒科(Birnaviridae)的黑鱼斑点病毒属(Blosnavirus)病毒同源性较高，暂命名为大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)。针对该未知的水生动物双RNA病毒，目前为止，尚未有关于此种病毒的检测方法发表。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒及方法。本发明针对LBBV建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒和方法，为该病毒病的早期预警及有效防控提供快速灵敏的检测手段。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对和TaqMan探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：

TZ-F：5’-AATCCAAAAACAACACGCTAAACA-3’；

TZ-R：5’-GCGCCTCATGATTGAGTCAAG-3’；

Probe：5’-(FAM)-ATGGGTTCAATCCCTTCAACGGCG-(Eclipse)-3’。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述Probe探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记Eclipse淬灭基团。

本发明还提供了一种大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，所述方法以大口黑鲈双RNA病毒的VP1基因保守序列为靶标，建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述VP1基因保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述荧光定量PCR检测方法中采用的引物对和TaqMan探针的序列如下：

TZ-F：5’-AATCCAAAAACAACACGCTAAACA-3’；

TZ-R：5’-GCGCCTCATGATTGAGTCAAG-3’；

Probe：5’-(FAM)-ATGGGTTCAATCCCTTCAACGGCG-(Eclipse)-3’。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述Probe探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记Eclipse淬灭基团。

作为本发明所述检测方法的优选实施方式，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃30s，60℃34s，扩增40个循环。

本发明的有益效果：

(1)LBBV是一种新型双RNA病毒，至今为止没有关于LBBV的检测方法文献发表，这就意味着目前没有有效的检测手段来对该病毒的传播进行监控，本发明中针对此问题建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，补充了疾病早期预警及防控中检测方法的空白。

(2)本发明方法检测用时短，在短时间之内就可以获得检测结果，为检测人员节省了检测时间，提高了单位时间工作量，增加了公司效益。

(3)本发明检测方法检测的最低病毒拷贝数低，即灵敏度高，可以检测低含量病毒的临床样本，增加了检测结果的准确性，可以更大程度的排除病毒传播风险，为养殖户及公司避免了损失，提高产量，增收效益。

(4)本发明的引物仅与LBBV基因特异性结合，检测结果特异，减少了因为假阳性结果而处理掉的养殖鱼的损失，间接增加了养殖户及公司收益。

附图说明

图1：LBBV TaqMan实时荧光定量RT-PCR标准曲线。

图2：LBBV TaqMan实时荧光定量RT-PCR特异性检测结果图，其中1：NNV；2：CyHV-II；3：MRV；4：SGIV；5：ADIV；6：ISKNV；7：SCRV；8：TiLV；9：阴性对照；10：LBBV。

图3：灵敏度检测结果图(质粒标准品)，其中1～11：4.15×10⁹copies/μL～4.15×10^-1copies/μL；NTC)。

图4：灵敏度检测结果图(模拟样品)，其中1～10：10⁹～10⁰PFU/ml；11：N；12：NTC。

图5：临床样品检测结果图。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1材料和方法

1.1细胞、毒株

鳜脑组织细胞系(Chinese perch brain cell line，CPB)由本实验室建立保存。大口黑鲈双RNA病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)、石斑鱼神经坏死病毒(NervousNecrosis Virus，NNV)、鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II，CyHV-II)、鳜蛙病毒(Mandarinfish ranavirus，MRV)、石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、大鲵虹彩病毒(Andrias davidianus iridovirus，ADIV)、鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、鳜弹状病毒(Sinipercachuatsi rhabdovirus，SCRV)、罗湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)均由本实验室分离、保存。

1.2方法

1.2.1引物和探针设计

根据LBBV的VP1序列，利用Primer 5.0软件，设计VP1基因扩增引物VP1-F和VP1-R(用于质粒构建)、荧光定量引物TZ-F和TZ-R及探针probe(见表1)。将引物序列上传至GeneBank进行blastn比对分析，初步检测引物特异性。引物及探针设计如表1所示，VP1基因引物由广州艾基生物有限公司合成，荧光定量引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1质粒构建与TaqMan实时荧光定量RT-PCR引物

1.2.2病毒的扩增与滴度的测定

取LBBV病毒，加至生长状态良好的CPB细胞中，28℃无CO₂培养箱孵育1h后，补加血清浓度为5％的L-15培养基，放至28℃无CO₂培养箱中培养，直至病变完全，于-80℃反复冻融两次，0.22μm滤器过滤，分装保存至-80℃。TCID₅₀测定：10倍梯度稀释LBBV病毒液，加至96孔板的CPB细胞中，100μL/孔，每个稀释度一列，对照组添加等量无血清L-15培养基，28℃无CO₂培养箱孵育一个小时后，补加血清浓度为5％的L-15培养基(100μL/孔)，连续观察病变7天，根据karber法计算病毒滴度TCID₅₀值。

1.2.3RNA提取与反转录

取LBBV病毒液500μL，使用Trizol(Invitrogen)法提取病毒RNA，Nanodrop2000分光光度计测RNA浓度，取500ng RNA用Evo M-MLV RT for PCR Kit试剂盒反转录成cDNA。

1.2.4质粒标准品的构建与鉴定

使用引物VP1-F/VP1-R(退火温度50℃，延伸时间2min)扩增VP1蛋白基因，核酸凝胶电泳鉴定后，使用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1289bp)，并与pMD-18T克隆载体(Takara)连接，构建重组质粒pMD-LBBV-VP1。采用氯化钙法转化DH5ɑ感受态细胞，涂板、挑菌，进行菌液PCR鉴定，并送至广州艾基生物有限公司进行核酸序列的测定，测序正确后于-80℃保存。

1.2.5标准曲线的生成

提取质粒pMD-LBBV-VP1，根据拷贝数计算公式：拷贝数＝((6.0×10²³)×(质粒浓度(g/mL或ng/μL))×10^-9)/((载体长度+目的片段长度)×324.5×2)，计算质粒初始拷贝数。10倍梯度稀释质粒，每个稀释度3个重复，进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测。重复检测3次，选择最稳定的拷贝数范围，在此范围内生成标准曲线。

1.2.6特异性检测

使用病毒DNA/RNA共提取试剂盒(天根)，提取石斑鱼神经坏死病毒(NNV)、鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)、鳜蛙病毒(MRV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、大鲵虹彩病毒(ADIV)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、鳜弹状病毒(SCRV)、罗湖病毒(TiLV)与LBBV等9种病毒的核酸，进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，评价该方法的特异性。

1.2.7灵敏度检测

使用质粒标准品和模拟样品两种方式来评判该方法灵敏度。

(1)质粒标准品：以10倍梯度稀释pMD-LBBV-VP1质粒为模板，进行qPCR检测，分析该方法检测底限。

(2)模拟样品：根据病毒TCID₅₀值，计算病毒的感染性滴度(PFU/mL)，并据此梯度稀释病毒液，使得病毒浓度依次为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰PFU/mL，将1mL梯度稀释的病毒液分别加至生长状态良好的CPB细胞中(6孔板)，对照组加等量无血清L-15培养基，每个处理三个重复，28℃无CO₂培养箱孵育1h后，吸走病毒液，PBS清洗两次，加Trizol提取细胞总RNA，反转录成cDNA，TaqMan实时荧光定量RT-PCR评价其灵敏度。

1.2.8重复性检测

选择4.15×10⁷～4.15×10⁴拷贝数的质粒标准品作为模板，每个浓度3个重复，进行3次TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，以组内变异系数与组间变异系数进行统计学分析，分析该检测方法的重复性。

1.2.9样品检测

对实验室2017～2020年收集的来自不同地点、不同品种、不同季节、不同规格的304个病鱼样品进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测，分析LBBV的流行情况。

实施例2实验结果

2.1标准曲线

将重组质粒PMD-LBBV-VP1进行10倍梯度稀释。根据拷贝数计算公式，得到标准品拷贝数为4.15×10¹⁰(copy/μL)。选择最稳定的浓度范围(4.15×10⁷copy/μL～4.15×10³copy/μL)，在此范围内生成标准曲线。以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，得到回归方程式：y＝-3.456x+39.257(R²＝1)。据此推测：当检测样品含有1个拷贝病毒时，检测Ct值为39.257，因此，设定该方法的检测极限Ct值为39.257。该回归方程的R²＝1，说明标准方程的拷贝数与Ct值具有极高的相关性。

2.2TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测

采用建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR对9种不同病毒进行检测。从图2可以看出，除LBBV外，NNV、CyHV-II、MRV、SGIV、ADIV、ISKNV、SCRV、TiLV均未产生荧光信号，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法具有良好的特异性。

2.3TaqMan实时荧光定量PCR敏感性检测

(1)以10倍梯度稀释的质粒作为模板，进行灵敏度检测，结果如图3所示，建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测下限为4.15×10⁰copies/μL，检出Ct值为37.928。

(2)模拟样品检测下限为10²个PFU/mL，检出Ct值为37.767(图4)。

两种样品的检测结果表明，建立的该方法具有很高的灵敏度。

2.4TaqMan实时荧光定量PCR重复性检测

对梯度稀释的4.15×10⁷～4.15×10⁴copies/μL的质粒标准品分别进行3次独立的实时荧光定量RT-PCR检测，进行组内和组间的统计学分析。结果显示，组内变异系数在0.11％～0.93％之间，组间变异系数在1.22％～1.83％之间，小于2％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法有极好的重复性。

表2组内重复性检测结果

表3组间重复性检测结果

2.5TaqMan实时荧光定量PCR临床样本检测及流行病学调查分析

对本实验室收集于2017～2020年间来自广东地区养殖的鳜、大口黑鲈、乌鳢、云斑尖塘鳢等304个病鱼样品进行检测。具体检测过程如下：

(1)RNA提取。解剖病鱼，取30mg肝、脾、肾混合组织于1.5mL离心管中，加1mL PBS及2颗钢珠，匀浆3min后，10000r/min离心1min，取200μL上清，使用磁珠法提取组织RNA。

(2)反转录。取300ng RNA用Evo M-MLV RT for PCR Kit试剂盒反转录成cDNA。

(3)TaqMan实时荧光定量PCR。以反转录cDNA为模板，体系(20μL)：2x Pro Taq HSProbe Premix 10μL，VP1-F、VP1-R、probe(10umol/L)与Rox(20uM)各0.5μL，DEPC水6μL，cDNA模板2μL，反应程序为95℃预变性30s，95℃5s，60℃34s，扩增40个循环。

结果如图5所示，304个病鱼样品中，阳性样品22株，检出率为7.23％。对阳性样品的流行特性进行了初步的分析，发现该病毒主要在清远、佛山、顺德地区检出；主要在6～9月份高温季节暴发流行；感染宿主包括大口黑鲈、鳜、乌鳢；2017～2018年的阳性样品主要为小规格鱼，2019～2020年的阳性样本不仅有小规格鱼，在成鱼中也有检出。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒及方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1289

<212> DNA

<213> 大口黑鲈

<400> 1

ttcaaacagt tcagggacac aattctggag tgccagtacg gctcaggaac caacgcaggg 60

cagatagcca ggctcctagc catgagaggg gtcgcagtgg gcaggaaccc caacaaaaca 120

ctagcccagc agggcctgac actagaacag atggcggtgc tactggagca gacactgccc 180

atcggccagc ccggagacga tgagacaggc tggccagccc tcacaacaac gctctcaggt 240

ctgctgaatc cagacacgaa cgaggactac ctcccagacg tcaccaagaa atcctcggca 300

gggctcccct acatagggaa gaccaaagga gacacaatgc tggaggcgct agcaatcgga 360

gacacattcc tcagagaact atccgcagtc ctcagcagca ccaccccaga ccagaaggac 420

cgattcaact cacttctcca ggacttctgg tacctgtcgt gcgggctcct attccccaag 480

ggggaacggt acgacagaga cgcatggctg accaagaccc gcaacatctg gtccgcgcct 540

ttccccacgc acttcctgat ctcagccata tcgtggccaa tcatgaagca atccaaaaac 600

aacacgctaa acatggacac accctccctg tatgggttca atcccttcaa cggcgggctt 660

gactcaatca tgaggcgcgt ggagaagggg gaggacctgc acctgatcta cgcagacaac 720

atctacatac ttcaggacag gatctggttc agcatagacc tggagaaagg cgaagccaac 780

gccacaaaga gccacgctca agccattgcc tactacctcc tcaccagagg ctgggtacag 840

gacgacggct cccccgcctt caacgcaacc tgggcgacgc tggccatgca aatagcccct 900

gctctcgtgg tcgactcaag ctgcctgttc atgaacctgc agctgaagac atatgggcag 960

ggcagcggaa acccctggac gttcctcatc aaccatgccc tctcaaccat agttgtcaac 1020

gcctggatcc aggcgggcaa accacggcca gacacaccac aattcatggc actggagaag 1080

acaaccggcg tgaacttcaa gattgagagg acgatccccg aagtacccac agccgcactg 1140

aaggccaggg agtcatctcc cctcattggg tacctaggcg acggcaccaa cagaccccca 1200

gagaaagagg cacccacagt ggacctcgac ctcctgggct ggtccgccac atacagcaga 1260

ctactagagt catgggtgcc cgtcctaga 1289

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tacgacctac cactactca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctcgtttctg acaatggtg 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aatccaaaaa caacacgcta aaca 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcgcctcatg attgagtcaa g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgggttcaa tcccttcaac ggcg 24

Claims

1.一种检测大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对和TaqMan探针，所述引物对和TaqMan探针的序列如下：

TZ-F：5’-AATCCAAAAACAACACGCTAAACA-3’；

TZ-R：5’-GCGCCTCATGATTGAGTCAAG-3’；

Probe：5’-(FAM)-ATGGGTTCAATCCCTTCAACGGCG-(Eclipse)-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Probe探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记Eclipse淬灭基团。

3.一种大口黑鲈双RNA病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于：所述方法以大口黑鲈双RNA病毒的VP1基因保守序列为靶标，建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述VP1基因保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR检测方法中采用的引物对和TaqMan探针的序列如下：

TZ-F：5’-AATCCAAAAACAACACGCTAAACA-3’；

TZ-R：5’-GCGCCTCATGATTGAGTCAAG-3’；

Probe：5’-(FAM)-ATGGGTTCAATCCCTTCAACGGCG-(Eclipse)-3’。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述Probe探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团，3’端标记Eclipse淬灭基团。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃30s，60℃34s，扩增40个循环。