CN103667468B - 葡萄茎枯病菌的实时荧光pcr检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂及检测方法，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，正向引物的核苷酸序列为TGC ATT GCG CTC GCT GTA，反向引物的核苷酸序列为GGG CGA CCG ACA ATG GA，探针的核苷酸序列TGA GAA CCA CTT TCT GAC AAA，检测方法是以待检测样品DNA为模板，用检测葡萄茎枯病菌的引物和探针进行实时荧光PCR，检测扩增产物的荧光信号，是一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测葡萄茎枯病菌的试剂和方法。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄茎枯病菌的检测技术，具体涉及葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂及检测方法。
背景技术
葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata (Corda) Wollenweber & Hochapfel）属于黑座菌科（Valsaceae），茎点霉属（Phoma）的真菌，已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种检疫性植物病原真菌。目前，分布于意大利、希腊、瑞典、印度、澳大利亚、以色列、秘鲁、匈牙利、美国、加纳、南非、伊朗等国家和地区。迄今，我国未有发生报道。该病菌寄主范围广，可为害近百种植物，包括葡萄科（Vitaceae Lindley）、苹果属(Mallus sp.)、甘蔗属(Saccharum sp.)、柑橘属（Citrus sp.）、橄榄属（Canarium sp.）、桃属（Amygdalus sp.）、檀香属（Santalum sp.）、杨属（Populus sp.）、苜蓿属（Medicagosp.）、棕榈属（Trachycarpus spp.）、蓝花楹属（Jacaranda sp.）、荔枝属（Litchi sp.）、燕麦属（Avena sp.）、花旗松（Pseudotsuga menziesii）、大豆（Glycine max ）、番石榴（Psidiumguajav）、杏（Armeniaca vulgaris）、玫瑰（Rosa rugosa）、马铃薯（Solanum tuberosum）、蚕豆 (Vicia faba)、小麦(Triticum aestivum )、橡皮树(Ficus elastica)等重要经济作物，引起寄主根、茎、叶、果实等多种植物病害的发生，如葡萄枯萎病、松树猝倒病、小麦叶斑病、苹果叶部和果实病害、番茄、马铃薯和柑桔腐烂等。迄今为止，国内外检测葡萄茎枯病菌的方法局限于形态学检测方法，费时费力，且对检测人员专业素质要求较高，难以满足快速、准确、灵敏鉴定的检测要求。
近年来，利用TaqMan-MGB探针进行实时荧光RT-PCR反应是在常规RT-PCR反应体系中添加了1条TaqMan-MGB探针。探针的5′端含有报告荧光基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，进行PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。目前，实时荧光PCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线虫检测以及真菌检测等诸多领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂及检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是提供一种检测葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为79 bp，其引物和探针序列分别为：
正向引物（PHMG-ACT1F）：5′-TGC ATT GCG CTC GCT GTA-3′；
反向引物（PHMG-ACT1R）：5′-GGG CGA CCG ACA ATG GA-3′；
探针（PHMG-ACT1）：5′-TGA GAA CCA CTT TCT GAC AAA-3′，该探针的5′端含有FAM报告荧光染料，3′端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
扩增目标片段的核苷酸序列为：TGCATTGCGC TCGCTGTACA CTAGACAACGAGTGAGAACC ACTTTCTGAC AAACATGCAG CCTCCATTGT CGGTCGCCC。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是提供一种能简单、快速、灵敏、准确地检测葡萄茎枯病菌的方法，是以待检测样品DNA为模板，用上述检测葡萄茎枯病菌的引物和探针进行实时荧光PCR，检测扩增产物的荧光信号。样品可为带病植物样品、真菌纯培养样品等；样品经DNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取样品DNA，具体操作见试剂盒说明书。如从扩增产物中可检测到荧光信号，说明所述检测样品含有葡萄茎枯病菌，而且可以根据Ct（循环阈值）的大小确定样品中的起始模板的量。
实时荧光PCR反应是以提取样品DNA为模板，25 μL反应体系中引物PHMG-ACT1F和PHMG-ACT1R的终浓度都为0.6 μM、探针PHMG-ACT1终浓度为0.6 μM、12.5 μL2×TaqMan Universal PCR Master Mix（购自ABI公司）；所述实时荧光PCR的反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。
本发明针对现有葡萄茎枯病菌检测方法费时、繁琐、专业人员素养要求高的缺点，提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的检测葡萄茎枯病菌方法。本发明的方法及其专用引物和探针对葡萄茎枯病菌具有很强的专化性，并通过对反应体系的优化，不仅能提高葡萄茎枯病菌检测的效果，还能对受检样品进行定量分析。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：1、快速简单：只需少量样品DNA，用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR步骤，即可得到检测结果，且避免了普通分子检测技术中的探针制备、电泳等处理过程；2、特异性强：采用一对葡萄茎枯病菌的特有引物进行目标基因片段的扩增及一条可与模板互补配对的荧光探针进行检测，提高了特异性，有效地避免假阳性和假阴性；3、灵敏度高：由荧光PCR仪自动收集荧光信号，避免普通PCR反应后电泳分析中人为因素干扰，进一步提高灵敏度，在25 μL反应体系中，DNA检测低限是2 pg。4、交叉污染低：整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1、检测葡萄茎枯病菌的专用引物和探针的设计
从GenBank调出葡萄茎枯病菌及其近似种的基因序列，利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出葡萄茎枯病菌的保守基因序列，根据引物和探针设计的一般原则，用软件Primer Express 3.0设计引物和TaqMan-MGB探针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选最终确定一对引物和一条探针，其序列为：引物PHMG-ACT1F：5′-TGC ATT GCG CTC GCT GTA-3′；引物PHMG-ACT1R：5′-GGG CGA CCG ACA ATGGA-3′；探针PHMG-ACT1：5′-TGA GAA CCA CTT TCT GAC AAA-3′，该探针的5′端含有FAM报告荧光染料，3′端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
实施例2、实时荧光RT-PCR检测葡萄茎枯病菌的特异性试验
具体过程包括以下步骤：
一、样品来源
葡萄茎枯病菌（Phoma glomerata）纯培养样品3份（P15、P41、P45）；豌豆脚腐病菌（Phoma pinodella）纯培养样品1份(P1)、巨口茎点霉(Phoma macrostoma)纯培养样品1份(P2)、油菜黑胫病病菌（Leptosphaeria biglobosa）纯培养样品1份(P3)、豆类壳二孢（Ascochyta pinodes）纯培养样品1份(P4)、油菜茎基溃疡病菌（Leptosphaeria maculans）纯培养样品1份(P5)、菜豆轮纹斑病病菌（Phoma exigua var. exigua）纯培养样品2份(It6、It36)、草茎点霉（Phoma herbarum）纯培养样品2份(Chm-1、Chm-7)、Phoma sorghi纯培养样品2份(11905、14895)、黑附球菌（Epicoccum nigrum）纯培养样品2份(41524、P11)。上述菌株均由发明人采集或收集。
二、样品DNA的提取
对步骤一中的样品经DNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取DNA，具体操作见试剂盒说明书。
三、特异性检测
以步骤一和步骤二获得的DNA为模板，即：P15、P41、P45、P1、P2、P3、P4、P5、It6、It36、Chm-1、Chm-7、11905、14895、41524、P11，水为空白对照，进行实时荧光PCR反应，即在25 μL反应体系中加入12.5 μL 2×TaqMan Universal PCRMaster Mix（购自ABI公司），浓度20 μmol/L引物PHMG-ACT1F（至终浓度 0.6μmol/L），、浓度20 μmol/L引物 PHMG-ACT1R（至终浓度 0.6 μmol/L），浓度20μmol/L探针PHMG-ACT1（至终浓度 0.6 μmol/L），灭菌双蒸水补至25 μL。反应条件为：50℃2 min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。结果表明10种真菌样品中只有检出葡萄茎枯病菌样品P15、P41、P45产生荧光信号，说明所设计的引物和探针有较强的特异性， P1、P2、P3、P4、P5、It6、It36、Chm-1、Chm-7、11905、14895、41524、P11和水无荧光信号，不能检出。
实施例3、实时荧光PCR反应体系的优化
以实施例2中步骤二获得的P15的DNA为模板，分别对实时荧光PCR检测体系中的引物浓度和探针浓度进行优化，具体步骤如下：
一、引物浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，将引物终浓度从0.1 μM至1.0 μM以0.1 μM递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当引物终浓度为0.6 μM时，△Rn值达最大、Ct值最小。经过三次重复实验，最后确定0.6 μM为引物终浓度。
二、探针浓度优化
在实施例2中步骤三的体系中其它成分浓度不变，固定优化后的引物浓度，将探针终浓度从0.1 μM至1.0 μM以0.1 μM递增。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，当探针终浓度为0.6 μM时，△Rn值最大。经三次重复实验，最好确定0.6 μM为探针终浓度。
三、优化后的实时荧光PCR体系
经步骤一、二优化，确定最优的实时荧光RT-PCR体系为：25 μL反应体系中引物PHMG-ACT1F和PHMG-ACT1R的终浓度为0.6 μM、PHMG-ACT1终浓度为0.6 μM。
实施例4、实时荧光PCR检测葡萄茎枯病菌的灵敏度试验
以实施例2中步骤二获得的P15的DNA为模板，用核酸蛋白分析仪测OD260及OD280，计算DNA的浓度，并将其稀释为25 μL反应体系中，DNA分别为200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg、2 pg、0.2 pg、0.02 pg，以实施例3中步骤三获得的最优体系进行实时荧光PCR反应。反应条件按实施例3中步骤三的条件进行。结果表明，实时荧光PCR检测，其检测低限是2 pg。
实施例5、接种样品检测
采用活体叶片接种法进行接种，挑取幼嫩健康的苹果叶片，将在PDA平板上培养10 d的P15菌落用4 mm打孔器在菌落边缘打出菌饼后接种在伤口上，将菌饼接种在叶片正面，菌丝面贴向叶片，共接种10个叶片，无菌菌饼接种作为对照，接种10 d后按实施例2步骤二对发病叶片提取DNA，以实施例3中步骤三获得的最优体系进行实时荧光PCR反应。反应条件按实施例2中步骤三的条件进行。结果表明，接种的10份样品均有荧光信号，即均检出有葡萄茎枯病菌。
<110>宁波检验检疫科学技术研究院
<120>葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂及检测方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据葡萄茎枯病菌的基因设计的特异性引物
<400> 1
TGCATTGCGC TCGCTGTA 18
<210>2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据葡萄茎枯病菌的基因设计的特异性引物
<400>2
GGGCGACCGA CAATGGA 17
<210>3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据葡萄茎枯病菌的基因设计的探针
<400>2
TGAGAACCAC TTTCTGACAA A 21
Claims (1)
1.葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为79bp，其特征在于引物和探针序列分别为：
正向引物：TGC ATT GCG CTC GCT GTA；
反向引物：GGG CGA CCG ACA ATG GA；
探针：5'-TGA GAA CCA CTT TCT GAC AAA-3'，该探针的5'端含有FAM荧光报告基团，3'端为含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。
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