CN104745725B - 同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法。引物对包括CYVCV检测引物对：CYVCV‑4f/CYVCV‑‑4r；CCDaV检测引物对：CCDV‑2f/CCDV‑2r；COX基因检测引物对：Ant1/Sen1。同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，包括步骤：(1)提取柑橘待测样品的总核酸；(2)将提取到的总核酸进行多重PCR扩增；(3)对扩增产物进行检测是否含有CYVCV、CCDaV和COX基因的扩增片段，从而判断样品是否感染CYVCV或CCDaV。本发明方法检测特异性强，灵敏度高，稳定性好，工序简单，节约成本，适用于大规模推广。

Description

同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于分子生物学的病毒检测领域，具体的说，涉及一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，我国柑橘栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑橘产业的发展和优势产业带的确立，柑橘的种植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑橘贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑橘病害传入我国的机率不断加大。
柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)为柑桔病毒属(Mandarivirus)的RNA病毒，病毒粒子呈弯曲线状，大小约为670-700nm×13-14nm。CYVCV基因组含有7529个核苷酸，可能包含有6个开放读码框(ORFs)。柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV)为双生病毒属(Geminiviridae)的DNA病毒，病毒粒子呈双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。CCDaV基因组为3.4-3.6kb，具有5个ORFs。由CYVCV和CCDaV引起的柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病是重要的柑橘病毒类病害，主要分布于巴基斯坦、印度、土耳其等国，对柠檬、粗柠檬、杂柑等柑橘品种造成了极其严重的损失。近年来我国相继在云南、四川等地发现了柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病，其发生呈不断扩大、加重的趋势。由于这两种病毒病均为在我国首次发现，因此尚缺乏完善的检测技术。
传统的柑橘病毒病检测主要采用指示植物鉴定的方法，但时间长，需半年左右的时间，而且由于柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病在指示植物柠檬上引起的症状相似，因此需要同时使用葡萄柚、大翼莱檬等多种指示植物来加以区分。虽然我国目前已建立了CYVCV的常规PCR检测方法，但是常规检测技术一次只能检测一种病原物，且无法检测CCDaV。鉴于CYVCV和CCDaV在田间时有复合侵染发生，因此为提高检测效率，急需建立一种能够快速、准确、灵敏、经济，并同时检测CYVCV和CCDaV的PCR检测方法。多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，因其快捷、准确、经济的特点，为实现同时检测CYVCV和CCDaV提供了一种重要的选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的能同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对、试剂盒及方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的目的之一是提供一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对，包括CYVCV检测引物对：CYVCV-4f/CYVCV--4r；CCDaV检测引物对：CCDV-2f/CCDV-2r；COX基因检测引物对：Ant1/Sen1；所述引物对的序列如下：
CYVCV-4f：5’-ATTACAGTGGTAGGGAGGAG-3’，
CYVCV-4r：5’-CCCAGCAGGACGAGTTAG-3’，
CCDV-2f：5’-ACAAGACTATCATAGCACGAGACG-3’，
CCDV-2r：5’-TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC-3’，
Ant1：5’-CAATATCATTGATGTCCAATACT-3’，
Sen1：5’-ATTTATGTAATGGATTTAAGACCC-3’。
本发明的另一目的是提供一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测试剂盒：主要包括前述引物对CYVCV-4f/CYVCV--4r、CCDV-2f/CCDV-2r和Ant1/Sen1，以及PCR反应试剂。
本发明的目的还在于提供一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取柑橘待测样品的总核酸；
(2)将提取到的总核酸进行多重PCR扩增；PCR扩增所用引物为权利要求1中所述引物对CYVCV-4f/CYVCV--4r，CCDV-2f/CCDV-2r和Ant1/Sen1；
(3)对步骤(2)所得扩增产物进行检测是否含有CYVCV、CCDaV和COX基因的扩增片段，从而判断样品中的总核酸是否被提取出来，且样品是否感染CYVCV或CCDaV。
所述步骤(2)中PCR的反应体系为：10μM CYVCV引物CYVCV-4f/4r各0.2μL，10μMCCDaV引物CCDaV-2f/2r各0.5μL，10μM内参基因引物Ant1/Sen1各0.1μL，5μL 2×1stepbuffer，0.4μL PrimScript 1Step Enzyme Mix，1.0μL DEPC水。PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环30次。
所述步骤(2)中引物对CYVCV-4f/CYVCV--4r扩增产物片段大小为1314bp，引物对CCDV-2f/CCDV-2r扩增产物片段大小为916bp，引物对Ant1/Sen1扩增产物片段大小为372bp。
所述步骤(3)中对扩增产物进行检测的方法为：将扩增产物进行1.0-1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现1314bp、916bp和372bp的条带，如果同时出现1314bp和372bp的条带，说明样品感染了CYVCV；如果同时出现916bp和372bp的条带，说明样品感染了CCDaV；如果同时出现1314bp、916bp和372bp三条条带，说明样品同时感染了CYVCV和CCDaV。如果未扩增出372bp的条带，说明样品总核酸提取失败，需重新提取样品的总核酸。
本发明的有益效果是：建立了一种多重PCR检测方法，该方法能够通过一步PCR同时检测CYVCV和CCDaV，并且还能检测出样品中的看家基因从而进一步提高了检测结果的可靠性；该方法避免了常规PCR需要对CYVCV和CCDaV分别进行检测的重复劳动，检测特异性强，灵敏度高，稳定性好，工序简单，节约成本，适用于大规模推广；为及时掌握田间柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病的发生、分布情况，同时缩短热处理-茎尖嫁接脱毒苗的检测周期，推进苗木无病毒化进程，确保我国柑橘产业安全，提供了重要的技术保障。
附图说明
图1为一步法PCR同时检测样品中CYVCV和CCDaV的电泳结果图。
图2为一步法PCR同时检测CYVCV和CCDaV特异性检测图。
图3为本发明方法检测田间样品部分电泳结果图。
图4为普通PCR对田间样品进行CYVCV检测部分电泳条带图。
图5为普通PCR对田间样品进行CCDaV检测部分电泳条带图。
具体实施方式
实施例1设计特异引物
分别根据GenBank中CYVCV(ID号：JX040635.1)的外壳蛋白基因，CCDaV(ID号：KF561253)的移动蛋白基因，以及COX(ID号：L22244.1)3’端的保守区域设计了多重PCR中检测CYVCV、CCDaV和内参COX的引物对
CYVCV-4f/CYVCV-4r，CCDV-2f/CCDV-2r和Ant1/Sen1。并在GenBank中通过Blast比对，保证了引物的特异性。引物序列见表1。
表1一步法PCR同时检测CYVCV和CCDaV所用引物序列
实施例2一步法PCR同时检测CYVCV和CCDaV
一、提取待测样品总核酸
选取表现CYVCV和CCDaV典型症状的叶片(西南大学柑橘研究所的毒源库保存的毒源)各5-10mg作为正对照，选取无病毒苗木的叶片5-10mg作为负对照。分别提取正、负对照样品的总核酸：将叶片在液氮中研磨后依次加入60μl TES缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.002MEDTA，0.0347M SDS pH8.0)和60μl饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀。70℃水浴5-10min。室温下13000rpm离心5min，吸取40μl上清液加入由Sephadex G-50-80(Sigma公司，美国)构成的微柱中5000rpm离心4min，用一新无菌eppendof管收集洗脱液。-20℃保存。
二、多重PCR扩增
将1μL前述抽提的正、负对照的总核酸与1μL DEPC水混合，95℃下解链2min后置于冰上，加入反应液，反应液中包括10μM的CYVCV引物对CYVCV-4f/4r各0.2μL，10μM的CCDaV引物对CCDaV-2f/2r各0.5μL，10μM的内参基因COX引物对Ant1/Sen1各0.1μL，5μL 2×1stepbuffer(200mM pH8.8Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X-100，10mM dNTP，0.02M DTT，5mM MgCl2)(TaKaRa公司，日本)，0.4μL PrimScript1StepEnzyme Mix(TaKaRa公司，日本)；用DEPC水将总体积加为8μL。反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环30次。
三、结果观察与验证
取5μL前述扩增产物与2μL 6×loading buffer(36％甘油，0.035％二甲苯兰，0.05％溴酚蓝，30mM EDTA)混合，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，其中1--4依次为：水对照、健康植株样品、感染CYVCV和CCDaV的样品、分子量标准。感染CYVCV和CCDaV的样品3可以检测到1314bp(CYVCV)和916bp(CCDaV)的特异性条带，以及372bp的内参基因条带；从健康植株中提取的总核酸2只能检测出372bp的内参基因条带；水对照1不能检测到任何特异性条带。
使用胶纯化试剂盒(TaKaRa公司，日本)将CYVCV和CCDaV相应的特异性条带切下后进行纯化。取1μL纯化产物与1μL pMD-19T(TaKaRa公司，日本)，5μL Solution I(TaKaRa公司，日本)，3μL DEPC水混合。16℃反应30min后加入50μL感受态细胞JM109(TaKaRa公司，日本)轻轻混匀，冰上放置30min。42℃水浴热激45sec，冰浴2min。沿管壁轻轻加800μL室温平衡后的LB液体培养基(1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)，37℃150rpm复苏培养1h。吸取50μL菌液涂布于含抗生素的LB培养基(0.1％氨苄青霉素，1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)中，37℃过夜培养。挑取单个白斑在1ml LB液体培养基(1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨)中37℃150rpm培养24h。取200μL菌液进行序列测定，将获得的序列分别与GenBank中CYVCV(JX040635.1)、CCDaV(KF561253)和COX(L22244.1)中相应的序列进行Blast比对，其相应核苷酸的相似性为100％，由此证明扩增产物分别为CYVCV、CCDaV和内参COX。
四、特异性鉴定
按照前述“一、提取待测样品总核酸”的方法分别提取感染了柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、柑橘黄脉病、柑橘褪绿矮化相关病、黄龙病、溃疡病样品和健康植株中的总核酸，使用前述建立的多重PCR体系和方法对获得的总核酸进行检测。电泳结果如图2所示，图中泳道0--13分别为水对照、柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、黄龙病、溃疡病、柑橘黄脉病、柑橘褪绿矮化相关病、柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化相关病交叉感染、柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化相关病交叉感染、柑橘褪绿矮化相关病和柑橘黄脉病样品；14为分子量标准，15为健康植株样品。从图中可看出，只有感染CYVCV和CCDaV的样品可以检测出1314bp(CYVCV)和916bp(CCDaV)的特异性条带，以及372bp的内参基因条带；从感染其它病害的样品以及健康植株中提取的总核酸只能检测出372bp的内参基因条带；水对照不能检测到任何特异性条带；说明本方法设计的引物对CYVCV和CCDaV具有特异性，检测结果准确可靠。
实施例3应用一步法PCR检测田间样品的CYVCV和CCDaV
分别采用普通PCR和本发明方法对50个田间样品进行检测，田间样品来源于西南大学柑橘试验基地。
一、应用本发明一步法PCR检测田间样品的CYVCV和CCDaV
本发明方法检测结果显示，50个样品中，用本发明方法检测出CYVCV阳性样品(具有1314bp的条带)17个,CCDaV阳性样品(具有916bp的条带)9个，其中5个样品同时感染了CYVCV和CCDaV(同时具有1314bp和916bp的条带)，电泳图片如图3所示(图中泳道1为水对照，10为同时感染CYVCV和CCDaV的正对照，11为健康植株对照，26为分子量标准，其余为检测样品)。
二、用普通PCR方法检测田间样品的CYVCV和CCDaV
1、检测CYVCV：用普通PCR方法对50个田间样品进行CYVCV的检测，步骤如下：
(1)总核酸提取：提取方法同前述“一、提取待测样品总核酸”中的方法。
(2)RT-PCR扩增：取1μL总核酸提取液加入1μL灭菌去离子水于离心管中，在94℃变性，冰水浴2min后，加入RT-PCR扩增所需试剂，利用PCR仪进行扩增。RT-PCR扩增所需体系如下：2×Buffer(200mM pH8.8Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，1％Triton X-100，10mMdNTP，0.02M DTT)(Promega公司，美国)5μL，5mM MgSO40.3μL，10U RT/Taq酶(Promega公司，美国)0.2μL，10μM正向引物CYVCV-5f 0.2μL，10μM反向引物CYVCV-5r 0.2μL，加灭菌去离子水2.1μL补足体积至10μL。PCR扩增条件为：42℃，30min；94℃，2min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，40sec，40个循环；72℃，5min。所用引物序列为：CYVCV-5f：5’-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3’；CYVCV-5r：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。
(3)电泳检测：将步骤(2)中的扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，感染有CYVCV的阳性样品和正对照能够扩增出612bp的特异性条带，负对照和健康植株不能检测出该特异性条带。部分样品的电泳条带如图4所示，1为标准分子量，2为水对照，22为正对照，23为负对照，3--21为待测样品；在50个田间样品中检测出CYVCV阳性样品17个。
2、检测CCDaV：用普通PCR方法对50个田间样品进行CCDaV的检测，步骤如下：
(1)总核酸提取：提取方法同前述“一、提取待测样品总核酸”中的方法。
(2)RT-PCR扩增：取1μL总核酸提取液加入2.5μL 10×PCR缓冲液(200mMpH8.8Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton@X-100，10mM dNTP)(TaKaRa公司，日本)，10μM正反向引物CCDV-3f和反向引物CCDV-3r各0.1μL，0.2μL 4U/μLTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)，加水至总体积20μL。PCR扩增条件为：94℃，2min；94℃，30sec，50℃，30sec，72℃，40sec，40个循环；72℃，5min。所用引物序列为：CCDV-3f：5’-GAAGGAGATTAGCTGGCATAAGT-3’；CCDV-3r：5’-CTGTTTAAGTCCATCCCAATAACT-3’。
(3)电泳检测：将步骤(2)中的扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，感染有CCDaV的阳性样品和正对照能够扩增出444bp的特异性条带，负对照和健康植株不能检测出该特异性条带。部分样品的电泳条带如图5所示，1和21为分子量标准；2为水对照；29为正对照；30为负对照；其余为待测样品。在50个田间样品中检测出CCDaV阳性样品9个。结合普通PCR检测CYVCV的结果，有5个样品同时感染了CYVCV和CCDaV。
普通PCR的检测结果与本发明方法检测结果完全吻合。以上试验结果证明，本发明的多重PCR方法不仅具有检测准确、灵敏度高的优点，且可同时对CYVCV和CCDaV疑似样品进行快速检测，无需像普通PCR方法那样分别对两种病毒进行检测，避免了重复操作，减少工作量，提高了检测效率，有利于快速摸清田间这两种新发病害的分布和发生情况，同时缩短热处理-茎尖嫁接脱毒苗的检测周期，有助于推进苗木无病毒化进程，确保我国柑橘产业安全。

Claims (9)

1.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对，其特征在于：包括CYVCV检测引物对：CYVCV‐4f/CYVCV‐4r；CCDaV检测引物对：CCDV‐2f/CCDV‐2r；COX基因检测引物对：Ant1/Sen1；所述引物对的序列如下：
CYVCV‐4f：5’‐ATTACAGTGGTAGGGAGGAG‐3’，
CYVCV‐4r：5’‐CCCAGCAGGACGAGTTAG‐3’，
CCDV‐2f：5’‐ACAAGACTATCATAGCACGAGACG‐3’，
CCDV‐2r：5’‐TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC‐3’，
Ant1：5’‐CAATATCATTGATGTCCAATACT‐3’，
Sen1：5’‐ATTTATGTAATGGATTTAAGACCC‐3’。
2.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测试剂盒，其特征在于：主要包括权利要求1中所述的引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐4r、CCDV‐2f/CCDV‐2r和Ant1/Sen1，以及PCR反应试剂。
3.一种同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)提取柑橘待测样品的总核酸；
(2)将提取到的总核酸进行多重PCR扩增；PCR扩增所用引物为权利要求1中所述引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐‐4r，CCDV‐2f/CCDV‐2r和Ant1/Sen1；
(3)对步骤(2)所得扩增产物进行检测是否含有CYVCV、CCDaV和COX基因的扩增片段，从而判断样品是否感染CYVCV或CCDaV。
4.如权利要求3所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR的反应体系为：10μM CYVCV引物CYVCV‐4f/4r各0.2μL，10μM CCDaV引物CCDaV‐2f/2r各0.5μL，10μM内参基因引物Ant1/Sen1各0.1μL，5μL 2×1step buffer，0.4μLPrimScript 1Step Enzyme Mix，1.0μL DEPC水。
5.如权利要求3或4所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR反应条件为：50℃30min，94℃2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，循环30次。
6.如权利要求5所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中引物对CYVCV‐4f/CYVCV‐‐4r扩增产物片段大小为1314bp，引物对CCDV‐2f/CCDV‐2r扩增产物片段大小为916bp，引物对Ant1/Sen1扩增产物片段大小为372bp。
7.如权利要求5所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中对扩增产物进行检测的方法为：将扩增产物进行1.0‐1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现1314bp、916bp和372bp的条带，如果同时出现1314bp和372bp的条带，说明样品感染了CYVCV；如果同时出现916bp和372bp的条带，说明样品感染了CCDaV；如果同时出现1314bp、916bp和372bp三条条带，说明样品同时感染了CYVCV和CCDaV。
8.一种如权利要求1所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测引物对在柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病检测中的应用。
9.一种如权利要求2所述的同时检测CYVCV和CCDaV的一步法PCR检测试剂盒在柑橘黄脉病和柑橘褪绿矮化病检测中的应用。
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