CN102465173A - 青枯菌2号小种的特异性pcr检测方法 - Google Patents

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田茜
冯洁
徐进
许景升
潘哲超
张昊
张丽勍
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Abstract

本发明专用于检测青枯菌2号小种，属于植物检疫技术领域。该方法根据基因序列比对获得的青枯菌2号小种与其它小种间的差异序列，自主设计了1对特异性引物，可特异性地从青枯菌2号小种菌株中扩增出片段长度为481bp的单一目的条带。本发明采用1对特异性引物，进行一次PCR扩增反应，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，即可直接根据产物片断的长度检测出青枯菌2号小种。

Description

青枯菌2号小种的特异性PCR检测方法
(一)技术领域
本发明“青枯菌2号小种的特异性PCR检测方法”，专用于检测引起香蕉青枯病的青枯菌2号小种，属于植物检疫技术领域，与分子检测技术有关。
(二)背景技术
植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界性重大病害。青枯菌寄主范围广泛，可侵染50多个科的450余种植物。特别是造成香蕉产业毁灭性损失的青枯菌2号小种，在2007年被列为《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》的第316号检疫对象。
由青枯菌2号小种引起的香蕉青枯病是一种严重危害香蕉生产的细菌性病害。该病于19世纪90年代在特立尼达岛上的大蕉品种“Moko”上爆发，给其带来了毁灭性的损失，几乎使岛上感病大蕉品种“Moko”濒临灭绝，该病由此得名为“Moko disease”。直至1911年Rorer才确定了引起香蕉青枯病的病原菌为Bacillus musae。1960年Budenhagen和Sequeira等将香蕉青枯病菌划归假单胞菌属(Pseudomonas)的2号生理小种。1995年Yabuuchi正式将青枯菌更名为Ralstonia solanacearum。在分类学地位上，香蕉青枯病菌被定义为青枯菌2号生理小种和生化变种I(race 2/biovar I)，归属于青枯菌演化型II型的序列变种3、4和6。
自然条件下，香蕉青枯病菌的寄主范围仅限于芭蕉科芭蕉属的香蕉、大蕉和海里康属的海里康。该病是典型的维管束病害，侵染后造成植株萎蔫，受侵染的果实内部呈褐色干腐状。在中、南美地区，该病是其香蕉产业发展的重要限制因子。根据Phelps的报道香蕉细菌性枯萎病造成圭亚那香蕉产量上的损失高达74％。上世纪60年代，该病的再次大爆发几乎彻底摧毁了特立尼达的香蕉出口产业。半数以上位于秘鲁亚马逊盆地的香蕉种植园受到香蕉细菌性枯萎病的影响；在墨西和哥伦比亚，香蕉细菌性枯萎病所造成香蕉的产量损失问题迄今为止一直未能得到有效解决。
目前用于检测青枯菌的检测技术主要包括分子检测(单一PCR检测、复合PCR检测及实时荧光定量PCR检测)，血清学鉴定(荧光原位杂交、免疫荧光、酶联免疫吸附剂检测、双抗夹心间接酶联免疫吸收剂检测)及生物测定等。其中分子检测体系有EPPO推荐的Seal(1993)和Pastrik(2000)分别基于病原菌的16sRNA编码基因建立的检测体系，可以分别从青枯菌中扩增出288bp和553bp的片段。但这两对引物都仅能在种的水平上特异性鉴定出青枯菌。此外，实时荧光定量PCR技术也被应用于青枯菌种水平的快速分子检测。Prior等(2005)采用细菌基因组DNA抑制性差减杂交技术，获得了青枯菌2号小种不同于其它小种的差异性片段。并从中筛选出4个片段作为检测靶标，根据其设计了4对特异性引物，建立了香蕉序列变种特异性复合PCR(Moko-specific multiplex PCR，Mmx)检测体系，用于快速检测香蕉菌株序列变种3、4和6。但迄今为止，国内外尚未见采用单一扩增片段于种以下水平鉴定青枯菌2号小种的报道。
(三)发明内容
技术问题    本发明的目的是设计获得能够特异性鉴定青枯菌2号小种的单一分子检测靶标，达到快速、准确、低成本检测香蕉青枯病菌的目的。
本发明是这样实现的：通过对GenBank中登录的青枯菌1号小种GMI1000、2号小种MOLK2以及3号小种IPO1609的全基因序列进行比对，根据2号小种特异性序列设计检测引物，后经PCR筛选后获得了1对青枯菌2号小种特异性检测引物3577F/R。经过PCR反应后，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，根据产物大小可直接鉴定出是否为青枯菌2号小种。
技术方案
用于检测青枯菌2号小种的PCR方法，包括：
1)用于检测青枯菌2号小种的样品制备
使用天根公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA。
2)用于检测青枯菌2号小种的特异性引物
引物对序列为：
3577F：5’-CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3’
3577R：5’-CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3’
3577F/R引物对可从青枯菌2号小种菌株中特异性扩增出片段大小为481bp的单一产物。
3)PCR扩增的反应体系
在25μl反应液中，包含0.4μM 3577F，0.4μM 3577R，12.5μl 2×TaqMix(包含0.1U TaqPolymerase/μl，400μM dNTP，20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2)，1μl DNA做模板。
4)PCR扩增程序
94℃预变性5min，94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，25个循环，最后72℃延伸10min。
4)PCR产物的鉴定
取2μl PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离30分钟，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
有益效果
本发明通过序列比对技术，并根据筛选获得的差异序列设计了1对引物，仅通过单一PCR反应，即可简单、快速、可靠地鉴定出青枯菌2号小种。与国内外同类方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1)操作简便快捷。整个过程简单、快速、高效。
2)特异性强，应用范围广。
3)成本低。本方法所用DNA提取技术和PCR过程均为常规试剂，价格低廉。
因此本方法实用性强，可满足植物检疫的需要。
(四)附图说明
图1：引物对3577F/R对参试菌株的PCR扩增鉴定结果
M：分子量标准Markl；1-19，香蕉青枯病菌株；20-36，来自其他14种不同寄主的青枯菌株。
(五)具体实施方式
19株香蕉青枯病菌株及来自其他14种不同寄主的17株青枯菌株的检测鉴定。
1)参试菌株DNA的提取
参试的19株香蕉青枯病菌株(RUN74，RUN264，RUN450，RUN457，RUN462，RUN92，RUN465，RUN17，RUN291，RUN286，RUN276，RUN292，RUN9，RUN96，RUN394，RUN419，RUN428，RUN454，RUN301)皆由港口截获，其他来自14种不同寄主的17株青枯菌株(GMI1000，PO1，PO41，PO45，P9，Tm1，C1，Tb23，Z1，M13，E1，O1，B2，Bd11，Pe1，Sn1，Ssp1)皆为本实验室保存的菌株。将各参试菌株在NA培养基(葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉汁3g，酵母0.5g，琼脂18g，蒸馏水1000ml)上，28℃，培养3天。使用天根公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA。
2)特异性引物的合成
3577F：5’-CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3’
3577R：5’-CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3’
759F：5’-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3’
760R：5’-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3’
由上海生工公司合成。
3)PCR扩增反应
在25μl反应液中，包含0.4μM 3577F，0.4μM 3577R，0.4μM 759F，0.4μM 760R，12.5μl2×TaqMix(包含0.1U Taq Polymerase/μl，400μM dNTP，20mM Tris-HCl，100mM KCl，3mM MgCl2)，1μl DNA做模板。
4)PCR扩增程序
94℃预变性5min，94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，25个循环，最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定
取2μl PCR产物用1.5％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离30分钟，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
利用本发明设计的引物3577F/R，以19株香蕉青枯病菌株及来自其他14种不同寄主的17株青枯菌株为模板，进行PCR扩增。结果如图2所示，在第1-19泳道扩增出青枯菌2号小种特异性条带481bp；20-36泳道未扩增出这条特异性片段。两图中280bp的条带为青枯菌种特异性扩增引物759F/760R扩增出的青枯菌特异性条带，以在种水平上证明参试菌株皆为青枯菌。
Figure ISA00000336066600011

Claims (4)

1.用于检测青枯菌2号小种的特异性引物3577F/R，其引物序列为：
3577F：5’-CGCCAGCGCGGTTTCACCTA-3’
3577R：5’-CCCCATGCACTATTCCTGGTTCCC-3’
3577F/R引物对在青枯菌2号小种中特异性扩增出481bp的产物。
2.使用青枯菌2号小种特异性分子检测靶标对病原菌进行快速分子检测的方法，其步骤包括：
1)抽提被测菌的DNA，制备DNA样品；
2)用权利要求1中的所示的引物对步骤1)中的DNA样品进行PCR扩增，得到权利要求1中的特异性大小的DNA片段。
3)根据步骤2)得到的DNA片段，确定被测菌是否为青枯菌2号小种。
3.根据权利要求2所述的青枯菌2号小种的特异性PCR检测方法，其中的PCR步骤包括：
1)扩增反应体系：在25μl反应液中，包含50ng模板DNA，0.4μM 3577F，0.4μM 3577R，12.5μl 2×TaqMix(包含0.1U Taq Polymerase/μl，400μM dNTP，20mM Tris-HCl，100mMKCl，3mM MgCl2)。
2)PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，25个循环，最后72℃延伸10min。
3)电泳检测：反应完成后，取2μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据扩增产物大小判定结果。
4.青枯菌2号小种特异性分子检测靶标在检测青枯菌2号小种中的应用。
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