KR20130074838A - Ｐｃｒ을 이용한 병자각균 포마 글로메라타 균주의 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PCR을 이용한 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포마 속 균주 중에서도 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자에 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 상기 포마 속 균주의 신속 정확한 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 수입 묘목류 및 종자에서의 검역병원균인 병자각균 포마 속 (Phoma sp.)을 고속으로 보다 간편한 방식으로 분류 및 동정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 수입 묘목류 및 종자에서의 검역병원균인 병자각균 포마 속 (Phoma sp.)을 고속으로 보다 간편한 방식으로 분류 및 동정할 수 있다.
Description
본 발명은 PCR을 이용한 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포마 속 균주 중에서도 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자에 특이적인 프라이머 및 이를 이용한 상기 포마 속 균주의 신속 정확한 검출방법에 관한 것이다.
식물의 진균병은 발병되면 전파가 매우 빠르기 때문에 피해가 클 뿐 아니라 방제가 어려워 식물검역에 있어서 매우 중요하게 다루어지고 있다. 특히, 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 발생은 기주범위가 넓고 특히, 월귤, 참다래 및 양벚나무에 점무늬병, 잎마름병 및 검은무늬병 등을 일으켜 생산량 감소를 초래하는 등 그 피해가 커 포마 속 (Phoma sp.) 중 9종이 검역병으로 지정되어 있다.
그러나, 수입 종자류 검사는 주로 습지배양하여 형태적 동정에 의존하므로 병자각균의 동정이 매우 어렵고 배양시 포자형성까지 소요되는 시간이 너무 길어 효율적인검사가 어려운 실정이다. 2006년부터 2009년간 검출된 관리병해충 포마 속 (Phoma sp.)은 수박 종자와 해바라기종자에서 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 2건만이 동정되어 그 검출 실적이 매우 저조하다.
따라서, 병자각균에 효과적으로 대응하기 위해서는, 병자각균의 감염 여부 및 어떤 종의 병자각균에 감염되었는지 신속하게 확인하여야 한다. 특히, 최근에는 고소득 작물인 외국산 과수류에 대한 관심이 증가하면서 국내에서 재배가 가능한 올리브, 자두, 월귤(블루베리), 참다래, 양벚 등 재식용 묘목 수입이 급속히 증가되어, 수입 묘목류나 종자가 병자각균 포마 속 (Phoma sp.)에 감염되었는지 여부 및 상기 묘목이나 종자로부터 검출되는 균주가 포마 속 (Phoma sp.)인지를 신속하게 구분할 것이 요구되고 있다.
따라서, 다양한 병자각균에 감염된 종자나 묘목을 대상으로 어떠한 병자각균에 감염되었는지 그 종 구분을 신속하게 수행할 수 있는 검출용 프라이머 및 이를 이용한 검출 키트나 검출방법이 요구된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포마 글로메라타 (Phoma 균주를 특이적으로 검출하는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하는 단계 및 상기 PCR 결과를 확인하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주의 존재 유무를 판단하는 단계를 포함하는, 포마 속 (Phoma sp.) 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 신속 정확하게 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 존재 유무를 검출할 수 있는 PCR 방법을 확립하고자 연구하던 중, 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 유전자를 토대로 특이적인 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 검출이 가능한 프라이머 세트를 설계 및 제작하였고, 이를 토대로 포마 속 (Phoma sp.) 균주 균주의 검출 방법을 확립하였다.
본 발명은 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여, 시료내 포마 속 (Phoma sp.) 균주의 존재 유무를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 시료로부터 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 특이적인 염기서열을 PCR로 증폭시켜서 포마 속 (Phoma sp.) 균주를 검출한다.
본 발명은 포마 속 (Phoma sp.) 균주 중에서도 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주에 각각 특이적인 프라이머 세트를 제공한다.
포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다.
포마 로티콜라 (Phoma loticola) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다.
포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다.
포마 엑시구아 (Phoma exigua) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다.
포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 검출용 프라이머 세트는 서열번호 10의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함하는 세트이다.
본 발명의 프라이머 디자인 방법은 국내?외의 포마 속 (Phoma sp .) 분양 균주 27점을 확보한 후, 그 중에서도 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 서브글로메라타 (Phoma subglomerata), 보에레미아 엑시구아 (Boeremia exigua)의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 서열에서 프라이머를 디자인하였다.
프라이머의 선발은, 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주 중 특정 균주에만 반응하고 근연종 포몹시스 속 (Phomopsis sp.), 파일로스틱타 속 (Phyllosticta sp.)이나 다른 포마 속 (Phoma sp.) 균주에는 반응하지 않는 종 특이적인 프라이머를 제작하였다. 또한 Phoma 속균과 유사한 균사상태로 존재하는 토양 및 종자서식균인 라이족토니아(Rhizoctonia sp). 푸사리움(Fusarium sp). 파이소프토라(Phytophthora sp.), 피시움 속(Pythium sp .) 등의 균주에도 반응하지 않는 종 특이적 프라이머를 제작하였다.
본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트룩티바 (Phoma destructiva) 균주를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 종자 또는 묘목에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 포마 속 (Phoma sp.) 병자각균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 식물 종자 또는 묘목 시료에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계에 있어서, 상기 병원균에 기주식물이 될수 있는 종자를 선발하여 실험하였으며 이는 바람직하게는 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파(Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자를 포함하거나 그밖의 모든 식물에 적용됨을 포함하므로 포마 속 (Phoma sp .) 병자각균에 감염된 식물이면 이에 제한되지 않는다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizardprep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 실시예에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 모든 종류의 키트를 이용할 수 있다.
수입 묘목이나 종자에서 검출될 수 있는 병자각균은 발병되면 전파가 매우 빠르고 피해가 크기 때문에, 식물 검역시의 신속한 검사가 필요하다. 본 발명은 병자각균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 검출용 프라이머, 검출방법 및 검출키트와 상기 검출용 프라이머 제작에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제안함으로써, 상기 병자각균의 감염여부의 조기 진단에 따른 신속한 조치와 특정 병자각균에 대한 맞춤형 방역활동을 가능하게 할 수 있으므로, 산업적으로 그 효과가 매우 크다고 할 것이다.
도 1은 PCR을 위한 적절한 변성 (Denaturation) 조건을 확립하기 위하여, 94℃에서 1분, 2분, 3분, 5분 동안 변성한 DNA로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 3: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 레인 4: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 5: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), M: 100bp marker.
도 2는 PCR을 위한 적절한 PCR 사이클 조건을 확립하기 위하여, 20 30, 40 사이클 후 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 3: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 레인 4: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 5: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), M: 100bp marker.
도 3은 PCR을 위한 적절한 주형 (Template) DNA 농도 조건을 확립하기 위하여, 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS562.81, 180bp), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS108.62, 205bp)의 DNA를 배수별 (10배, 50배, 100배, 500배, 1000배)로 희석하여 PCR을 수행하여 낮은 농도에서의 검출능을 조사한 것이다. 레인 1: 1x 희석액, 레인 2: 10x 희석액, 레인 3: 50x 희석액, 레인 4: 100x 희석액, 레인 5: 500x 희석액, 레인 6: 1000x 희석액, M: 마커 (100bp 또는 25/100bp).
도 4는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae-batatas)(KACC 43114).
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 6은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 글로메라타 (P. glomerata)(KACC41361, 214bp); 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 7은 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 8은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae -batatas)(KACC 43114).
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 데스트럭티바 (P. destructiva) (CBS162.78), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 10은 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)을 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 11은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)을 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 12는 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS 562.81), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 13은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS 108.62), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 14는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 3개의 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 균주에 대하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 각각 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 3: 필로스틱타 카피타렌시스 (Phyllosticta capitalensis)(KACC 45111), 레인 4: 필로스틱타 시트리아시아나 (Phyllosticta citriasiana)(KACC 45113), 레인 5: 필로스틱타 무사룸 (Phyllosticta musarum)(KACC 45114).
도 15는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 4종의 토양 병원균에 대하여 실시한PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: 각각 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 레인 2: 푸사리움 속 (Fusarium sp.), 레인 3: 리조크토니아 속 (Rhizoctonia sp.), 레인 4: 피티움 속 (Pythium sp.), 레인 5: 피톱쏘라 속 (Phytophthora sp.)
도 16은 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 17은 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 18은 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 19는 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 20은 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 21은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)의 접종 농도 (1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 1x101 cfu/ml)에 따른 검출능을 조사한 결과를 나타낸다. M: 15/7000bp, 레인 1, 6, 11, 16, 21: 1x105 cfu/ml, 레인 2, 7, 12, 17, 22: 1x104 cfu/ml, 레인 3, 8, 13, 18, 23: 1x103 cfu/ml. 레인 4, 9, 14, 19, 24: 1x102 cfu/ml, 레인 5, 9, 14, 19, 25: 1x101 cfu/ml.
도 22는 본 발명에 따른 PCR 수행 과정을 사진으로 나타낸 것이다.
도 23은 개발프리믹스 키트에서의 5종의 프라이머별 검출능을 검정한 결과를 나타낸 것이다. M, 마커; 1, 양성대조구; 2, 사과묘목에서 추출한 DNA; 3, 음성대조구; 4, DW(증류수)
도 2는 PCR을 위한 적절한 PCR 사이클 조건을 확립하기 위하여, 20 30, 40 사이클 후 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 3: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 레인 4: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 5: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), M: 100bp marker.
도 3은 PCR을 위한 적절한 주형 (Template) DNA 농도 조건을 확립하기 위하여, 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 206bp), 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS562.81, 180bp), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS108.62, 205bp)의 DNA를 배수별 (10배, 50배, 100배, 500배, 1000배)로 희석하여 PCR을 수행하여 낮은 농도에서의 검출능을 조사한 것이다. 레인 1: 1x 희석액, 레인 2: 10x 희석액, 레인 3: 50x 희석액, 레인 4: 100x 희석액, 레인 5: 500x 희석액, 레인 6: 1000x 희석액, M: 마커 (100bp 또는 25/100bp).
도 4는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)(CBS162.78, 193bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae-batatas)(KACC 43114).
도 5는 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70, 222bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 6은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 글로메라타 (P. glomerata)(KACC41361, 214bp); 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 7은 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(CBS562.81, 180bp), 레인 2: Phoma sp.(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae - batatas)(KACC 43114).
도 8은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 12개 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)(CBS108.62, 205bp), 레인 2: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC40355), 레인 3: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41362), 레인 4: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC41841), 레인 5: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42405), 레인 6: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42444), 레인 7: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42445), 레인 8: 포마 속 (Phoma sp.)(KACC42479), 레인 9: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC40333), 레인 10: 포몹시스 디오스피리 (Phomopsis diospyri)(KACC41009), 레인 11: 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(KACC42446), 레인 12: 포몹시스 이포모에-바타타스 (Phomopsis ipomoeae -batatas)(KACC 43114).
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 데스트럭티바 (P. destructiva) (CBS162.78), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 10은 본 발명의 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)을 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 엑시구아 (Phoma exigua)(CBS761.70), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 11은 본 발명의 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)을 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 12는 본 발명의 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 로티콜라 (Phoma loticola) (CBS 562.81), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 13은 본 발명의 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)와 8개의 포마 속 (Phoma) 균주에 대하여 PCR을 수행한 결과이다. M: 25/100 bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis) (CBS 108.62), 레인 3: 포마 트라케이필라 (Phoma tracheiphila)(KACC 45210), 레인 4: 포마 큐커비타세아룸 (P. cucurbitacearum)(KACC45215), 레인 5: 포마 플라시다 (P. flaccida)(KACC45216), 레인 6: 포마 펀지콜라 (P.fungicola) (KACC45217), 레인 7: 포마 링감 (P. lingam)(KACC45218), 레인 8: 포마 로티콜라 (Phoma loticola)(KACC45220), 레인 9: 포마 마크도날디 (P. macdonaldii)(KACC45221), 레인 10: 포마 마크로스토마 (P. macrostoma var . macrostoma)(KACC 45222).
도 14는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 3개의 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 균주에 대하여 실시한 PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: DW, 음성 대조군, 레인 2: 각각 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 3: 필로스틱타 카피타렌시스 (Phyllosticta capitalensis)(KACC 45111), 레인 4: 필로스틱타 시트리아시아나 (Phyllosticta citriasiana)(KACC 45113), 레인 5: 필로스틱타 무사룸 (Phyllosticta musarum)(KACC 45114).
도 15는 본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 5를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 중 어느 하나와 비교 균주로서 4종의 토양 병원균에 대하여 실시한PCR 결과를 나타낸다. M: 25/100bp, 레인 1: 각각 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 레인 2: 푸사리움 속 (Fusarium sp.), 레인 3: 리조크토니아 속 (Rhizoctonia sp.), 레인 4: 피티움 속 (Pythium sp.), 레인 5: 피톱쏘라 속 (Phytophthora sp.)
도 16은 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)를 이용하여 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 17은 프라이머 세트 4 (PE-BTP1)를 이용하여 포마 엑시구아 (Phoma exigua)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 18은 프라이머 세트 3 (PG-BTP1)를 이용하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 19는 프라이머 세트 2 (PL-BTP1)를 이용하여 포마 로티콜라 (Phoma loticola)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 20은 프라이머 세트 1 (PM-BTP1)를 이용하여 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)에 감염된 10가지의 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자에서의 프라이머 검출능을 확인한 결과이다. M: 15/7000bp, (-): 물, (+): 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 레인 1: 치커리(Chicory), 레인 2: 카놀라(Canola), 레인 3: 알팔파 (Alfalfa), 레인 4: 당근 (Carrot), 레인 5: 수수 (Sorghum), 레인 6: 고추 (Pepper), 레인 7: 토마토 (Tomato), 레인 8: 보리 (Wild rye), 레인 9: 벼 (Rice), 레인 10: 야자 (Palm seed).
도 21은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)의 접종 농도 (1x105, 1x104, 1x103, 1x102, 1x101 cfu/ml)에 따른 검출능을 조사한 결과를 나타낸다. M: 15/7000bp, 레인 1, 6, 11, 16, 21: 1x105 cfu/ml, 레인 2, 7, 12, 17, 22: 1x104 cfu/ml, 레인 3, 8, 13, 18, 23: 1x103 cfu/ml. 레인 4, 9, 14, 19, 24: 1x102 cfu/ml, 레인 5, 9, 14, 19, 25: 1x101 cfu/ml.
도 22는 본 발명에 따른 PCR 수행 과정을 사진으로 나타낸 것이다.
도 23은 개발프리믹스 키트에서의 5종의 프라이머별 검출능을 검정한 결과를 나타낸 것이다. M, 마커; 1, 양성대조구; 2, 사과묘목에서 추출한 DNA; 3, 음성대조구; 4, DW(증류수)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하기 이해시키기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
실험 전 준비물
- DNA 추출키트 : Qiagen DNeasy plant mini kit (cat. No. 69104)
- 항온블럭 또는 항온수조를 65℃로 미리 맞춰둔다
- AP1(Lysis buffer)을 미리 65℃에서 10분간 가열한다.
게놈 (
genomic
)
DNA
추출
① 종자를 블렌더에 곱게 갈거나 파우치를 이용하여 마쇄한다.
② 시료 1g을 1.5㎖ 튜브에 담는다.
③ 미리 65℃에 가열된 AP1(lysis buffer)를 400㎕ 첨가한다.
④ RNase A stock solution(100 mg/ml) 4㎕ 첨가하고 30초-1분간 혼합 후
65℃에서 10분간 가열한다(이때 2-3분마다 가볍게 섞어준다)
⑤ AP2 130㎕을 첨가하고 잘 혼합한 후 5분간 얼음 또는 냉장고에 둔다.
⇒ 14,000rpm으로 5분간 원심분리 한다.
⑥ 상층액을 collection tube가 부착된 스핀-컬럼(보라색)에 옮긴다.
⇒ 14,000rpm으로 2분간 원심분리 한다.
⑦ 원심분리 후 collection tube로 빠져나온 용액을 새로운 튜브로 옮긴다.
⑧ 용액의 1.5배가 되도록 AP3/E를 첨가하여 강하게 혼합하여 준다.
⑨ 혼합액의 650㎕ 정도를 스핀-컬럼(투명색)으로 옮긴다.
⇒ 14,000rpm으로 10분간 원심분리 한다(2회 반복 수분 완전히 제거).
⑩ column membrane을 새로운 tube에 장착하고 AE(Elution buffer)를 100㎕
첨가한 후 5분간 실온에 둔다.
⑪ 8,000rpm으로 1분간 원심분리 하여 DNA를 추출한다.
⑫ 추천: 최대한 많은 DNA를 획득하기 위해 ⑪번 과정을 반복한다.
PCR
반응
PCR 혼합물로서 시료, 양성대조군, 음성대조군, 물의 4가지를 제조하였다. PCR 혼합물은 Hot start PCR premix(Bioneer) 20㎕, 정방향 프라이머 1㎕ (25 pmole), 역방향 프라이머 1㎕ (25 pmole), 게놈 DNA 1㎕, 증류수 17㎕로 첨가하여 최종 부피를 20㎕로 조정하였다.
PCR
조건
PCR 조건은 92℃에서 2분간 예비변성 후, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 7분간 최종 연장을 수행하였다. 이 중 10㎕를 전기영동으로 확인하였다 (도 22). 프라이머의 서열 정보는 하기의 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 세트 |
서열번호 |
서열 (5'→3') |
scale
(μ mol ) |
bp |
| 1 | 1 | CAC CAC GAC AAT CAC CAT GCA CCA GCA G | 0.2 | 205 |
| 2 | CAC AGT TCG TTG TAA TAG AGC GTG TCA GTT | 0.2 | ||
| 2 | 3 | TGT TTA CCA ACA ACA ACT AAC AAC GGC CA | 0.2 | 180 |
| 4 | CTT CGA AGA GCG TGT CAA TTA | 0.2 | ||
| 3 | 5 | TAA CCT TCT CAT GTC GGC GGC A | 0.2 | 214 |
| 6 | T AGA AGC GGT CAG CAC TCG CAG TCC GTC TGA | 0.2 | ||
| 4 | 7 | GTA AGT ACA CAT YTA MTG TAT TCT CTC GTY GYC ATC CG | 0.2 |
206
222 |
| 8 | TGTAT TCTCT CGTCG CCATC CG | 0.2 | 206 | |
| 9 | GGTCA GCACT CGCAG TCCGT C | 0.2 | 222 | |
| 5 | 10 | AACAG CCAGC TCACA ATTGA CAGGG | 0.2 | 193 |
| 11 | G GTCAG CACTC GCAGT CCGTC | 0.2 |
프라이머 세트 1은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis)에 특이적인 프라이머 세트로서, PM-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 1은 정방향의 프라이머 (PM-BTP1(F1)), 서열번호 2는 역방향의 프라이머(PM-BTP1(R1))이다.
프라이머 세트 2는 포마 로티콜라 (Phoma loticola)에 특이적인 프라이머 세트로서, PL-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 3은 정방향의 프라이머 (PL-BTP1(F1)), 서열번호 4는 역방향의 프라이머(PL-BTP1(R1))이다.
프라이머 세트 3은 포마 글로메라타 (Phoma glomerata)에 특이적인 프라이머 세트로서, PG-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 5는 정방향의 프라이머 (PG-BTP1(F1)), 서열번호 6은 역방향의 프라이머(PG-BTP1(R1))이다.
프라이머 세트 4는 포마 엑시구아 (Phoma exigua)에 특이적인 프라이머 세트로서, PE-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 7 (PE-BTP1(F1))과 서열번호 8 (PE-BTP1(F2))은 정방향의 프라이머, 서열번호 9는 역방향의 프라이머(PE-BTP1(R1))이다.
프라이머 세트 5는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에 특이적인 프라이머 세트로서, PD-BTP1라고 명명하였다. 서열번호 10는 정방향의 프라이머 (PD-BTP1(F1)), 서열번호 11은 역방향의 프라이머(PD-BTP1(R1))이다.
실시예
1: 본 발명의
프라이머
세트의 디자인
프라이머는 포마 속 (Phoma)에서 분리한 균주, 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 서브글로메라타 (Phoma subglomerata)와 보에레미아 엑시구아 (Boeremia exigua) 균주의 액틴 (Actin) 및 β-튜블린 (β-tublin) 서열에서 프라이머를 디자인하였다.
프라이머 선발 방법은 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua) 또는 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)에만 특이적으로 반응하고, 근연종인 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 또는 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)에는 반응하지 않는 프라이머를 선발하였다.
선발된 프라이머 세트 1 내지 5를 포마 속 (Phoma sp.) 균주에 감염된 10개의 종자와 반응시켜서 종자에서의 프라이머 검출능을 확인하였다. 인공접종을 위해, 치커리(Chicory), 카놀라(Canola), 알팔파 (Alfalfa), 당근(Carrot), 수수(Sorghum), 고추(Pepper), 토마토(Tomato), 보리(Wild rye), 벼(Rice), 야자(Palm) 종자인 종자(10품종)을 사용하였다. 각 병원균의 포자 농도 및 종자수는 1x104 cfu/ml/15 seeds로 하였으며, 25℃에서 4일간 배양한 후 종자에서의 프라이머 검출능을 확인하였다.
도 16 내지 도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 개발된 프라이머 세트 1 내지 5는 모든 종자에서의 검출능이 우수함을 알 수 있었다.
실시예
2: 본 발명의
프라이머
세트를 이용한
포마
속 (
Phoma
sp
.)의 특정 균주에서의 특이적 검출
(1)
포마
속 (
Phoma
sp
.)과
근연종
포몹시스
속 (
Phomopsis
sp
.) 균주에서의 종 특이적
검출능
검정
도 4 내지 도 8은 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5가 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 7종의 포마 속 (Phoma sp.)과 4종의 포몹시스 속 (Phomopsis sp.) 균주에서는 검출되지 않았음을 보여준다.
사용된 비교균주는 다음과 같다:
- 포마 속 (Phoma sp.) (7종) : Phoma sp.(7종)
- 포몹시스 속 (Phomopsis sp.)(4종) : Phomopsis sp.(2종)
P. diospyri (1종)
P. ipomoeae - batatas(1종)
도 9는 본 발명의 프라이머 세트 5가 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva)와 다른 포마 속 (Phoma)인 포마 플라시다 (P. flaccida), 포마 커커비타세아룸 (P. cucurbitacearum), 포마 펀지콜라 (P. fungicola)에서 검출되지 않았음을 나타낸다.
사용된 비교균주는 다음과 같다:
- 포마 속 (Phoma sp.) : P. tracheiphila(포마 트라키필리아), P. flaccida(포마 플라시다), P. cucurbitacearum(포마 커커비타세아룸), P. fungicola(포마 펀지콜라), P. lingam(포마 링감), P. loticola(포마 로티콜라), P. macdonaldii(포마 맥도날디), P. macrostoma (포마 마크로스토마)
도 10 내지 도 13은 상기 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 검출용 프라이머 세트 5 (PD-BTP1)을 제외한 4종의 프라이머 세트 1 내지 4 (PM-BTP1, PL-BTP1, PG-BTP1, PE-BTP1)가 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 8종의 포마 속 (Phoma sp .) 균주에서는 검출되지 않았음을 나타낸다.
사용된 비교균주는 다음과 같다:
- 포마 속 (Phoma sp.) : P. tracheiphila , P. flaccida , P. cucurbitacearum, P. fungicola , P. lingam , P. loticola , P. macdonaldii , P. macrostoma
(2) 근연종 필로스틱타 속 ( Phyllosticta sp.) 균주와의 종 특이적 비교 검정
도 14는 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5는 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 3종의 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) 균주에서는 검출되지 않았음을 나타낸다.
사용된 비교균주는 다음과 같다:
- 필로스틱타 속 (Phyllosticta sp.) : P. capitalensis
P.
citriasiana
P.
musarum
(3) 토양 병원균과의
종특이적
비교 검정
도 15는 본 발명의 프라이머 세트 1 내지 5는 종특이적으로 반응하는 특정균주에서만 검출되었으며, 비교균주인 4종의 토양 병원균에서는 검출되지 않았음을 나타낸다.
사용된 비교균주는 다음과 같다:
- 선발된 토양 병원균: Fusarium sp ., Rhizoctonia sp .,
Pythium
sp
.,
Phytophthora
sp
.
실시예 3: 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 포마 속 ( Phoma sp.) 균주의 PCR 조건 확립 및 검출 감도 시험
상기 실시예 1에서 디자인한 프라이머 세트 1 내지 5 (PM-BTP1, PL-BTP1, PG-BTP1, PE-BTP1, PD-BTP1)를 이용하여 포마 속 (Phoma sp.)의 포마 메디카지니스 (Phoma medicaginis), 포마 로티콜라 (Phoma loticola), 포마 글로메라타 (Phoma glomerata), 포마 엑시구아 (Phoma exigua), 포마 데스트럭티바 (Phoma destructiva) 균주에 대한 PCR 조건을 확립하기 위하여 1분, 2분, 3분, 4분 동안 94℃에서 변성 (denaturation)시켜서, 1분 동안 변성 (denaturation)시키는 경우에 가장 적합한 농도의 단일한 밴드가 나타난다는 것을 확인하였다 (도 1).
또한, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 결합 (annealing), 72℃에서 2분간 신장 반응 (extension)하는 PCR 조건을 20, 30, 40 사이클로 각각 나누어 증폭한 뒤, 30 사이클의 경우에 약 200 bp의 원하는 크기에서 단일밴드로 나타난다는 것을 확인하였다 (도 2).
그리고, 적합한 주형 DNA 농도를 설정하기 위하여, DNA를 배수별 (10배, 50배, 500배, 1000배)로 희석하여 낮은 농도에서의 검출능을 조사하였는데, 100배 희석 농도에서도 여전히 검출능이 높다는 것을 확인하였다 (도 3).
실시예
4: 시험개발
프리믹스
키트에서의
프라이머의
검출능
조사
선정된 업체에서 제작한 각 프라이머 별 프리믹스 키트를 이용하여 사과묘목에서 추출한 DNA를 사용하여 본 발명의 프라이머 세트의 검출능을 조사하고 그 결과를 도 23에 나타내었다.
합성 업체 선정 PCR 조건은 다음과 같았다.
- 반응 부피 20 ㎕
- PCR 조건: 92℃ 2분, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분 (30 사이클), 72℃ 7분
- PCR machine hybaid no. 4, c04, block
- E.P PCR product 4 ㎕, w/2.5% TBE gel
상기와 같이 개발 프리믹스 키트에서 5종의 프라이머별 검출능을 조사한 결과, 프라이머 별로 해당 병원체에 대해서만 종 특이적으로 검출됨을 확인할 수 있었다 (도 23).
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<212> DNA
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caccacgaca atcaccatgc accagcag 28
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<212> DNA
<213> Phoma medicaginis
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cacagttcgt tgtaatagag cgtgtcagtt 30
<210> 3
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<212> DNA
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<400> 3
tgtttaccaa caacaactaa caacggcca 29
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Phoma loticola
<400> 4
cttcgaagag cgtgtcaatt a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Phoma glomerata
<400> 5
taaccttctc atgtcggcgg ca 22
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Phoma glomerata
<400> 6
tagaagcggt cagcactcgc agtccgtctg a 31
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gtaagtacac atytamtgta ttctctcgty gycatccg 38
<210> 8
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<212> DNA
<213> Phoma exigua
<400> 8
tgtattctct cgtcgccatc cg 22
<210> 9
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<212> DNA
<213> Phoma exigua
<400> 9
ggtcagcact cgcagtccgt c 21
<210> 10
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<400> 10
aacagccagc tcacaattga caggg 25
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<400> 11
ggtcagcact cgcagtccgt c 21
Claims (4)
- 서열번호 5의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는, 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하여 포마 속 (Phoma sp.) 균주를 탐지하는 단계를 포함하는 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주의 검출방법.
- 제2항에 있어서,
a) 검색 시료를 수득하는 단계; b) 상기 수득한 검색 시료 및 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 c) 상기 중합효소연쇄반응의 증폭산물을 분석하여 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주를 탐지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 균주의 검출방법.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 포마 글로메라타 (Phoma glomerata) 검출용 키트.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020110141907A KR101429185B1 (ko) | 2011-12-26 | 2011-12-26 | Ｐｃｒ을 이용한 병자각균 포마 글로메라타 균주의 진단 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110141907A KR101429185B1 (ko) | 2011-12-26 | 2011-12-26 | Ｐｃｒ을 이용한 병자각균 포마 글로메라타 균주의 진단 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130074838A true KR20130074838A (ko) | 2013-07-05 |
| KR101429185B1 KR101429185B1 (ko) | 2014-08-14 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101429185B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667468A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-26 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 葡萄茎枯病菌的实时荧光pcr检测试剂及检测方法 |
-
2011
- 2011-12-26 KR KR1020110141907A patent/KR101429185B1/ko active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667468A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-26 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 葡萄茎枯病菌的实时荧光pcr检测试剂及检测方法 |
| CN103667468B (zh) * | 2013-11-29 | 2015-09-23 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 葡萄茎枯病菌的实时荧光pcr检测试剂及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101429185B1 (ko) | 2014-08-14 |
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