CN103160593B - 一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法。本发明所提供的用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c检测的引物,是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。本发明所提供的大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的检测方法,是以待测物的基因组DNA为模板,用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增(反应体系和条件见[0008]和[0009]),如扩增产物中含有对应的616bp的条带,则该待测物中含有大豆疫霉菌无毒基因Avr1c,反之则不含有。本发明方法是一种快速、简便、准确的分子检测手段,完全可以应用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr1c的一种特异性检测方法,能够为大豆疫霉菌无毒基因Avr1c提供快速简便的检测方法,属于生物技术领域。
背景技术
由Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann引起的大豆疫病是严重影响大豆生产的危险性、毁灭性病害之一,是中国对外公布的Ⅰ类危险性检疫对象,一般造成5%~10%的产量损失,高感品种几乎绝产。全球每年由于大豆疫病导致的直接经济损失高达十几亿美元(Wrather et al.,2001)。中国由于分离技术上的原因,直到1989年才由沈崇尧和苏彦纯首次在东北大豆主产区分离成功,证实了该菌在中国的存在(沈崇尧和苏彦纯,1991)。此后的10多年内,该菌相继在河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、黑龙江、吉林、内蒙古、湖北、新疆等省被发现并分离(朱振东等,2003)。由于病原菌具有土传的特性和极强的生存能力,其引起的大豆疫病在世界大豆主产区呈扩大蔓延趋势,成为世界性大豆病害。
大豆疫病是基因对基因病害。由于病原菌的无毒基因与品种的抗病基因是一一对应的,因此研究大豆疫霉菌的无毒基因,可以指导大豆抗病基因的科学合理利用,对防治该病具有重要意义。目前,已经发现并证实的大豆疫霉菌无毒基因有12个。大豆疫霉菌无毒基因的检测方法目前大多采用传统检测方法,即依据菌株对一系列含单个抗病基因鉴别寄主的接种反应,不能发病的,即含有与该抗病基因对应的无毒基因。该方法不仅工作量大,费时费力,接种过程繁琐,而且环境以及鉴别寄主发育状况均会对接种结果产生影响,导致结果不准确。因此开发一种快速、简便而准确的方法来检测无毒基因非常必要。与传统方法相比分子标记方法具有操作简便、迅速、不受外界环境因素影响,短时间内即可处理大量样品等诸多优点,因而具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的分子标记、方法及其引物。
本发明提供的技术方案是:一种检测大豆疫霉菌菌株中无毒基因Avr1c的特异性引物,是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
序列表中的序列1由18个脱氧核苷酸组成,序列2由17个脱氧核苷酸组成。
本发明所提供的检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的方法,是以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板,用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增,并以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为对照,如扩增产物中具有与Avr1c-Avr1c同等位置的条带,则说明该待测物中含有大豆疫霉菌无毒基因Avr1c,反之则不含有。
优化的PCR扩增反应体系为:待测物的基因组DNA模板 100 ng,10 pmol/μl的上游引物(序列表中序列1) 1.0 μl,10 pmol/μl的下游引物(序列表中序列2) 1.0 μl,10 pmol/μl 的dNTP 0.3 μl,10×PCR缓冲液 2.5 μl,25 mM的MgCl2 1.8 μl,Taq DNA聚合酶0.2 μl,以去离子水补足至20.0 μl。
优化的PCR反应条件为:先94℃ 3 min;随后94℃ 30 sec,56℃ 30 sec,72℃ 60 sec,共40个循环;再72℃ 10 min。通过浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有616 bp目的条带。
应用本发明可以快速检测一株大豆疫霉菌中是否含有无毒基因Avr1c。
本发明以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为材料,利用AFLP(选择性扩增限制性片段)方法结合克隆测序以及引物设计,筛选出适于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性引物,以该引物进行PCR分析,可以快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c。本发明方法是一种快速、简便、准确的分子检测手段。
附图说明
图1为大豆疫霉菌总DNA提取流程;
图2为分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c(pR1)和avr1c-avr1c(ps1)的大豆疫霉菌菌株及其杂交F2代部分菌系总DNA电泳图谱;
图3为含有无毒基因Avr1c-Avr1c(pR1)和avr1c-avr1c(ps1)的大豆疫霉菌菌株及F2代部分菌系总DNA AFLP预扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱;
图4为分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株特异性引物筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱;图中奇数泳道为pRx (Avr1c-Avr1c),偶数泳道为ps1 (avr1c-avr1c)。其中1、2泳道所用引物为ECG/MAG,3、4泳道所用引物为EAT/MAC,5、6泳道所用引物为EGC/MAT,7、8泳道所用引物为EAC/MAG。A、B、C、D、E为特异性条带,且A、B、C、E为显性纯合子所特有,D为隐性纯合子所特有。
图5 为差异条带的二次扩增琼脂糖凝胶电泳图谱;
图6 为引物有效性检测琼脂糖凝胶电泳图谱;
图7 为引物特异性检测琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明,但并不是对本发明的限制,仅仅做示例说明。
实施例1
大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的AFLP分子标记试验
1. 材料为经过反复接种试验严格筛选出来的两个大豆疫霉菌菌株pR1(无毒基因型Avr1c-Avr1c)和ps1 (无毒基因型avr1c-avr1c)以及从它们杂交F1代自交产生的F2代群体中随机选取的50株大豆疫霉菌菌株;采自东北三省的几百个大豆疫霉菌中随机选取的50个菌株。鉴别寄主是含有单个抗大豆疫霉根腐病基因(Rps基因)的大豆疫霉菌毒力鉴别品种(系)及感病对照品种Sloan(rps)其中Williams 79含有Rps1c基因,感病对照品种Sloan不含任何已知抗病基因(rps)。以上大豆品种(系)用于鉴定供试大豆疫霉菌亲本及其杂交后代的无毒基因型。
2. 菌体培养
菌丝的收集:取直径为9 cm的胡萝卜(CA)平板培养基,将一整张玻璃纸用剪刀均匀剪成直径为6 cm的圆形,灭菌。用灭菌镊子将灭菌后的玻璃纸贴在CA平板上,在玻璃纸中央接菌。25 ℃温箱中培养5~6 d。收集菌丝体立即用液氮研磨提取DNA或放入-80 ℃保存。
3. 菌体总DNA的提取
按照图1所示流程提取菌体总DNA。
4. 基因组DNA的酶切连接体系
用紫外分光光度计检测提取的DNA浓度,将不同浓度的DNA样品统一稀释,最终浓度均稀释为100 ng/μl,用于做酶切连接。AFLP酶切连接体系见表1。
表1 AFLP酶切连接体系(50.0 μl)
样品加入EP管中后,充分混匀,37℃水浴12 h观察结果。
预扩增反应体系为20 μl,见表2。
表2 预扩增反应体系(20.0 μl体系)
引物E00和M00由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列为E00:5′-GACTGCGTACCAATTC-3′;M00:5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′。
在选定预扩增体系后,对程序的循环数进行设置,经过试验筛选出效果最佳的程序如下:
表3 预扩增程序
取4 μl预扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图3。
选择性扩增体系为20.0μl,见表4。
表4选择性扩增体系(20.0 μl体系)
注:E+2、M+2为选择性扩增所用的在预扩增引物基础上加两个碱基(E+GC/M
+AT)的核苷酸引物。
在扩增体系确定的情况下,设置如下选择性扩增程序,是经过筛选后效果最佳的程序:
表5选择性扩增程序
取4μl选择性扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
5. AFLP扩增产物银染检测
将聚丙烯酰胺凝胶准备好,在玻璃板上对样品进行标记,点入5 μl的选择性扩增产物样品,插上电源,75 W电泳1 h。电泳结束后,进行固定、漂洗和显影,最终得到清晰条带,见图4。
6. 差异条带的回收纯化与克隆测序
将目标条带从聚丙烯酰胺凝胶上回收后用试剂盒纯化,回收片段连接到pMD18-T载体上,转化于DH5α大肠杆菌(Escherichia coli)菌株,获得重组克隆。将阳性克隆菌液测序(序列3)。将测序结果经CNKI比对,除去多余载体以及选择性扩增引物序列,之后利用Primier 5.0进行SCAR(序列特异性扩增区)引物设计。筛选出能特异性检测出大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的引物。
7. 引物的检测
引物的有效性检测
利用引物 F:5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAA-3′和R:5′- ATTAGGGCAATATCATA-3′对pR1、ps1以及它们的50个F2代菌系进行检测(反应体系和条件见[0009]和[0010])。检测结果如图6,50个杂交F2代菌系扩增出条带和未扩增出条带的比例为39:11,与接种鉴定结果完全符合,即接种鉴定表现无毒的菌系均扩增出条带,接种鉴定表现有毒的菌系均未扩增出条带,说明这对引物对于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c具有有效性。
引物的特异性检测
从采自东北三省的几百株株大豆疫霉菌中随机选取50株进行接种验证,接种结果显示,无毒:有毒=41:9。利用引物 F:5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAA-3′和R:5′- ATTAGGGCAATATCATA-3′对这50株大豆疫霉菌进行PCR扩增(反应体系和条件见[0009]和[0010]),结果有条带和没有条带的比例为41:9(图7),接种鉴定结果与分子鉴定结果100%符合,说明引物具有特异性。
以上结果表明:
本发明引物对大豆疫霉菌无毒基因Avr1c具有很强的特异性,可以特异地检测出含有无毒基因Avr1c的大豆疫霉菌。
本发明确立的大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的检测方法在1d内完成(DNA提取4~5h,PCR扩增3h,电泳1h),并且检测结果特异性强、灵敏度高、稳定性好。
序列表
序列1:AGCCAGCAGAGAGTAGAA
序列2:ATTAGGGCAATATCATA
序列3: 5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAATTCTACTCTCTGCTGGCTGGGATCGAGCAATCGAACAGGCGTTTTATCTCAGGTTGTCAACCTTGATCGCGTGAAAAACGTTGTCCCAGCTGGCTGCCAGTCATCCGAGGCCATGACTTCGTTCATCTGGAGGGGGATTATGGGACGACTTTTGCGAGTGCCAGATTGAGCTAAGTCAGCCTACGTCACGCCGTGTAAGCTTTTGCCAGTATTAATAAAGAGGTTGCCACAACTCTTCCGACACCGTCACACGCAATACGAGGGGCTCATTACATGTTGGCATCAAGTACAGTGGATTTCGTGGCCGCTGCCAAGTTCCTGGTGGACAAAACTCTCGAGGGTGAAATCCTAAACGACAAGGAGCAGAAGCGCCGTGAGCACCGTATCGGCATGGTGGCCTTCCGCCGTAAGAGGGATGTTGCGGGGCAGCAAGACCCGCCCCGACCTCGGTATTACTAGCCTAGTGAGCCGACGAGGCGAGCGGAACGGGTGCGTAACAACTAAAAACAATAGCAACACAATTATTATGGTATTGTCCCACTACAATTATATATTATTGGAAGTTCATGAAACCAATACAATATGATATTGCCCTAAT-3′。
Claims (2)
1.一种用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c检测的引物,是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2.一种检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的方法,是以大豆疫霉菌基因组DNA为待测物,用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物在特定PCR反应体系和特定PCR扩增条件下对待测物进行PCR扩增,扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,如检测到616 bp的条带,则表明待测物中含有无毒基因Avr1c,所述特定PCR反应体系为:待测物大豆疫霉菌基因组DNA 100 ng,10 pmol/μl的序列表中序列1所示的上游引物和10 pmol/μl的序列表中序列2所示的下游引物各1.0 μl,10 pmol/μl 的dNTP 0.3 μl,10×PCR缓冲液 2.5 μl,25 mM的MgCl2 1.8 μl,Taq DNA聚合酶0.2μl,以灭菌去离子水补足至20.0 μl;所述特定PCR扩增条件为:先94℃ 3 min;随后94℃ 30 sec,56℃ 30 sec,72℃ 60 sec,共40个循环;再72℃ 10 min。
3. 权利要求2所述的方法在检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c中的应用。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1992014844A1 (en) * | 1991-02-25 | 1992-09-03 | California Institute Of Biological Research | Consensus sequence primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
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WO1992014844A1 (en) * | 1991-02-25 | 1992-09-03 | California Institute Of Biological Research | Consensus sequence primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
CN101942520A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-01-12 | 南京农业大学 | 大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的标记 |
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