CN101824487B

CN101824487B - Pcr结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染

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Publication number: CN101824487B
Application number: CN2010101422661A
Authority: CN
Inventors: 崔治中
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: CN101824487A

Abstract

本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中病毒感染的方法。本发明将疑是病毒感染的动物组织样品DNA用针对可疑病毒的特异性引物PCR扩增后，对PCR产物再用该病毒特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。本发明试验结果表明，PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染，可显著提高病毒感染检测的灵敏度和特异性。

Description

PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染

技术领域

本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染，属于兽医微生物学领域分子生物技术。

背景技术

目前，在规模化养禽业和养猪业，病毒的多重感染是普遍性的问题，也是临床发病的真正原因。但是，对多种病毒的病原学检测对养殖场来说是一个困难问题。这是因为，很难对多个个体的不同病料同时做不同病毒的分离培养。现代分子生物学技术PCR和核酸探针斑点分子杂交技术有助于解决这一问题。在一切条件完美时，PCR的灵敏度非常高。但在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题。如，有时PCR产生的DNA条带虽染大小与预期的一样，但测序结果表明，却是一种无关核酸。此外，由于技术性原因，PCR的可重复性也较差，特别是其灵敏度的可重复性较差，常常PCR产物在电泳时看不到核酸条带。这是因为，PCR产物电泳时，如果加入的DNA量小于50pg，则很难看到条带。用特异性核酸探针做斑点分子杂交，其特异性较稳定，其检测灵敏度可达1pg的同源核酸。但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来。如过将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。而且，电泳显示的条带，并不代表是特异的。

发明内容

本发明的目的是为克服PCR在实际应用时，常常出现假阳性和假阴性问题；用特异性核酸探针做斑点分子杂交，但如果病毒感染量小时，在1μg病料样品的总DNA中，特异性病毒的核酸可能不足1pg，因而也检测不出来这些不足，而将PCR和斑点杂交结合起来，则既能确定PCR产物的特异性，也能提高PCR产物的检出灵敏度。但如果再结合斑点杂交，则只要1pg就可显现阳性了。先将疑是病毒感染的肉鸡样品DNA用针对可疑病毒的特异性引物PCR扩增后，再对PCR的产物用该病毒的特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。

发明的详细描述

1本发明主要步骤

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取因患病引起不同临床表现的动物、病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。按常规方法提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液制备成为样品DNA。

(2)扩增样品中可疑病毒的特异性核酸片段

设计可疑病毒特异性引物(F2/R2)扩增出样品DNA可疑病毒特异性核酸片段(样品PCR扩增的片段大小长于探针)，如图1所示。用于扩增样品的引物(F2/R2)必须在探针标记用引物(F1/R1)之外，即被标记探针DNA序列之外；其扩增的产物长于标记探针DNA序列。

(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针制备及特异性及敏感性的测定

利用已知病毒基因组DNA克隆用于标记病毒核酸探针。设计引物(F1/R1)采用地高辛PCR法标记技术，进行地高辛标记制备探针，将纯化的病毒的特异性DNA片段作为标记DNA探针的模板，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。

(4)各样品及其相应PCR产物用标记的病毒核酸探针进行斑点杂交检测。

2本发明的具体描述(以鸡贫血病病毒为例)

(1)病料的收集及样品DNA的制备

取疑似鸡贫血病病毒(CAV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

(2)样品DNA针对CAV的特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物CAV-vp1-F2和CAV-vp1-R2扩增出样品DNA的特异性核酸片段(样品1-12)，片段长度及引物序列如表1所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表1：样品PCR所用的引物序列

(3)地高辛PCR法标记病毒核酸探针

1)病毒核酸探针的标记

利用本发明人保存的鸡贫血病毒CAV-vp1基因(李延鹏，崔治中.一株鸡传染性贫血病毒野毒株致病性及全基因组序列比较.微生物学报，2007年47卷5期)作为CAV特异性探针模板DNA用于标记CAV-vp1探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表1(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒(PCR DIG ProbeSynthesis Kit，Cat.No.11 636 090 910，Version December 2005)进行地高辛标记制备探针，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行。

表2：CAV病毒制备核酸探针所用的引物序列

2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(CAV-vp1基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11 636 090 910，Version December 2005；DIG Nucleic Acid Detection Kit，Cat.No.11 175 041 910，VersionOctober 2008)操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL MDV-pp38基因、REV-pol基因和CAV-vp1基因(病毒特异性的DNA)作阴性对照和阳性对照，点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-1)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-1)。

(3)针对CAV病毒样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-1(样品1-12，并设分子量大小的标志M：2000DL)。

(4)各样品及其相应PCR产物用CAV-vp1探针，进行斑点杂交检测

将提取的样品DNA和各样品的PCR产物分别点在NC膜上，经变性、中和、烤膜、预杂交、杂交、洗膜、碱性磷酸酶标记的ELASA检测后，通过斑点的有无判断结果。具体步骤如下(本发明所用试剂购自罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11 636 090910和DIG Nucleic Acid Detection Kit，Cat.No.11 175 041 910)：

1)取一张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜，购自罗氏公司)，划好格子(0.7cm×0.7cm)，做好标记。

2)把每个提取的样品DNA分别点到NC膜上。

3)NC膜(点样面朝上)放于已用变性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)饱和的双层滤纸上变性10min，再放于已用中和液(0.5mol/L Tris-Cl，3.0mol/L NaCl，pH7.4)饱和的双层滤纸上中和5min。

4)NC膜室温干燥30min，然后在80℃干烤2h固定DNA。

5)将NC膜放于预杂交液(5×SSC，0.2％SDS，2％Blocking Reagen，)于68℃反应2h，期间经常摇动NC膜。

6)将探针于沸水中变性10min，取出后立即置于冰浴中冷却5min。

7)将变性的探针倒入预杂交液中，充分混匀即成杂交液，使NC膜在其中68℃(温度可调整)杂交6h以上。

8)将NC膜放于洗液I(2×SSC，0.1％SDS)中室温洗涤15min，2次。

9)将NC膜放于洗液II(0.5×SSC，0.1％SDS)中68℃洗涤15min，2次。

10)置NC膜于缓冲液I(0.1mol/L Tris-Cl，0.15mol/L NaCl，pH7.5)中洗1min。

11)置NC膜于缓冲液II(Buffer I中加入2％Blocking Reagen)中反应30min，再用缓冲液I洗1min。

12)在20ml缓冲液II中加入4μl抗狄可辛抗体的碱性磷酸酶标记物，用之前经10000r/min离心5min，)，将膜放于其中37℃浸泡30min。

13)用缓冲液I洗涤NC膜；5min×5次。

14)置NC膜于缓冲液III(0.1mol/L Tris-Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl₂，pH9.5)中反应浸泡2min。

15)在适当大小的容器中加入10ml缓冲液III和100μl显色液(NBT和BCIP混合物)，将NC膜放入其中显色一定时间，加入蒸馏水终止显色反应。

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-1所示。

(6)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表3。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-1，图6-1。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

表3：PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

附图说明

图1两对引物位置及扩增片段长度

图2-1CAV探针的灵敏性检测结果、2-2MDV-pp38探针的灵敏性检测结果、2-3REV-pol探针的灵敏性检测结果A1：SPF鸡胚组织DNA，B1：1ng量的探针模板DNA，C1：100pg量的1ng量的探针模板DNA，D1：10pg量的探针模板DNA，E1：1pg量的探针模板DNA，F1：0.1pg量的探针模板DNA。

图3-1CAV探针的特异性检测结果B1：CAV探针模板DNA；C1：SPF鸡胚组织DNA；A2：MDV-pp38基因DNA；B2：REV-pol基因DNA。

图3-2MDV-pp38探针的特异性检测结果A1：MD-pp38探针DNA；B1：SPF鸡胚组织DNA；A2：CAV-vp3DNA；B2：REV-pol DNA。

图3-3REV-pol探针的特异性检测结果A1：SPF鸡胚组织DNA；B1：REV-pol探针模板DNA；Cl：MD-pp38DNA；D1：CAV-vp3DNA。

图4-1CAV-vp3两段片段的斑点杂交结果A1：探针外片段阳性PCR产物；B1：探针外片段阴性PCR产物；C1：探针阳性PCR产物；D1：探针阴性PCR产物。

图4-2：MD-pp38两段片段的斑点杂交结果A1：探针阴性PCR产物，B1：探针阳性PCR产物，C1：探针外片段阴性PCR产物，D1：探针外片段阳性PCR产物。

图4-3：REV-pol两段片段的斑点杂交结果A1：SPF鸡胚组织DNA；B1：长于探针片段DNA；C1：长于探针片段阴性PCR产物；D1：探针片段DNA；E1：探针片段阴性PCR产物

图5-1：部分样品的CAV-vp1基因的PCR-电泳结果M：2000DL；1-12：样品PCR产物结果。

图5-2：部分样品的MDV₁-pp38基因的PCR-电泳结果M：2000DL；A：阳性对照；1-7：样品PCR产物结果。

图5-3：部分样品的REV-pol基因的PCR-电泳结果M：2000DL；A：阴性对照；B：阳性对照；1-7：样品PCR产物结果。

图6-1：部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水；B1：SPF鸡胚组织DNA；C1：TE buffer；D1/F1：空白对照；E1：CAV探针模板DNA；A2-F2/A4-F4：样品DNA直接斑点杂交结果；A3-F3/A5-F5：相应样品PCR产物斑点杂交结果。

图6-2部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水；1：SPF鸡胚组织DNA；C1：马立克肿瘤组织DNA；D1：探针模板DNA；A2-D3：样品DNA直接斑点杂交结果；F3-I4：样品PCR产物斑点杂交结果。

图6-3部分样品DNA和样品PCR产物斑点杂交结果A1：双蒸水，B1：SPF鸡胚组织DNA，C1：REV探针模板DNA，D1/C4：空白对照，E1-B4：样品DNA直接斑点杂交结果，D4-H6：相应样品PCR产物斑点杂交结果。

本发明的积极意义在于本发明涉及一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中病毒感染的方法。本发明将疑是CAV感染的肉鸡样品DNA用特异性引物通过PCR扩增后，对PCR产物再用特异性核酸探针做斑点杂交，不仅能显示PCR产物的特异性，也大大提高了检出率。在22个样品的PCR产物电泳后，只有7个呈现相应大小的DNA条带，其余15个样品则不现条带。但是，对PCR产物再用CAV特异性核酸探针做斑点杂交后，全部显现阳性。结果表明，PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染，可显著提高病毒感染检测的灵敏度和特异性。

实施例

本发明提供的实施例为进一步阐述本发明，但这些实施例不构成对本发明作出限制。

实施例1

PCR结合斑点杂交技术检测自然发病鸡群中MDV的感染(以I型鸡马立克氏病病毒为例)。

1病料的收集及样品DNA的制备

取疑似鸡I型马立克氏病病毒(MDV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

2样品DNA针对MDV特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38-R2扩增出样品DNA特异性核酸片段(样品1-7)，片段长度及引物序列如表4所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表4：样品PCR所用的引物序列

3地高辛PCR法标记病毒核酸探针

(1)病毒核酸探针的标记利用MDV pp38基因克隆质粒(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型马立克氏病病毒pp38和pp24基的真核表达.中国病毒学，2005年20卷4期)，大小为981bp用于标记MDV-pp38探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表5(由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒进行地高辛标记制备探针，探针标记方法按试剂盒操作说明进行。

表5：MD病毒制备核酸探针所用的引物序列

(2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(MDV-pp38基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL CAV-vp基因1、REV-pol基因、和MDV-pp38基因(病毒特异性的DNA)点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-2)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-2)。

(3)针对MDV样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA扩增产物(样品1-7)，并设M：2000DL和阳性对照(MDV-pp38基因DNA片段)进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-2。

(4)各样品及其相应PCR产物用MD-pp38探针，进行斑点杂交检测

将提取的样品DNA和各样品的PCR产物分别点在NC膜上，经变性、中和、烤膜、预杂交、杂交、洗膜、免疫学检测后，通过斑点的有无判断结果。

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-2所示。

(5)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表3。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-2，图6-2。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

PCR-电泳和斑点杂交和PCR-斑点杂交比较结果见表6。

表6MDV₁PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

实施例2

PCR结合斑点杂交技术检测自然发病鸡群中REV病毒的感染

1病料的收集及样品DNA的制备

取疑似禽网状内皮增生病病毒(REV)感染引起不同鸡群临床表现的鸡、死鸡的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等。对组织样品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提缓冲液(100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0，0.25mmol/L EDTA，pH 8.0，0.5％SDS)和终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，55℃消化过夜。次日，按常规方法(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南第二版.科学出版社，1996)提取组织DNA，溶解于适量TE缓冲液(加适量核糖核酸酶)中，即为样品DNA。同时提取无特异性病原(SPF)鸡相应组织的DNA作阴性对照。

2样品DNA针对REV特异性核酸片段的扩增

利用提取的样品DNA分别用设计的一对引物REV-pol-F2和REV-pol-R2扩增出样品DNA特异性核酸片段(样品1-7)，片段长度及引物序列如表7所示，样品PCR扩增的片段大小长于探针，如图1所示。

表7：样品PCR所用的引物序列

3地高辛PCR法标记病毒核酸探针

(1)病毒核酸探针的标记利用本发明人保存的REV-pol(王玉，崔治中，姜世金.网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析，中国科学，C辑，2005，35：1-9)，基因大小为3482bp，用于标记REV-pol探针。用Primer5.0软件设计一对引物见表8(由上海生工合成)。采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒进行地高辛标记制备探针，作为标记DNA探针的模板，探针标记方法按试剂盒操作说明进行。

表8：REV病毒制备核酸探针所用的引物序列

(2)标记探针特异性和敏感性的测定

取适当大小的尼龙膜(罗氏公司)，将上述PCR扩增的探针模板(REV-pol基因)DNA片段稀释成500、50、5、0.5、0.05pg/μL系列浓度，分别取2μL在处理过的尼龙膜上点样。按照核酸探针标记及检测试剂盒操作说明进行预杂交、杂交和显色等步骤，以检测所制备探针的敏感性。

分别取2μL CAV-vp1、MDV-pp38和REV-pol探针模板DNA点于取适当大小的尼龙膜上，与变性的核酸探针杂交，加底物显色，以检测所制备探针的特异性。

PCR法标记的核酸探针，均只与自身病毒核酸反应显示棕褐色斑点，而与其它病毒的核酸均不显颜色，特异性很强(见图2-3)。每种核酸探针可检测到1pg量的特异性核酸片段，具有很高的灵敏度(见图3-3)。

(3)针对REV样品的PCR-电泳检测

利用提取的样品DNA分别扩增REV特异性核酸片段(样品1-7)，并设M：2000DL、阴性对照(SPF鸡相应组织的DNA作为模板的PCR产物)和阳性对照(用已知REV-pol基因为模板的PCR产物)进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图5-3。

(4)各样品及其相应PCR产物用REV-pol探针，进行斑点杂交检测

探针片段的阳性PCR产物、阴性PCR产物和长于探针片段的阳性PCR产物，斑点杂交，尼龙膜上出现了明显的褐色斑点，斑点杂交呈现阳性结果。而长于探针片段的阴性PCR产物，尼龙膜上没有出现任何斑点，斑点杂交呈现阴性结果，如图4-3所示。

(5)样品PCR电泳、斑点杂交、PCR产物斑点杂交结果

分别用PCR-电泳、斑点杂交和PCR产物斑点杂交(PCR-斑点杂交)检测各样品，检测结果见表9。PCR-电泳、斑点杂交和PCR-斑点杂交的部分结果见图5-3，图6-3。经PCR-电泳检测为阴性的某些样品，样品DNA直接经斑点杂交检测却有阳性反应；相应样品的PCR产物经斑点杂交检测却有较强的信号；某些经PCR-电泳检测目的条带模糊的样品，相应PCR产物经斑点杂交检测却有很强的信号。这些现象说明，核酸探针斑点杂交方法比PCR-电泳灵敏，运用PCR产物斑点杂交方法会更灵敏，能有效地减少漏检，充分避免PCR中的假阴性现象。

PCR-电泳和斑点杂交和PCR-斑点杂交比较结果见表9。

表9：REV PCR-电泳、斑点杂交PCR-斑点杂交结果比较

序列表

<110>山东农业大学

<120>PCR结合核酸探针斑点杂交技术检测病料中病毒感染

<160>15

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增CAV-vp1探针的引物CAV-vp1-F1：

<400>1

CAV-vp3-F1 GCATTCCGAG TGGTTACTAT TCC 23

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增CAV-vp1探针的引物CAV-vp1-R1：

<400>2

CGTCTTGCCA TCTTACAGTC TTAT 24

<210>3

<211>842

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：CAV-vp1探针：

<400>3

GCATTCCGAG TGGTTACTAT TCCATCACCA TTCTAGCCTG TACACAGAAA GTCAAGATGG 60

ACGAATCGCT CGGCTTCGCT CGCGATTCGT CGAAGGCGGG GGGCCGGAGG CCCCCCGGTG 120

GCCCCCCTCC AACGAGTGGA GCATGTACAG GGGGGTACGT CATCCGTACA GGGGGGTACG 180

TCACAAAGAG GCGTTCCCGT ACAGGGGGGT ACGTCACGCG TACAGGGGGG TACGTCACAG 240

CCAATCAGAA GCTGCCACGT TTCGAAAGTG ACGTTTCGAA AATGGGCGGC GCAAGCCTCT 300

CTATATATTG AGCGCACATA CCGGTCGGCA GTAGGTATAC GCAAGGCGGT CCGGGTGGAT 360

GCACGGGAAC GGCGGACAAC CGGCCGCTGG GGGCAGTGAA TCGGCGCTTA GCCGAGAGGG 420

GCAACCTGGG CCCAGCGGAG TCGCGCAGGG GCAAGTAATT TCAAATGAAC GCTCTCCAAG 480

AAGATACTCC ACCAGGACCA TCAACGGTGT TCAGGCCACC AACAAGTTCA CGGCCGTTGG 540

AAACCCCTCA CTGCAGAGAG ATCCGGATTG GTATCGCTGG AATTACAATC ACTCTATCGC 600

TGTGTGGCTG CGCGAATGCT CGCGCTCCCA CGCTAAGATC TGCAACTGCG GACAATTCAG 660

AAAGCACTGG TTTCAAGAAT GTGCCGGACT TGAGGACCGA TCAACCCAAG CCTCCCTCGA 720

AGAAGCGATC CTGCGACCCC TCCGAGTACA GGGTAAGCGA GCTAAAAGAA AGCTTGATTA 780

CCACTACTCC CAGCCGACCC CGAACCGCAA GAAGGTGTAT AAGACTGTAA GATGGCAAGA 840

CG 842

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测CAV样品PCR的引物CAV-vp1-F2：

<400>3

CAV-vp3-F2 AGGAGCCGGT AATGAAGAGC 20

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测CAV样品PCR的引物CAV-vp1-R2：

<400>5

CAV-vp3-R2 GGGCGGGGGT TGTGAAAG 18

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增MD-pp38探针的引物MD-pp38-F1：

<400>6

AGGCAGGGCA TGGGAAAACA GAAG 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增MD-pp38探针的引物MD-pp38-R1：

<400>7

ACCGACTAAC ATACCAGCGA AAAA 24

<210>8

<211>641

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：MD-pp38探针：

<400>8

AGGCAGGGCA TGGGAAAACA GAAGCGGAAT GCGCCGAGGA CGGCGAGAAA TGCGGGGACG 60

CCGAGATGAG CGCTTTGGAT CGGGTCCAGA GGGACCGGTG GAGATTCAGT TCTCCGCCCC 120

CTCACTCTGG AGTCACGGGG AAGGGGGCTA TTCCAATAAA GGGTGATGGG AAGGCGATAG 180

AATGCCAGGA GCTAACCGGA GAGGGAGAGT GGCTGTCACA GTGGGAGGAG CTACCGCCTG 240

AGCCCCGGAG GTCAGGGGAT GAACATCTTG ACGAAAGTCG GTATGCGAAA CAAACCGAAA 300

GGGGTAGCTC TACGGGGAAA GAAGAGGGAG ATGGTATGAA GCAGATGGGG GAGCTTGCCC 360

AGCAGTGCGA AGGAGGAACA TACGCGGACT TGCTTGTCGA AGCAGAGCAA GCTGTTGTAC 420

ATTCCGTTCG CGCATTAATG CTGGCCGAAA GACAAAACCC AAATATATTG GGGGAGCATT 480

TGAATAAAAA ACGGGTTCTT GTACAACGAC CCCGTACTAT TCTATCCGTG GAGTCAGAGA 540

ATGCAACAAT GCGTTCTTAT ATGCTGGTTA CATTGATCTG TTCTGCAAAA TCATTATTAC 600

TAGGATCGTG CATGTCATTT TTCGCTGGTA TGTTAGTCGG T 641

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测MDV1样品PCR的引物MD-pp38-F2：

<400>9

CAGGGCATGG GAAAACAGA 19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测MDV1样品PCR的引物MD-pp38-R2：

<400>10

CACTCCCCCA ACGACAATG 19

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增REV-pol探针的引物REV-pol-F1：

<400>11

GGACTCAATT CCCGTATCAG A 21

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于扩增REV-pol探针的引物REV-pol-R1：

<400>12

TCTTCCCAGC GACCTTTAC 19

<210>13

<211>775

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：REV-pol探针：

<400>13

GGACTCAATT CCCGTATCAG AGGTGCGGCG CCAGGGGAAC ACTGGGAGGC GGATTTCACA 60

GAAATGATAA CAGCCAAAGG GGGGTATAAA TACCTGCTTG TACTGGTAGA CACATTCTCG 120

GGCTGGGTAG AGGCATATCC AGCAAAGAGA GAAACCTCCC AGGTGGTAAT TAAGCATCTA 180

ATTCATGATA TTATCCCCAG GTTTGGGTTA CCGGTCCAGA TCGGGTCCGA CAATGGGCCG 240

GCCTTTGTGG CAAAAGTGAC ACAGCAGTTG TGTGAGGCCC TAAATGTCTC TTGGAAGCTC 300

CATTGTGCAT ACCGACCTCA AAGCTCGGGA CAGGTAGAAA GGATGAACCG AACCCTGAAG 360

GAGACCATCG CTAAATTGAG GAAAGAGACA GGAGGGGACT GGGTCTCCCT CCTCCCTCAG 420

GCTTTGCTCC GGGCACGATG TACCCCCGGG AGGGAGGGAT TGTCACCCTT CGAGATATTA 480

TATGGTCTCA AGCCTCCTGT AGTTCCCCGT GTAGGATGTG ACAAGCTTGC CAGCATAACC 540

AACCAAACCC TGCTTAAGTC CCTACAGGCC CTCCAAGCTA CTAGGTCTCT GGCTCGGGCA 600

ACGCTGCGCG ACCAACTGCC CCAGAAAGAA GCTCAGCAAG ACCGTACCCC ACTGTTCCAA 660

CCTGGTGACC TCGTCTTCGT TAAGAAGCAC GACTTCCAGC AGTTGGGGCC ACGGTGGGAC 720

GGACCCTACA CTGTAGTCCT CAGTACCCCC ACCGCGGTAA AGGTCGCTGG GAAGA 775

<210>14

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测REV样品PCR的引物REV-pol-F2：

<400>14

GACGGGCAGA TGAGGTG 17

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<223>对人工序列的描述：设计用于检测REV样品PCR的引物REV-pol-R2：

<400>15

ATCGGAGGTT GGTGAGA 17

Claims

1.一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中病毒的方法，其特征在于所述病料取自病死动物的肝脏、脾脏、心脏、肾脏、胸腺、骨髓等器官，使用针对可疑病毒的特异性引物对病料DNA进行PCR扩增后，再用该可疑病毒的特异性核酸探针对PC扩增产物做斑点杂交；

其中可疑病毒为禽网状内皮增生病毒；扩增病料DNA的引物REV-pol-F2和REV-pol-R2，其序列如序列表中序列14和15所示；制备检探针的引物REV-pol-F1和REV-pol-R1其序列如序列表中序列11和12所示。

2.如权利要求1所述一种PCR结合核酸探针斑点杂交检测病料中病毒的方法，其特征在于在利用PCR技术结合斑点杂交检测病料时，用于扩增病料DNA的引物REV-pol-F2和REV-pol-R2必须在探针标记用引物REV-pol-F1和REV-pol-R1之外，即在被标记核酸探针DNA序列之外。