CN113789401B - 环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法 - Google Patents
环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法，所述的引物由B3、F3、FIP和BIP四条特异性引物组成，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1‑4所示。所示检测方法包括以下步骤：（1）待测样品的病原菌分离纯化；（2）病原菌DNA提取；（3）LAMP等温扩增：选取脱氧核糖酸扩增试剂盒、荧光目视检测试剂、病原菌DNA和所述四条特异性引物进行环介导等温扩增反应；（4）结果判定：待反应结束后观察，如果产生肉眼可见的绿色荧光，则待测样品中含有烟草疫霉菌，否则不具有烟草疫霉菌。本发明可实现对烟草疫霉菌的快速高效检测，克服了统PCR检测的多个温度变换装置和凝胶成像系统的复杂工序与传统分子标记位点的针对性不强的弱点。
Description
技术领域
本发明涉及一种环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法，属于农作物病害检测技术领域。
背景技术
烟草黑胫病由卵菌纲(Oomycetes)、霜霉菌目(Peronosporales)、霜霉菌科(Peronosporaceae)、疫霉菌属(Phytophthora)的真菌烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)引起。病原菌主要在烟田土壤中以孢子囊等形式残存，通过根部侵染烟草植株，对烟草植株的根部和茎基部造成危害，主要是引起木质部维管束组织坏死，因而使得烟草植株的水分和矿质营养元素运输不畅，最终导致烟株萎蔫枯死。烟草黑胫病在国内外烟草种植区都大规模发生。在我国大部分烟区，烟草黑胫病发病率高，危害严重，给烟叶生产重大经济损失，是困扰烟草生产的几种主要病害之一。病原菌烟草疫霉菌产生的病残体可以在烟田土壤中存留若干年，不仅造成了黑胫病的发生非常顽固，防控措施效果十分有限，也极大地增加了病原菌准确检测的难度。
传统的烟草黑胫病鉴定主要依靠症状的识别。大田烟株发病一般在茎杆基部出现水渍状黑斑，并环绕全茎向上部延伸，可以达到约15cm。病株叶片会自下而上一次变黄，大雨后遇烈日高温，则全株叶片突然凋萎。在多雨潮湿的条件下，中下部叶片常发生圆形大斑纵剖发病茎杆茎杆，可以看见髓部呈现黑褐色干腐，并且萎缩成片状。但是田间的症状同青枯病根黑腐病有着很大的相似之处，往往造成基层工作人员的混淆。
针对烟草疫霉菌的PCR检测法，可以通过特异性引物扩增病原菌的分子标记片段，达到精确地检测，适合实验室研究工作的开展。但是，PCR依据的Taq酶等DNA聚合酶的生物学特点实现扩增，需要变性(95℃)、退火(50-60℃)和延伸(72℃)三个温度条件，并且不断重复循环，必须依赖热循环仪器等专门设备。PCR反应结束后，还需要进行扩增片段的电泳和凝胶成像。部分产物还需要Sanger测序和序列分析比对。这些设备基本没有在基层站点配置，反应条件的设置和操作也不适合基层工作工作人员。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP)利用目标基因的六个片段设计的两条较长和两条较短的四条特异性引物，利用特定的DNA聚合酶，在60-70℃的恒温条件下就可以大量扩增靶标片段。LAMP技术已经在多种植物病害的检测中得到应用，具有时间段、成本低和精确度高的优点。利用LAMP技术检测烟草黑胫病，对于指导病害的绿色防控有着重要作用。
发明内容
基于上述，本发明提供一种环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法，可实现对烟草疫霉菌的快速高效检测，克服了统PCR检测的多个温度变换装置和凝胶成像系统的复杂工序与传统分子标记位点的针对性不强的弱点。
本发明的技术方案是：环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物，所述的引物由B3、F3、FIP和BIP四条特异性引物组成，其核苷酸序列分别为：
B3：5’-GCGTTGGTAGGACTCTCCA-3’；
F3：5’-GGAGCATGGCTTCCTTCC-3’；
FIP：5’-TTCGACCAACAGCTTCGAGAGGACTCCGTCCTCGAAAAACAC-3’；
BIP：5’-GATGCTCAAGCGGCGAACCCCAAACTCCTCGTGCGTCAG-3’。
优选的，所述引物是根据烟草疫霉菌对烟草植株有明显作用的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45设计的。
研究发现，烟草疫霉菌对烟草的致病因子实验鉴定出的烟草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶，可以作为该种病原菌鉴定的目标基因。半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45产生烟草疫霉菌致病因子，能够对烟草植株产生直接作用，是黑胫病发生的早期标识和直接体现，使用该位点来检测烟草疫霉菌，具有比传统位点核糖体转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)更强的针对性。
本发明还提供一种利用所述引物建立的烟草疫霉菌环介导等温扩增检测的方法，包括以下步骤：
(1)待测样品的病原菌分离纯化；
(2)病原菌DNA提取；
(3)LAMP等温扩增：选取脱氧核糖酸扩增试剂盒、荧光目视检测试剂、病原菌DNA和所述四条特异性引物进行环介导等温扩增反应；
(4)结果判定：待反应结束后观察，如果产生肉眼可见的绿色荧光，则待测样品中含有烟草疫霉菌，如果不产生荧光，则待测样品中不具有烟草疫霉菌。
优选的，所述LAMP等温扩增的反应体系为：以步骤(1)提取的DNA为模板，在PCR管中配制25.0μl，包括：2×反应缓冲液12.0μl，两条短引物B3和F3各4.0μl，两条长引物FIP和BIP各0.5μl，Bst DNA聚合酶1.0μl，荧光目视检测试剂1.0μl，以及模板DNA 2.0μl，将配制好的PCR管在60℃反应60min；80℃反应5min。
本发明还提供一种所述引物在检测烟草疫霉菌中的应用。
本发明的有益效果是：本发明选择半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45作为目标位点，建立一套烟草黑胫病的病原烟草疫霉菌的环介导等温扩增检测体系，包含了一组共四条特异性引物和对应的两个温度反应条件，搭配利用已经商业化的环介导等温扩增试剂盒和荧光检测试剂盒，反应结束后可以直接通过肉眼观察荧光反应判断是否存在病原菌DNA，具有快速高效的特点，克服了传统PCR检测的多个温度变换装置和凝胶成像系统的复杂工序与传统分子标记位点的针对性不强的弱点，可快速精准地从烟草样品中检测病原菌的存在。
附图说明
图1为本检测方法的引物设计图；
图2为本检测方法在贵州烟区贵阳开阳和毕节大方的两个菌株上的检测应用。。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
1、四条特异性引物的设计
将对烟草疫霉菌对烟草植株有明显作用的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45作为目标基因，利用该目标基因的六个片段设计的两条较长和两条较短的四条特异性引物(如图1所示)，两条较短的特异性引物针对分别针对两个片段，两条较长的特异性引物的特异性引物分别针对一个片段和另一个片段的互补片段，可以在扩增之后产生环状结构。具体而言，利用环介导等温扩增引物设计软件PrimerExplorer V5针对PpCys45基因的六个区段设计反应引物若干组，选择反应的温度条件是60℃的引物中ΔG最低的一组四条反应引物，其核苷酸序列分别为：
B3：5’-GCGTTGGTAGGACTCTCCA-3’；
F3：5’-GGAGCATGGCTTCCTTCC-3’；
FIP：5’-TTCGACCAACAGCTTCGAGAGGACTCCGTCCTCGAAAAACAC-3’；
BIP：5’-GATGCTCAAGCGGCGAACCCCAAACTCCTCGTGCGTCAG-3’；
以上引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示。
2、烟草疫霉菌环介导等温扩增检测方法的建立，包括以下步骤：
(1)病原菌分离纯化
剖开发病烟株的茎秆，从发病处用刀片挑取一个健康组织与腐烂组织交界处1mm×1mm的组织，到培养基中央，最后放入25℃培养箱中进行培养。当菌落直径为1cm时，用小刀片挑起菌落边缘的菌丝放入对应新的培养基中进行纯化，菌丝体大小为1mm×1mm，再放入25℃培养箱中进行培养。
(2)病原菌DNA提取
刮取马铃薯葡萄糖培养基(Potato dextrose agar,PDA)上病原菌菌丝组织(100mg左右)放入一个微量离心管中，用真菌DNA提取试剂盒(Biomega)提取DNA
①立刻加入600μl的Buffer FG1，剧烈震荡。
②接着放在65℃水中水浴10min，在水浴期间通过震荡混匀样品两次。
③将140μl的Buffer FG2加入到混合液中，然后利用涡旋振荡器混匀10-20s，把微量离心管放置到(4℃)冰箱中5min，再在离心机中用10000rpm的转速离心10min。
④小心地吸取裂解液560l到新的微量离心管中，确保不要碰到沉淀，加入0.5体积Buffer FG3，再接着加入1体积乙醇可形成沉淀物，并在涡旋振荡器上涡旋得到一个均匀的混合物。
⑤将整个样品(包括任何形成的沉淀物)运用到DNA圆柱放置到2ml的收集管中，将这个圆柱放在转速10000的离心机中转速离心1min使结合到DNA，倒掉剩下的液体。
⑥加入600l的DNAwash water(用纯乙醇稀释)后，再放到离心机上以10000rpm的转速离心1min，又倒掉流出来的液体，重新用收集小管，接着第七步。
⑦再加入600l的DNAwash water重复清洗步骤。在离心机上以10000rpm的转速离心1min，遗弃流出来的液体并重新用收集小管，接着第八步。
⑧离心空圆柱3min，加速弄干，这个步骤对移除残余的乙醇很重要。
⑨转移圆柱到一个1.5ml的干净小管中，加入50μl提前热好的65℃的ElutionBuffer，在室内放置3-5min后，在离心机上以10000rpm的转速离心3-5min提洗DNA。
⑩在Nanodrop微量分光光度仪(品牌名：Thermo Fisher)上，以1μl的DNA量测定DNA浓度。
(3)LAMP等温扩增。
选取脱氧核糖酸扩增试剂盒、荧光目视检测试剂、病原菌DNA和四条特异性引物进行环介导等温扩增反应。具体而言，以步骤(1)提取的DNA为模板，在PCR管中配制25.0μl，包括：2×反应缓冲液12.0μl，两条短引物B3和F3各4.0μl，两条长引物FIP和BIP各0.5μl，BstDNA聚合酶1.0μl，荧光目视检测试剂1.0μl，以及模板DNA 2.0μl，将配制好的PCR管在60℃反应60min；80℃反应5min。
(4)结果判定：待反应结束后观察，如果产生肉眼可见的绿色荧光，则待测样品中含有烟草疫霉菌，如果不产生荧光，则待测样品中不具有烟草疫霉菌。
试验例1：从贵州烟区的贵阳开阳和毕节大方采集感染烟草黑胫病的烟株样品，分离纯化烟草疫霉菌，提取DNA；用两个菌株的DNA同四条特异性引物与荣研生物科技中国有限公司的朗报脱氧核糖酸扩增试剂盒和荧光目视检测试剂进行环介导等温扩增检测，以空白作为对照(即不添加DNA模板)；具有烟草疫霉菌DNA的样品产生肉眼可见的绿色荧光，不具有烟草疫霉菌DNA的样品不产生荧光。经试验，如图2所示，空白对照不产生荧光，而另外两组均产生绿色荧光。
试验例2：
从贵州烟区的贵阳开阳采集感染青枯病和根黑腐病的烟株样品，分离纯化烟草疫霉菌，提取DNA；用两个菌株的DNA同四条特异性引物与荣研生物科技中国有限公司的朗报脱氧核糖酸扩增试剂盒和荧光目视检测试剂进行环介导等温扩增检测；以空白作为阴性对照(即不添加DNA模板)，用黑胫病的病原菌烟草疫霉菌的DNA作为阳性对照。经试验，不具有烟草疫霉菌DNA的青枯病和根黑腐病样品不产生荧光，具有烟草疫霉菌DNA的样品产生肉眼可见的绿色荧光，。空白对照也不产生荧光。
除上述试验外，申请人应用本检测方法进行多次检测，均取得了很好的效果，验证了感染烟草黑胫病的烟株样品能够产生绿色荧光，而其余例如感染青枯病、根黑腐病的烟株样品不会产生荧光。可见本发明能够快速有针对性的鉴定出感染烟草黑胫病的烟株。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省烟草公司贵阳市公司
<120> 环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法
<160> 4
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>1
GCGTTGGTAG GACTCTCCA 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>2
GGAGCATGGC TTCCTTCC 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>3
TTCGACCAAC AGCTTCGAGA GGACTCCGTC CTCGAAAAAC AC 42
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>4
GATGCTCAAG CGGCGAACCC CAAACTCCTC GTGCGTCAG 39
Claims (2)
1.一种环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待测样品的病原菌分离纯化；
(2)病原菌DNA提取；
(3)LAMP等温扩增：选取脱氧核糖酸扩增试剂盒、荧光目视检测试剂、病原菌DNA和四条特异性引物进行环介导等温扩增反应；
(4)结果判定：待反应结束后观察，如果产生肉眼可见的绿色荧光，则待测样品中含有烟草疫霉菌，如果不产生荧光，则待测样品中不具有烟草疫霉菌；
其中，所述引物是根据烟草疫霉菌对烟草植株有明显作用的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45设计的，所述的引物由B3、F3、FIP和BIP四条特异性引物组成，其核苷酸序列分别为：
B3：5’-GCGTTGGTAGGACTCTCCA-3’；
F3：5’-GGAGCATGGCTTCCTTCC-3’；
FIP：5’-TTCGACCAACAGCTTCGAGAGGACTCCGTCCTCGAAAAACAC-3’；
BIP：5’-GATGCTCAAGCGGCGAACCCCAAACTCCTCGTGCGTCAG-3’。
2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的方法，其特征在于，所述LAMP等温扩增的反应体系为：以步骤(2)提取的DNA为模板，在PCR管中配制25.0μl，包括：2×反应缓冲液12.0μl，两条短引物B3和F3各4.0μl，两条长引物FIP和BIP各0.5μl，BstDNA聚合酶1.0μl，荧光目视检测试剂1.0μl，以及模板DNA 2.0μl，将配制好的PCR管在60℃反应60min；80℃反应5min。
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| CN113789401A CN113789401A (zh) | 2021-12-14 |
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| CN103773865A (zh) * | 2014-01-15 | 2014-05-07 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种烟草疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 |
| CN104232755A (zh) * | 2014-07-17 | 2014-12-24 | 四川省烟草公司凉山州公司 | 一种烟草疫霉菌lamp检测引物及其快速检测方法 |
-
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- 2021-08-30 CN CN202111002922.2A patent/CN113789401B/zh active Active
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