CN101928785A - 大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物，预期扩增167bp片段：上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’，下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’；同时合成探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Ecl ipse)-3’用以荧光检测。再经提取模板DNA、PCR扩增反应，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量，具有检测速度快、检测精度高的优点。

Description

大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法

技术领域

本发明涉及对大口黑鲈溃疡综合症虹彩病毒特异的检测方法。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易起捕等特点，从上世纪七十年代开始推广到世界各地，目前全国大口黑鲈的年产量在10万吨左右。自从2006年以后，每年6-10月期间，一种溃疡综合症在广东省的养殖大口黑鲈中流行，而且有逐年加重的趋势。感染该病毒的鱼发病时皮肤和肌肉溃烂，脾脏和肾脏变大，病鱼死亡率最高达60％，给养殖者造成了巨大的损失，已对大口黑鲈养殖产业构成了严重威胁。2008年，本单位的科研人员从病鱼中成功分离到一种病毒，经回归感染确认该病毒就是导致溃疡病的病原，经过电镜观察和DNA序列分析，确定了该病毒的分类地位是虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，命名为大口黑鲈溃疡综合症病毒。由于该病毒是新发现的病毒，对这种病毒病还没有有效的治疗方法，所以对该病的早期快速诊断，确定病原成为重要的防治手段，以减少生产上的损失。

水生病毒检测方法有生物学测定法、凝集试验、透射电镜观察法、酶联免疫反应、免疫组织化学、PCR检测等方法。生物学方法比较灵敏，但要花费2-3周的时间，不适合作病毒的快速检测与鉴定；凝集试验快速简便，但敏感性较差，应用不广；透射电镜观察法需要透射电镜设备，费时、费力，成本很高；酶联免疫反应检测快速，但需要有效的特异的抗体；免疫组织化学耗时，步骤繁琐，也需要有特异的抗体；PCR检测法具有特异、敏感、高效、快速、简便、重复性好和易自动化操作等突出的优点，已广泛应用于致病病毒的检测；荧光定量PCR方法是在PCR方法基础上进行改进了的又一种病毒检测方法，其优点在于灵敏度比普通PCR方法更高，且省去了电泳的步骤，节省了时间，提高了检测的效率。大口黑鲈溃疡综合症病毒是新近发现、分离并鉴定的病毒，在分类地位上属于虹彩病毒科蛙病毒属，我们克隆并确定了该病毒的DNA甲基转移酶基因及其两端侧翼碱基序列，GenBank登陆号为GU256634。1999年，Mao等人根据脊椎动物虹彩病毒主要依壳蛋白基因和DNA甲基转移酶基因的保守序列设计并合成引物，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法有效地鉴定出虹彩病毒科蛙病毒属的病毒，但利用这个方法不能将大口黑鲈溃疡综合症病毒与蛙病毒属的其它病毒株进行区分。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术存在的技术缺陷，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶基因3’端序列设计特异性PCR扩增引物，建立一种快速、准确、灵敏的在鱼发病早期特异性检测大口黑鲈溃疡综合症病毒的荧光实时定量PCR方法，其与普通PCR方法相比，虽然对设备要求较高、检测成本也较高，但该方法具有灵敏度更高、更加直观、更加省时省力的优点。

为达到上述目的，本发明大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法的检测步骤如下：

(一)、引物的设计

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：

上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’

下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’

探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Eclipse)-3’

预期扩增DNA片段167bp；

(二)、提取模板DNA

(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

(4)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μ1TE溶解DNA，4℃贮存备用。

(三)、PCR反应体系

ddH₂O                18.8μL

10×PCR Buffer       2.5μL

4×dNTP(10mmol/L)    0.5μL

Taq酶(5U/μL)        0.2μL

PF(10μmol/L)        0.5μL

PR(10μmol/L)        0.5μL

ROX染料              0.5μL

PB(10μmol/L)        0.5μL

模板DNA              1.0μL

检测待测样品的同时，按10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴拷贝数/μL系列稀释的线性化质粒pMT-rt，各取1μL作为模板，检测CT值，制作标准曲线，另以1μL ddH₂O为模板作阴性对照。PCR结束后，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量。

(四)、PCR反应条件

95℃预变性3分钟；再40个循环反应，包括95℃变性15秒，60℃退火和延伸共1分钟。

(五)、判断标准

当CT值小于等于33可判断为阳性；

当CT值大于等于35可判断为阴性；

当CT值在33-35之间为可疑，需重复检测，如果重复检测CT值小于等于33可判断为阳性，大于33可判断为阴性。

本发明检测法利用生物信息学手段，将大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶基因3’序列在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，目前已知的DNA序列中没有与之同源的序列。根据这段特异的序列设计引物和探针，以待检测鱼的脾脏组织基因组为模板进行荧光定量PCR扩增，检测其是否感染大口黑鲈溃疡综合症病毒。

用限制性内切酶EcoR I酶切含有DNA甲基转移酶基因序列的质粒(名称为pMT-rt)4小时，纯化后按10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝数/μL系列稀释，各取1μL线性化质粒作为模板，以无质粒的水作阴性对照，在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，60℃读板检测建立标准曲线，斜率为3.55，R²＝0.998，呈现很好的线性关系，扩增效率91％(用E＝10^(1/M)-1公式计算)，具有良好的扩增效率。样品检测反应35个循环可以检测到的质粒最小浓度是10¹拷贝数/μL。选用10⁷、10⁶、10⁵拷贝数/μL 3个浓度梯度，每个梯度重复4次，变异系数在0.32％-1.6％范围内，说明该方法具有良好的重复性和稳定性。分别以正常大口黑鲈、感染传染性脾肾坏死病毒的大口黑鲈和感染溃疡综合症病毒的大口黑鲈的脾脏组织DNA作为模板，进行PCR扩增以检测引物的特异性，结果该方法仅扩增出大口黑鲈溃疡综合症病毒感染的病鱼组织的PCR产物，而正常大口黑鲈和感染传染性脾肾坏死病毒的鱼均检测不到扩增产物，说明该方法特异性好，可准确检测出大口黑鲈溃疡综合症病毒。

本发明的有益效果是：检测速度快，大约可以在3.5个小时内完成；在检测时设阳性对照(以含有DNA甲基转移酶基因3’序列的质粒pMT-rt为PCR模板)和阴性对照(以水为模板)，所以检测结果十分准确；在PCR进行到35个循环时就可以检测到10个病毒粒子，检测精度高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更加具体的说明。

(一)、引物的设计

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：

上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’

下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’

探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Eclipse)-3’

预期扩增DNA片段167bp。

上述中，引物的合成是采用固相磷酰亚胺法，将所要合成的核酸链的末端核苷酸的3′-OH先固定在聚苯乙烯固相载体上，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基保护，下一个核苷酸的5′-OH也被4，4′-二甲氧基三苯甲基保护，3′-OH上的磷酸基上有-N(C₃H₃)₂和-OCH₃两个基团，每延伸一个核苷酸需4步化学反应：

(1)、末端核苷酸的4，4’-二甲氧基三苯甲基用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5’-OH；

(2)、新生成的5’-OH在四唑催化下与下一个核苷3’-磷酰亚胺单体缩合使链增长；

(3)、有少量(小于0.5％)未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸；

(4)、新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。

上述步骤循环一次，核苷酸链向5′-OH方向延伸一个核苷酸。

荧光标记物FAM的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物借助氨己基连接臂偶联于引物的5′-核苷酸上，淬灭基团Eclipse通过磷酸二酯键连接到探针的3’末端。

合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来，切割后的寡核苷酸具有游离的3′-OH，但磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基B-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丙酰基则要在浓氨水中55℃放置15小时左右方能脱掉。最后用丙烯酰氨凝胶电泳法纯化，即可使用。

(二)、模板DNA的提取

(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

(4)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris-HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。

(三)、PCR反应体系

ddH₂O(双蒸水)                        18.8μL

10×PCR Buffer(10倍反应缓冲液)       2.5μL

4×dNTP(脱氧核糖核苷酸)(10mmol/L)    0.5μL

Taq聚合酶(5U/μL)                    0.2μL

上游引物PF(10μmol/L)                0.5μL

下游引物PR(10μmol/L)                0.5μL

ROX染料                              0.5μL

探针PB(10μmol/L)                    0.5μL

模板DNA                              1.0μL

检测待测样品的同时，按10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴拷贝数/μL系列稀释的线性化质粒pMT-rt，各取1μL作为模板，检测CT值，制作标准曲线，另以1μL ddH₂O为模板作阴性对照。PCR结束后，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量。上述中，ROX染料为一种荧光染料，全称ROX(6-Carboxy-X-rhodamine)6-羧基-X-罗丹明。

(四)、PCR反应条件

95℃预变性3分钟；再40个循环反应，包括95℃变性15秒，60℃退火和延伸共1分钟。

(五)、判断标准

当CT值小于等于33可判断为阳性；

当CT值大于等于35可判断为阴性；

当CT值在33-35之间为可疑，需重复检测，如果重复检测CT值小于等于33可判断为阳性，大于33可判断为阴性。

以上内容是结合具体的主要实施方式所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，所作出的其他若干技术精确、美化的推演或替换，都应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120>大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法

<160>1

<170>patentin version 3.5

<210>1

<211>86

<212>DNA

<213>大口黑鲈溃疡综合症病毒(largemouth bass ranavirus)

<220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<400>1

 

TGCTGGAAAAGGCGCTAGATATCATAGACTACCTCAAACCCAAACATTACATTATAGAGAACCCAGAGA

CTGGGCGCATGAAAGAT

Claims (1)

1.一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(一)、引物的设计

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：

上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’

下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’

探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Eclipse)-3’

预期扩增DNA片段167bp；

(二)、提取模板DNA

(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

(4)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE溶解DNA，4℃贮存备用；

(三)、PCR反应体系

ddH₂O                         18.8μL

10×PCR Buffer                2.5μL

4×dNTP(10mmol/L)             0.5μL

Taq酶(5U/μL)                 0.2μL

PF(10μmol/L)                    0.5μL

PR(10μmol/L)                    0.5μL

ROX染料                          0.5μL

PB(10μmol/L)                    0.5μL

模板DNA                          1.0μL

检测待测样品的同时，按10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴拷贝数/μL系列稀释的线性化质粒pMT-rt，各取1μL作为模板，检测CT值，制作标准曲线，另以1μL ddH₂O为模板作阴性对照，PCR结束后，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量；

(四)、PCR反应条件

95℃预变性3分钟；再40个循环反应，包括95℃变性15秒，60℃退火和延伸共1分钟；

(五)、判断标准

当CT值小于等于33可判断为阳性；

当CT值大于等于35判断为阴性；

当CT值在33-35之间为可疑，需重复检测，如果重复检测CT值小于等于33可判断为阳性，大于33可判断为阴性。