CN104152588A - 柑桔黄脉病毒的巢式rt-pcr引物组、检测方法及试剂盒 - Google Patents

柑桔黄脉病毒的巢式rt-pcr引物组、检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组、检测方法及试剂盒,属于分子生物学技术领域。本发明提供了柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR外巢引物对CYVCV-1f、CYVCV-1r和内巢引物对CYVCV-2f、CYVCV-2r，利用外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产物为模板用内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得469bp的PCR产物的待测样品即为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。本发明操作简便、重复性好、准确性高，其灵敏度是常规RT-PCR的100倍，对处于潜伏期的病毒也能及时检测到。

Description

柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组、检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及植物流行病害监测领域，尤其涉及一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组、检测方法及试剂盒。
背景技术
柑桔黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的柑桔黄脉病是一种严重威胁柑桔生产的重要病害，主要分布于印度、巴基斯坦、土耳其等国，对柠檬等柑桔品种造成了极其严重的损失。我国近年来在云南、四川等柠檬主产区也相继发现了该病，其发生呈不断扩大、加重的趋势。由于目前尚无药剂可有效防治柑桔黄脉病，因此使用无病毒苗木、以及铲除田间病树是重要的防治手段。为此需要建立一种CYVCV的快速、准确、灵敏的检测技术方法以满足我国柑桔产业发展的需要。
CYVCV为柑桔病毒属(Mandarivirus)成员，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为670-700nm×13-14nm。CYVCV基因组含有7529个核苷酸，可能包含有6个开放读码框(ORF)。目前在检测CYVCV时主要采用以酸橙等作为指示植物进行鉴定，但检测周期长。虽然目前常规RT-PCR已开始运用于CYVCV检测，但其对田间早期病树的检测效果不够理想，灵敏度还有待提高。巢式RT-PCR的检测灵敏度远高于常规RT-PCR，但目前尚未将该技术运用于CYVCV的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组。
一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组，由外巢引物对和内巢引物对组成：
外巢引物对：CYVCV-1f：ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG；
CYVCV-1r：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA；
内巢引物对：CYVCV-2f：AAACCTAATCGGTCCTGTG；
CYVCV-2r：GAGACACCCTACTTCAGCG。
本发明的另一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法。
本发明的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，是以待测样品总RNA为模板，应用权利要求1所述的外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产物为模板用权利要求1所述的内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得469bp的PCR产物的待测样品为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。
所述第一轮RT-PCR反应体系为:浓度为20～50ng/μL的解链后的模板RNA溶液1.0μL，10mM的外巢引物CYVCV-1f和CYVCV-1r各0.1μL，5μL 2×1stepbuffer，0.4μL PrimScript 1Step Enzyme Mix，3.4μL DEPC水；所述第一轮RT-PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环20次；所述第二轮PCR反应体系为：第一轮RT-PCR扩增产物10μL，10mM的内巢引物CYVCV-2f和CYVCV-2r各0.2μL，2.5μL 10×PCR缓冲液，0.2μL浓度为5U/μL的rTaq，16.9μL DEPC水；所述第二轮PCR反应条件为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，循环30次。
本发明的再一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒。
本发明的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，含有上述引物组：外巢引物对CYVCV-1f、CYVCV-1r和内巢引物对CYVCV-2f、CYVCV-2r。
除了上述特异引物对外，该试剂盒还含有进行PCR扩增所需要的试剂，该试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。
本发明的有益效果是：本发明操作简便、重复性好、准确性高，其灵敏度是常规RT-PCR的100倍，对处于潜伏期的病毒也能及时检测到。本发明可快速、准确、灵敏地对CYVCV样品进行检测，尤其适用于对田间柑桔黄脉病病树的早期监控，对田间柑桔黄脉病预防和防治具有重要的有意义。
附图说明
图1为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测结果示意图；其中1为水对照，2为负对照，3-5为感病植株样品，6为5kb+1.5kb标准分子量。
图2为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR引物组的特异性检测图；其中1为水对照，2为负对照，3-10依次为柑桔衰退病、柑桔碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、黄龙病、溃疡病、柑桔黄脉病植株样品，11为5kb+1.5kb标准分子量。
图3为柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测灵敏度测试图；其中1和10为5kb+1.5kb标准分子量，2-9依次为柑桔黄脉病样品4稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍后巢式RT-PCR检测结果，11-18依次为柑桔黄脉病样品4稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108后常规RT-PCR检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的实验材料：
本实验所用分别感染柑桔衰退病、柑桔碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、柑桔黄脉病、黄龙病、溃疡病的植株样品来源于中国农业科学院柑桔研究所保存毒源。
主要试剂：
RNAiso Plus(TaKaRa公司，日本)，PrimScript 1Step Enzyme Mix(TaKaRa，日本)，rTaq(TaKaRa，日本)，胶纯化试剂盒(Omega公司，美国)，pMD-19T(TaKaRa，日本)，Solution I(TaKaRa，日本)，感受态细胞JM109(TaKaRa，日本)。
实施例1柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测特异性验证
1用于检测柑桔黄脉病毒的引物组
根据GenBank中CYVCV(JX040635.1)的基因组序列，针对其3’端的保守区域设计了CYVCV巢式RT-PCR检测方法所需的外巢引物对(CYVCV-1f和CYVCV-1r)，以及内巢引物对(CYVCV-2f和CYVCV-2r)。并在GenBank中通过Blast比对，保证了引物的特异性。引物序列见表1。
表1巢式RT-PCR检测CYVCV所用引物序列
2提取待测样品总RNA
选取表现CYVCV典型症状的叶片和脱毒苗叶片各15-30mg分别作为正对照和负对照。将叶片在液氮中研磨后加入1mL RNAiso Plus，斡旋后室温放置5min，经12000g 4℃离心5min，吸取上清并加入200μL氯仿，斡旋混匀。经12000g 4℃离心15min后，吸取上清并加入700μL异丙醇。颠倒混匀后室温静置10min，经12000g4℃离心10min后，弃上清，并用1mL75％乙醇清洗沉淀。沉淀干燥后用50μL DEPC水溶解沉淀。-20℃保存备用。
3巢式RT-PCR扩增
3.1第一轮RT-PCR扩增
将1μL抽提的总RNA与1μL DEPC水混合，95℃下解链3min后置于冰上，并加入8μL反应液，其中包括10mM的外巢引物CYVCV-1f和CYVCV-1r各0.1μL，2.4μL DEPC水，5μL 2×1step buffer(200mMpH8.8Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，10mM dNTP，0.02M DTT，5mM MgCl2)，0.4μL PrimScript 1Step Enzyme Mix。反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环20次。
3.2第二轮PCR扩增
在第一轮RT-PCR扩增结束后在离心管中加入20μL反应液，其中包括10mM的内巢引物CYVCV-2f和CYVCV-2r各0.2μL，2.5μL10×PCR缓冲液(100mMTris-HCl pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2)，浓度为5U/μL的rTaq 0.2μL，16.9μLDEPC水。反应条件为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，循环30次。
3.3结果观察与验证
在第二轮PCR结束后取5μL扩增产物与2μL 6×loading buffer(36％甘油，0.035％二甲苯兰，0.05％溴酚蓝，30mM EDTA)混合，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，感染CYVCV的样品3-5均可以检测到一条469bp的特异性条带，水对照1和从健康植株中提取的总核酸2均不能检测到该特异性条带。
使用胶纯化试剂盒将该特异性条带切下后进行纯化。取1μL纯化产物与1μL pMD-19T，5μL Solution I，3μL DEPC水混合。16℃反应30min后加入50μL感受态细胞JM109轻轻混匀，冰上放置30min。42℃水浴热激45sec，冰浴2min。沿管壁轻轻加800μL室温平衡后的LB液体培养基(1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)，37℃150rpm复苏培养1h。吸取50μL菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1％氨苄青霉素，1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)中，37℃过夜培养。挑取单个白斑在1ml LB液体培养基(1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)中37℃150rpm培养24h。取200μL菌液进行序列测定，该序列经Blast比对后与GenBank中CYVCV(JX040635.1)基因组中第6959-7424位核苷酸的相似性为99.9％，由此证明扩增产物为CYVCV。
3.4特异性鉴定
按照前述“2提取待测样品总RNA”的方法分别提取感染了柑桔衰退病、柑桔碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、柑桔黄脉病、黄龙病、溃疡病样品的总RNA，使用前述建立的巢式RT-PCR体系对获得的总RNA进行检测，对检测结果进行电泳检测，结果如图2所示，只有柑桔黄脉病样品呈现阳性，说明该检测方法对柑桔黄脉病检测具有特异性。
实施例2柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测灵敏度检测
对图1中感染柑桔黄脉病的样品4的总RNA模板进行10倍梯度稀释至108倍，分别采用常规RT-PCR和实施例1中的巢式RT-PCR进行扩增检测，常规RT-PCR得到612bp的特异性扩增片段，电泳结果如图3所示，总RNA稀释到105倍时常规RT-PCR无法进行检测，总RNA稀释到106倍时巢式RT-PCR仍可检测出CYVCV,由此可见巢式RT-PCR检测的灵敏度是常规RT-PCR的100倍。柑桔黄脉病毒的常规RT-PCR所用引物为：上游引物：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’；下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。

Claims (5)

1.一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR引物组，其特征在于：由外巢引物对和内巢引物对组成：
外巢引物对：CYVCV-1f：ATCATGAGGTTCCATACCACTCGAG；
CYVCV-1r：CTCGAGTGGTATGGAACCTCATGA；
内巢引物对：CYVCV-2f：AAACCTAATCGGTCCTGTG；
CYVCV-2r：GAGACACCCTACTTCAGCG。
2.一种柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：是以待测样品总RNA为模板，应用权利要求1所述的外巢引物对进行第一轮RT-PCR扩增，再以第一轮RT-PCR扩增产物为模板用权利要求1所述的内巢引物对进行第二轮PCR扩增，检测第二轮PCR产物，获得469bp的PCR产物的待测样品为受到柑桔黄脉病毒侵染的样品。
3.根据权利要求2所述的柑桔黄脉病毒的巢式RT-PCR检测方法，其特征在于：所述第一轮RT-PCR反应体系为:浓度为20～50ng/μL的解链后的模板RNA溶液1.0μL，10mM的外巢引物CYVCV-1f和CYVCV-1r各0.1μL，5μL 2×1stepbuffer，0.4μL PrimScript 1Step Enzyme Mix，3.4μL DEPC水；所述第一轮RT-PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环20次；所述第二轮PCR反应体系为：第一轮RT-PCR扩增产物10μL，10mM的内巢引物CYVCV-2f和CYVCV-2r各0.2μL，2.5μL 10×PCR缓冲液，0.2μL浓度为5U/μL的rTaq，16.9μL DEPC水；所述第二轮PCR反应条件为：94℃2min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，循环30次。
4.含有权利要求1所述引物组的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒。
5.根据权利要求4所述的柑桔黄脉病毒巢式RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：还含有进行PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP和/或PCR缓冲液试剂。
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