CN103451298B

CN103451298B - 一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103451298B
Application number: CN201310405495.1A
Authority: CN
Inventors: 杨宇红; 张吉祥; 凌键; 陈国华; 茆振川; 谢丙炎
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-09-09
Also published as: CN103451298A

Abstract

本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒，包括检测引物、10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul；还公开了检测方法，包括如下步骤，(1)提取植物组织或土壤 DNA；（2）对DNA进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果，本发明的优点，提供一种准确性高、操作简便、特异性强且灵敏度高的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的快速检测与鉴定试剂盒及其方法。

Description

一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，具体是一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

现在公知的甘蓝枯萎病菌就是尖孢镰刀菌粘团专化型，尖孢镰刀菌粘团专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Conglutinans）引起的甘蓝枯萎病是一种毁灭性的土传病害，在全球大部分甘蓝产区均有发生，该病自2001年在我国首次报道发生以来，先后在河北省张家口市、山西省晋中市和山西省大同市均有发生，在我国的发生呈蔓延趋势，并逐年加重，已成为影响我国甘蓝品质和产量的重要病害。根据危害寄主甘蓝的品种，可分为2个生理小种，目前我国甘蓝生产主要受到1号生理小种的危害。该病自2001年在我国延庆地区发现以来，发病面积逐年增加，已成为威胁我国甘蓝生产的重要因素。目前生产上缺少有效防控甘蓝枯萎病的方法，因此，快速稳定的病原菌鉴定与检测体系是对该病害进行综合防控的基础。现有甘蓝枯萎病菌生理小种的鉴定与检测技术仍然以传统形态学鉴定和鉴别寄主鉴定为主。但是形态学鉴定需要经验极其丰富的专家操作并且生理小种之间形态学差异较小，难以得到准确的鉴定结果。而利用鉴别寄主鉴定生理小种费时费力且需要大量的品种。随着生命科学的高速发展，包括AFLP，RFLP，以及SCAR在内的分子检测技术在病原菌的应用得到植物病理学家的重视，基于各生理小种的特异基因设计特异性引物已经广泛应用于枯萎病菌生理小种的分子检测。

植物病理学家已基于特异性引物成功建立了快速检测番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. ciceris），香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense），莴苣枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lactucae），香石竹枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. dianthi），豌豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.pisi）和唐菖蒲枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. gladioli）不同生理小种的分子鉴定体系。利用这一技术在对香蕉枯萎病进行分子诊断时的灵敏度达到0.2μg 新鲜菌丝的水平。同时该技术也在种子，土壤以及发病组织中病原菌的检测上得到了充分应用。三重PCR检测技术也在香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种鉴定中得到了应用。甘蓝枯萎病菌生理小种的检测与鉴定技术尚未见报道，本研究在甘蓝枯萎病菌1，2号生理小种全基因组测序数据基础上，筛选出两小种各自的特异引物并引入尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106S为内标，建立起一步三重PCR快速检测甘蓝枯萎病菌1，2号生理小种的技术。

发明内容

为解决上述检测甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种技术存在的缺陷，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测试剂盒及其检测方法，其目的是针对现有技术中甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的生物学检测方法所需周期长，且目前尚未有甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种分子检测方法的问题，通过对甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种进行全基因组测序，并通过比较基因组学的方法找出甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的特异基因组片段，然后这针对甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的特异片段碱基序列分别设计特异引物，用于带甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，并提供一种准确性高、操作简便、特异性强且灵敏度高的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种快速分子检测的试剂盒，该试剂盒可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，对于甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种引起病害显症之前的早期检测和诊断具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明公开了一种甘蓝枯萎病菌的检测试剂盒，该试剂盒包括，浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异引物1#77R、1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异引物2#40R、2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul。检测引物的序列：

W106R的序列5'- GCAGTCGTACGTCATCGACC -3'、

W106S的序列5'- CCATGGCAGATGGCGAGTCA -3'，

1#77R的序列5'- AAATCCAAGGTGCGAAGA -3'，

1#77S的序列5'- CCAGGCTACACTAATACAACAG -3'，

2#40R的序列5'- CTTTCGCTTCTCCCTTCA -3'，

2#40S的序列5'- AACGCATCGTCTTCTATT -3'。

其中W106R、W106S的序列出自于中国农业科学，名称为香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与检测的文献，作者为李慧敏。

本发明还公开了采用所述试剂盒检测甘蓝枯萎病菌的方法，该方法包括如下步骤，(1)利用NuClean Plant Gen DNA Kit试剂盒提取被甘蓝枯萎病菌1号或2号生理小种感染的植物组织DNA，利用PowerSoil DNA Isolation Kit 试剂盒方法提取被甘蓝枯萎病菌侵染的土壤DNA；

（2）采用检测试剂盒对（1）步分离出的DNA进行PCR扩增；

（3）将6μl步骤（2）的PCR扩增产物用质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果，当同时扩增出两条大小分别为729bp和1927bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌1号生理小种，当同时扩增出两条大小分别为729bp和309bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌2号生理小种。

所述步骤（2）的具体操作方法是，①取（1）步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合，该试剂盒的试剂包括浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R/W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异引物1#77R/1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异引物2#40R/2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul；

②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94 °C 预变性 5 min；94°C变性 40 sec；60°C退火 30 sec；72 °C延伸 1 min 30sec； 35 个循环最后 72 °C延伸10 min。

本发明方法适用于植物组织和土壤样品中甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

１、特异性强：本发明检测方法是利用比较基因组学方法对甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种之间以及和其他枯萎病菌的全基因组序列进行分析得到甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的特有片段，根据特异片段设计引物进行检测。已经对源于来自我国北京、山西省及国外的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种和尖孢镰刀菌近缘种及其他常见病菌的验证，结果具有很强的特异性；

2、实用性好：本发明所设计出的一系列特异性引物，可用于带甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌土壤和发病植物组织中存在的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

3、操作简便快速：应用本发明方法，对带甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的土壤样品和植物组织进行病原菌DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程在数小时内完成，而现有的得需要数天才能完成。

附图说明

图1为甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种特异性PCR产物电泳图；

图中，M：DNA Marker；1-10：甘蓝枯萎病菌1号生理小种基因组DNA；11-12：甘蓝枯萎病菌2号生理小种基因组DNA；13-19：其他枯萎病菌基因组DNA；20-23：常见其他病原菌基因组DNA；24：清水对照。

图2为发病植株样品中甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测电泳图；

图中，M：DNA Marker；1：甘蓝枯萎病菌1号生理小种基因组DNA；2：甘蓝枯萎病菌2号生理小种基因组DNA；3-5：发病甘蓝叶片总DNA；6-8：发病甘蓝根部总DNA；9：健康甘蓝总DNA；10清水对照。

图3为土壤样品中甘蓝枯萎病菌检测电泳图；

图中，M：Trans2K plus Marker；1：甘蓝枯萎病菌1号生理小种基因组DNA；2：甘蓝枯萎病菌2号生理小种基因组DNA ；3-9：发病甘蓝根际土壤总DNA；10：未发病甘蓝根际土壤总DNA；11：清水对照。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明内容。

实施例一：本发明的甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的检测试剂盒，该试剂盒包括，浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R/W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异引物1#77R/1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异引物2#40R/2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99%的超纯水20ul。检测引物的序列：

W106R的序列5'- GCAGTCGTACGTCATCGACC -3'、

W106S的序列5'- CCATGGCAGATGGCGAGTCA -3'，

1#77R的序列5'- AAATCCAAGGTGCGAAGA -3'，

1#77S的序列5'- CCAGGCTACACTAATACAACAG -3'，

2#40R的序列5'- CTTTCGCTTCTCCCTTCA -3'，

2#40S的序列5'- AACGCATCGTCTTCTATT -3'。

（2）采用检测试剂盒对（1）步分离出的DNA进行PCR扩增；

在确定本发明的检测引物时，是将设计的序列一次次的重复本发明方法，最终能够使甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异的扩增出1927bp产物的引物以及能使甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异的扩增出309bp产物的引物以及引入能对所有枯萎病菌扩增出729bp产物的枯萎病菌通用引物作为本试剂盒中的检测引物组合，并且还需大量试验说明本检测引物组合的特异性，利用本实施例方法作检测的特异性试验：利用本发明的引物除了对来自我国北京、山西、甘肃等省及国外的甘蓝枯萎病菌1号生理小种DNA可特异地扩增出两条大小分别为729bp和1927bp产物，对甘蓝枯萎病菌2号生理小种DNA可特异的扩增出两条大小分别为729bp和309bp的产物，对其他枯萎病菌只扩增出一条大小为729bp的产物外，检测了4种其他常见致病真菌和1种致病卵菌等菌株DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性，见图1。

实施例二：利用实施例一的方法检测发病甘蓝植株组织中的枯萎病菌。

1. 样品采集：植物组织样品采自甘肃省榆中县甘蓝蔬菜基地，

2. DNA提取及检测：同实施例一。

3. 检测结果：结果可见图2，感病植株总DNA可见到扩增出两条清晰的大小分别为729bp和1927bp的特异条带，而健康植株总DNA和水中未见扩增出条带，因而判断发病组织感染的是甘蓝枯萎病菌1号生理小种。检测的时间为5-6个小时。

实施例三：利用实施例一的方法检测土壤样品中的甘蓝枯萎病菌。

1.样品采集：土壤样品采自甘肃省榆中县甘蓝蔬菜基地。

2.DNA提取及检测：

土壤样品采用MO BIO公司PowerSoil DNA Isolation Kit 试剂盒所述方法提取DNA，按上述试剂盒实施的方法进行PCR扩增，PCR反应体系20μl，浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R/W106S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌1号生理小种特异引物1#77R/1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl 的甘蓝枯萎病菌2号生理小种特异引物2#40R/2#40S各1μl ，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM 的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的 Taq聚合酶0.4μl、

包括2.0μl 10×PCR反应缓冲液，10 mM dNTPs 0.5μl,5U/μl Easy Taq 聚合酶0.4μl，1pmol/μl引物W106R/W106S各1μl，10pmol/μl引物1#77R/1#77S各1μl， 10pmol/μl引物2#40R/2#40S各1μl ，5ng/μl DNA模板1μl，dd H2O补足20μl。PCR扩增程序为：94 °C 5 min；94°C 40 sec；60°C 30 sec；72 °C 1 min 30sec； 35 cycles， 72 °C 10 min。电泳检测扩增产物。

3.检测结果；结果见图3，见到发病植株根际土壤总DNA扩增出两条清晰的大小分别为729bp和1927bp的特异条带，未发病植株根际土壤只扩增出一条大小为729bp的条带，水中未见扩增出条带，因而判断土壤样品存在甘蓝枯萎病菌1号生理小种。

以上所述，并非对本发明内容作任何限制，凡是根据本发明内容技术实质上的修改，均仍属于本发明的保护范围内。

Claims

1.一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的试剂包括检测引物、10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99％的超纯水20ul；检测引物包括浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度均为10pmol/μl的甘蓝枯萎病菌1号生理小种的上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，浓度均为10pmol/μl的甘蓝枯萎病菌2号生理小种上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl；1#77R的序列5'-AAATCCAAGGTGCGAAGA-3'，1#77S的序列为5'-CCAGGCTACACTAATACAACAG-3'，2#40R的序列为5'-CTTTCGCTTCTCCCTTCA-3'，2#40S的序列为5'-AACGCATCGTCTTCTATT-3'，W106R的序列5'-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3'、W106S的序列5'-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3'。

2.一种采用权利要求1所述试剂盒检测甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)利用NuClean Plant Gen DNA Kit试剂盒提取被甘蓝枯萎病菌1号或2号生理小种感染的植物组织DNA，利用PowerSoil DNA IsolationKit试剂盒方法提取被甘蓝枯萎病菌侵染的土壤DNA；

(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增:①取(1)步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合，该试剂盒的试剂包括浓度为1pmol/μl的枯萎病菌通用引物W106R、W106S各1μl，浓度为10pmol/μl的甘蓝枯萎病菌1号生理小种上游引物1#77R、下游引物1#77S各1μl，浓度为10pmol/μl的甘蓝枯萎病菌2号生理小种上游引物2#40R、下游引物2#40S各1μl，10×PCR Easy Taq缓冲液2.0μl、10mM的dNTPs0.5μl、活性酶浓度为5U/ml的Taq聚合酶0.4μl、甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种阳性对照DNA各1μl、重量浓度≥99％的超纯水20ul；

②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40sec；60℃退火30sec；72℃延伸1min 30sec；35个循环，最后72℃延伸10min；

(3)将6μl步骤(2)的PCR扩增产物用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果，当同时扩增出两条大小分别为729bp和1927bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌1号生理小种，当同时扩增出两条大小分别为729bp和309bp产物时，可判断植物组织或土壤中存在甘蓝枯萎病菌2号生理小种。