CN103160593B - 一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法。本发明所提供的用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c检测的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。本发明所提供的大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的检测方法，是以待测物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增（反应体系和条件见[0008]和[0009]），如扩增产物中含有对应的616bp的条带，则该待测物中含有大豆疫霉菌无毒基因Avr1c，反之则不含有。本发明方法是一种快速、简便、准确的分子检测手段，完全可以应用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的快速检测。

Description

一种大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性检测方法

技术领域

本发明涉及了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)无毒基因Avr1c的一种特异性检测方法，能够为大豆疫霉菌无毒基因Avr1c提供快速简便的检测方法，属于生物技术领域。 

背景技术

由Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann引起的大豆疫病是严重影响大豆生产的危险性、毁灭性病害之一，是中国对外公布的Ⅰ类危险性检疫对象，一般造成5%~10%的产量损失，高感品种几乎绝产。全球每年由于大豆疫病导致的直接经济损失高达十几亿美元（Wrather et al.，2001）。中国由于分离技术上的原因，直到1989年才由沈崇尧和苏彦纯首次在东北大豆主产区分离成功，证实了该菌在中国的存在（沈崇尧和苏彦纯，1991）。此后的10多年内，该菌相继在河南、山东、安徽、江苏、浙江、福建、黑龙江、吉林、内蒙古、湖北、新疆等省被发现并分离（朱振东等，2003）。由于病原菌具有土传的特性和极强的生存能力，其引起的大豆疫病在世界大豆主产区呈扩大蔓延趋势，成为世界性大豆病害。 

大豆疫病是基因对基因病害。由于病原菌的无毒基因与品种的抗病基因是一一对应的，因此研究大豆疫霉菌的无毒基因，可以指导大豆抗病基因的科学合理利用，对防治该病具有重要意义。目前，已经发现并证实的大豆疫霉菌无毒基因有12个。大豆疫霉菌无毒基因的检测方法目前大多采用传统检测方法，即依据菌株对一系列含单个抗病基因鉴别寄主的接种反应，不能发病的，即含有与该抗病基因对应的无毒基因。该方法不仅工作量大，费时费力，接种过程繁琐，而且环境以及鉴别寄主发育状况均会对接种结果产生影响，导致结果不准确。因此开发一种快速、简便而准确的方法来检测无毒基因非常必要。与传统方法相比分子标记方法具有操作简便、迅速、不受外界环境因素影响，短时间内即可处理大量样品等诸多优点，因而具有广泛的应用前景。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的分子标记、方法及其引物。 

本发明提供的技术方案是：一种检测大豆疫霉菌菌株中无毒基因Avr1c的特异性引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。 

序列表中的序列1由18个脱氧核苷酸组成，序列2由17个脱氧核苷酸组成。 

本发明所提供的检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的方法，是以待测大豆疫霉菌的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，并以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为对照，如扩增产物中具有与Avr1c-Avr1c同等位置的条带，则说明该待测物中含有大豆疫霉菌无毒基因Avr1c，反之则不含有。 

优化的PCR扩增反应体系为：待测物的基因组DNA模板 100 ng，10 pmol/μl的上游引物（序列表中序列1） 1.0 μl，10 pmol/μl的下游引物（序列表中序列2） 1.0 μl，10 pmol/μl 的dNTP 0.3 μl，10×PCR缓冲液 2.5 μl，25 mM的MgCl₂ 1.8 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，以去离子水补足至20.0 μl。 

  优化的PCR反应条件为：先94℃ 3 min；随后94℃ 30 sec，56℃ 30 sec，72℃ 60 sec，共40个循环；再72℃ 10 min。通过浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有616 bp目的条带。 

  应用本发明可以快速检测一株大豆疫霉菌中是否含有无毒基因Avr1c。 

  本发明以分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株为材料，利用AFLP（选择性扩增限制性片段）方法结合克隆测序以及引物设计，筛选出适于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的特异性引物，以该引物进行PCR分析，可以快速检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c。本发明方法是一种快速、简便、准确的分子检测手段。 

附图说明

图1为大豆疫霉菌总DNA提取流程； 

图2为分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c（pR₁）和avr1c-avr1c（ps₁）的大豆疫霉菌菌株及其杂交F₂代部分菌系总DNA电泳图谱；

图3为含有无毒基因Avr1c-Avr1c（pR₁）和avr1c-avr1c（ps₁）的大豆疫霉菌菌株及F₂代部分菌系总DNA AFLP预扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

图4为分别含有无毒基因Avr1c-Avr1c和avr1c-avr1c的大豆疫霉菌菌株特异性引物筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；图中奇数泳道为pR_x (Avr1c-Avr1c)，偶数泳道为ps₁ (avr1c-avr1c)。其中1、2泳道所用引物为ECG/MAG，3、4泳道所用引物为EAT/MAC，5、6泳道所用引物为EGC/MAT，7、8泳道所用引物为EAC/MAG。A、B、C、D、E为特异性条带，且A、B、C、E为显性纯合子所特有，D为隐性纯合子所特有。

图5 为差异条带的二次扩增琼脂糖凝胶电泳图谱； 

图6 为引物有效性检测琼脂糖凝胶电泳图谱；

 图7 为引物特异性检测琼脂糖凝胶电泳图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅做示例说明。 

  实施例1 

大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的AFLP分子标记试验

1. 材料为经过反复接种试验严格筛选出来的两个大豆疫霉菌菌株pR₁（无毒基因型Avr1c-Avr1c）和ps₁ （无毒基因型avr1c-avr1c）以及从它们杂交F₁代自交产生的F₂代群体中随机选取的50株大豆疫霉菌菌株；采自东北三省的几百个大豆疫霉菌中随机选取的50个菌株。鉴别寄主是含有单个抗大豆疫霉根腐病基因（Rps基因）的大豆疫霉菌毒力鉴别品种（系）及感病对照品种Sloan（rps）其中Williams 79含有Rps1c基因，感病对照品种Sloan不含任何已知抗病基因（rps）。以上大豆品种（系）用于鉴定供试大豆疫霉菌亲本及其杂交后代的无毒基因型。

2. 菌体培养 

菌丝的收集：取直径为9 cm的胡萝卜（CA）平板培养基，将一整张玻璃纸用剪刀均匀剪成直径为6 cm的圆形，灭菌。用灭菌镊子将灭菌后的玻璃纸贴在CA平板上，在玻璃纸中央接菌。25 ℃温箱中培养5~6 d。收集菌丝体立即用液氮研磨提取DNA或放入-80 ℃保存。

3. 菌体总DNA的提取 

按照图1所示流程提取菌体总DNA。

4. 基因组DNA的酶切连接体系 

用紫外分光光度计检测提取的DNA浓度，将不同浓度的DNA样品统一稀释，最终浓度均稀释为100 ng/μl，用于做酶切连接。AFLP酶切连接体系见表1。

表1 AFLP酶切连接体系（50.0 μl） 

样品加入EP管中后，充分混匀，37℃水浴12 h观察结果。

预扩增反应体系为20 μl，见表2。 

表2 预扩增反应体系（20.0 μl体系） 

引物E00和M00由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列为E₀₀:5′-GACTGCGTACCAATTC-3′；M₀₀:5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′。

在选定预扩增体系后，对程序的循环数进行设置，经过试验筛选出效果最佳的程序如下： 

表3 预扩增程序

取4 μl预扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。

选择性扩增体系为20.0μl，见表4。 

表4选择性扩增体系（20.0 μl体系） 

注：E+2、M+2为选择性扩增所用的在预扩增引物基础上加两个碱基（E+GC/M

+AT）的核苷酸引物。

在扩增体系确定的情况下，设置如下选择性扩增程序，是经过筛选后效果最佳的程序： 

表5选择性扩增程序

取4μl选择性扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

5. AFLP扩增产物银染检测 

将聚丙烯酰胺凝胶准备好，在玻璃板上对样品进行标记，点入5 μl的选择性扩增产物样品，插上电源，75 W电泳1 h。电泳结束后，进行固定、漂洗和显影，最终得到清晰条带，见图4。

6. 差异条带的回收纯化与克隆测序 

将目标条带从聚丙烯酰胺凝胶上回收后用试剂盒纯化，回收片段连接到pMD18-T载体上，转化于DH5α大肠杆菌（Escherichia coli）菌株，获得重组克隆。将阳性克隆菌液测序（序列3）。将测序结果经CNKI比对，除去多余载体以及选择性扩增引物序列，之后利用Primier 5.0进行SCAR（序列特异性扩增区）引物设计。筛选出能特异性检测出大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的引物。

7. 引物的检测 

引物的有效性检测

利用引物 F:5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAA-3′和R:5′- ATTAGGGCAATATCATA-3′对pR₁、ps₁以及它们的50个F₂代菌系进行检测（反应体系和条件见[0009]和[0010]）。检测结果如图6，50个杂交F₂代菌系扩增出条带和未扩增出条带的比例为39:11，与接种鉴定结果完全符合，即接种鉴定表现无毒的菌系均扩增出条带，接种鉴定表现有毒的菌系均未扩增出条带，说明这对引物对于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c具有有效性。

引物的特异性检测 

从采自东北三省的几百株株大豆疫霉菌中随机选取50株进行接种验证，接种结果显示，无毒:有毒=41:9。利用引物 F:5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAA-3′和R:5′- ATTAGGGCAATATCATA-3′对这50株大豆疫霉菌进行PCR扩增（反应体系和条件见[0009]和[0010]），结果有条带和没有条带的比例为41:9（图7），接种鉴定结果与分子鉴定结果100%符合，说明引物具有特异性。

以上结果表明： 

  本发明引物对大豆疫霉菌无毒基因Avr1c具有很强的特异性，可以特异地检测出含有无毒基因Avr1c的大豆疫霉菌。

本发明确立的大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的检测方法在1d内完成（DNA提取4~5h，PCR扩增3h，电泳1h），并且检测结果特异性强、灵敏度高、稳定性好。 

序列表

序列1：AGCCAGCAGAGAGTAGAA

序列2：ATTAGGGCAATATCATA

序列3：                                                                      5′-AGCCAGCAGAGAGTAGAATTCTACTCTCTGCTGGCTGGGATCGAGCAATCGAACAGGCGTTTTATCTCAGGTTGTCAACCTTGATCGCGTGAAAAACGTTGTCCCAGCTGGCTGCCAGTCATCCGAGGCCATGACTTCGTTCATCTGGAGGGGGATTATGGGACGACTTTTGCGAGTGCCAGATTGAGCTAAGTCAGCCTACGTCACGCCGTGTAAGCTTTTGCCAGTATTAATAAAGAGGTTGCCACAACTCTTCCGACACCGTCACACGCAATACGAGGGGCTCATTACATGTTGGCATCAAGTACAGTGGATTTCGTGGCCGCTGCCAAGTTCCTGGTGGACAAAACTCTCGAGGGTGAAATCCTAAACGACAAGGAGCAGAAGCGCCGTGAGCACCGTATCGGCATGGTGGCCTTCCGCCGTAAGAGGGATGTTGCGGGGCAGCAAGACCCGCCCCGACCTCGGTATTACTAGCCTAGTGAGCCGACGAGGCGAGCGGAACGGGTGCGTAACAACTAAAAACAATAGCAACACAATTATTATGGTATTGTCCCACTACAATTATATATTATTGGAAGTTCATGAAACCAATACAATATGATATTGCCCTAAT-3′。

 

Claims (2)

1.一种用于大豆疫霉菌无毒基因Avr1c检测的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。

2.一种检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c的方法，是以大豆疫霉菌基因组DNA为待测物，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的一对引物在特定PCR反应体系和特定PCR扩增条件下对待测物进行PCR扩增，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，如检测到616 bp的条带，则表明待测物中含有无毒基因Avr1c，所述特定PCR反应体系为：待测物大豆疫霉菌基因组DNA 100 ng，10 pmol/μl的序列表中序列1所示的上游引物和10 pmol/μl的序列表中序列2所示的下游引物各1.0 μl，10 pmol/μl 的dNTP 0.3 μl，10×PCR缓冲液 2.5 μl，25 mM的MgCl₂ 1.8 μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，以灭菌去离子水补足至20.0 μl；所述特定PCR扩增条件为：先94℃ 3 min；随后94℃ 30 sec，56℃ 30 sec，72℃ 60 sec，共40个循环；再72℃ 10 min。

3. 权利要求2所述的方法在检测大豆疫霉菌无毒基因Avr1c中的应用。