CN113736917B - 一种用于检测苦楝树缩叶病毒的lamp-lfd可视化检测引物组及检测方法 - Google Patents

一种用于检测苦楝树缩叶病毒的lamp-lfd可视化检测引物组及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP‑LFD检测的引物组及检测方法，属于农作物病害检测领域。所述LAMP‑LFD可视化检测引物组包括5条引物：CLSV‑F3、CLSV‑B3、CLSV‑FIP、CLSV‑BIP、CLSV‑LB和1条探针引物：CLSV‑Pb。本发明还提供一种苦楝树缩叶病毒的可视化检测方法，其是运用环介导的等温扩增方法同时结合横向试纸条检测CLSV，建立LAMP‑LFD方法检测CLSV，二者相结合的技术，使LAMP扩增检测结果更加明显直观，其特点是特异性高，灵敏度高，操作简单，适用于基层和现场使用。

Description

一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组 及检测方法
技术领域
本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体是涉及一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组及检测方法。
背景技术
苦楝树(Melia azedaeach L.)为楝科落叶乔木。原产于澳大利亚和东南亚，在我国常分布于四川、云南、贵州、江苏和浙江等省。该植物在湿润的沃土上生长迅速，对土壤要求不严，在酸性土、中性土与石灰岩地区均能生长，是平原及低海拔丘陵区的良好造林树种。苦楝树亦是药用植物，其全株或特定部位(叶、茎、根)均可入药，常用于治疗腹泻、糖尿病、风湿、高血压等疾病。目前苦楝的研究主要集中在栽培和药用活性方面。苦楝树缩叶病普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲，防治形势不容乐观。如果任由该病害进一步传播蔓延，将会对我国林业带来很大影响。
现有的病害检测技术有常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等，但常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR等检测时间长，操作复杂，耗时耗力等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种有别于PCR原理的核酸扩增方法，无需繁杂的反应程序和技术性较高的仪器，仅需要在链置换DNA聚合酶的作用下，在普通PCR仪里60℃—65℃反应30—60min，即可获得核酸的109扩增。其优点是灵敏度高，特异性强，反应时间短，操作简单，产物添加荧光染料肉眼即可观察结果；缺点是引物设计复杂，极易出现气溶胶现象，造成假阳性。因此，对于产物的准确判读，我们需要用到横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)方法，LFD是结合免疫层析技术和分子生物学手段，在试纸条上锚定特定荧光素抗体，与LAMP产物上标记的荧光素反应，使样品在试纸条上形成有色检测线，从而检测出正确的目标产物，极大的降低了假阳性的概率。
根据以上描述，本发明提供一种苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组及检测方法，目前，国内外还未见报道该技术应用于苦楝树缩叶病毒的检测。
发明内容
本发所要解决的是目前缺失苦楝树缩叶病毒的检测手段的问题，为此，本发明提供一种检测速度快，成本低，灵敏度和准确度高的用于苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD检测的引物组及检测方法。
本发明为解决上述问题所采用的技术方案为：
本发明首先提供了一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组，其包括5条引物CLSV-F3、CLSV-B3、CLSV-FIP、CLSV-BIP、CLSV-LB和1条探针引物：CLSV-FITCBIP，所述引物序列分别为：
CLSV-F3：5’—GAGAAATGGAGAAACAAACGT—3’(SEQ ID NO:1)；
CLSV-B3：5’—CAACCTTTCCAAATCTCTGT—3’(SEQ ID NO:2)；
CLSV-FIP：
5’—GTCCCTTCTCTTCCCTCAGCGAGAATGATGTATCCCACGG—3’(SEQ ID NO:3)；
CLSV-BIP：
5’—CTGTCCCAGATAAGAAGAGTGTTCCCTGATCCTGAATATGTGTTGT—3’(SEQ ID NO:4)；
CLSV-LB：5’—TCGCTAGAGGATCCTGCTAC—3’(SEQ ID NO:5)；
探针引物CLSV-FITC PB：5’—GGACAGAATATTCTGTGTC—3’(SEQ ID NO:6)；
其中，CLSV-FIP的5’端为生物素标记；探针CLSV-FITC Pb的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
本发明还提供了一种上述引物组的苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其包括以下步骤：
1)提取病毒浸染组织的DNA；
2)环介导等温扩增反应：将获得的DNA在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应，扩增反应体系中包括10×Buffer 2.5μL，MgSO4 10mmol/L，dNTP Mix1.4mmol/L，CLSV-FIP、CLSV-BIP各1.6μmol/L，CLSV-F3、CLSV-B3各0.2μmol/L，CLSV-LB 0.4μmol/L，160U Bst2.0DNA聚合酶0.5μL，模板1μL，加无菌双蒸水补足至25μL；
3)LFD检测：将上述扩增反应体系中的CLSV-BIP换成等摩尔量的经异硫氰酸荧光素标记的探针引物CLSV-FITC BIP；60℃反应1h，反应结束后加入100μL HybriDetectAssay Buffer混匀，将横向试纸条检测端垂直插入待测液中，静置5min，肉眼观察结果。
优选的，苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，所述LAMP反应最佳体系中，MgSO4浓度为10mmol/L,dNTP Mix浓度为1.4mmol/L。
优选的，苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，LAMP的反应温度为60℃。
优选的，苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，LAMP的反应时间为60min。
本发明还提供了上述用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组在苦楝树缩叶病毒的诊断、检测、鉴定中的应用。
经上述实验方案与现有技术相比，本发明提供了一种基于LAMP-LFD的可视化检测引物组及检测方法，主要的优点在于利用FITC引物组及检测方法能够用于在生产实践中对苦楝树缩叶病毒的感染植株快速、灵敏、高效的检测，同时也能够用于苦楝树缩叶病毒的早期诊断和监测鉴定，为苦楝树缩叶病毒引起的病害防控提供可靠的技术支持了理论依据。与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)特异性强：本发明根据苦楝树缩叶病的gp3基因设计了LAMP-LFD所需要的引物和探针。
(2)灵敏度高：：LAMP-LFD对苦楝树缩叶病毒的检测灵敏度在DNA水平上可达到1pg，比常规PCR检测高1000倍。
(3)方便快捷：本发明扩增时间短，仅需60min。反应程序简单，60℃保持即可。LFD检测准确快速，无需大型复杂仪器，单人在1.5h内就可以完成所有实验步骤。
(4)综上所述，本发明对苦楝树缩叶病毒的检测，具有更高的准确度、灵敏度、便捷性，操作简单，能够满足现场检测需要。
附图说明
图1为不同MgSO4浓度下，苦楝树缩叶病毒LAMP扩增后电泳结果。
图2为不同dNTP浓度下，苦楝树缩叶病毒LAMP扩增后电泳结果。
图3为不同温度下苦楝树缩叶病毒LAMP扩增后电泳结果。
图4为不同反应时间下苦楝树缩叶病毒LAMP扩增后电泳结果。
图5为不同浓度模板普通PCR反应后电泳结果。
图6为不同浓度模板LAMP扩增后电泳结果。
图7为不同浓度模板LFD检测结果。
图8为盲样普通PCR反应后结果。
图9为盲样LAMP-LFD检测结果。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明做进一步阐述和说明。但所述实施例不是全部本发明的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在本发明的基础上做出没有实质性改变的所有其他实施例，都属与本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组及检测方法。实施例中所需原料均为市售渠道采购。
实施例1
苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD检测引物组的设计
1、苦楝树缩叶病毒基因组DNA的提取：
(1)采用CTAB法提取苦楝树缩叶病毒基因组DNA，具体步骤如下：提前30min在65℃水浴锅内加热CTAB提取液(2×)，将冷冻干燥的样品用液氮研磨成粉末，转移到1.5mL离心管中，加入800μl预热过的CTAB，混匀后，65℃保持30min-60min。再12000r/min，室温离心10min，弃沉淀。后加入与离心后上清等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，通风橱放置15min，后12000r/min，室温离心10min(管内有分层现象，上清中有核酸，中间是蛋白层，底部为杂质)。小心吸取上清至新的1.5mL离心管中(可重复此步骤，至肉眼不可见蛋白层)。再加入2/3体积或等体积的预冷过的异丙醇，上下温和颠倒混匀，静置5-10min，4℃离心机中，10000/12000r/min，离心10min。去上清，加入75％乙醇1mL，轻轻颠倒洗涤DNA，4℃离心机，12000/rmin，10min(重复此步骤一遍)，弃上清。开盖，自然晾干管壁残留乙醇，加入200μl无菌双蒸水，溶解DNA，50℃水浴20min(去除挥发物)。加入1μl，10mg/mLRNase，37℃，保持60min(此步去除RNA)，之后-20℃保存。
(2)PCR反应体系：25μl反应体系，包含KOD ONE酶12.5μl，引物各1μl，步骤(1)中提取的模板DNA1μl，用无菌双蒸水补足至25μl。
(3)PCR反应体系：将步骤(2)的反应体系至于下列反应条件中：98℃预变性1min；98℃变性15s,57℃退火15s，68℃延伸1min，33个循环；68℃再延伸5min；12℃保持。
(4)将步骤(3)所得反应产物送至杭州有康生物科技有限公司进行测序，得到苦楝树缩叶病毒gp3的核苷酸序列。
2、引物设计：
根据gp3引物序列进行LAMP引物设计，引物序列如下：
CLSV-F3：5’—GAGAAATGGAGAAACAAACGT—3’(SEQ ID NO:1)；
CLSV-B3：5’—CAACCTTTCCAAATCTCTGT—3’(SEQ ID NO:2)；
CLSV-FIP：5’—GTCCCTTCTCTTCCCTCAGCGAGAATGATGTATCC
CACGG—3’(SEQ ID NO:3)；
CLSV-BIP：5’—CTGTCCCAGATAAGAAGAGTGTTCCCTGATCCTG
AATATGTGTTGT—3’(SEQ ID NO:4)；
CLSV-LB：5’—TCGCTAGAGGATCCTGCTAC—3’(SEQ ID NO:5)；
探针CLSV-FIT-pb：5’—GGACAGAATATTCTGTGTC—3’(SEQ ID NO:6)；
其中，CLSV-FIP的5’端为生物素标记；探针CLSV-FITC-pb的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
实例2
本发明LAMP各反应条件的优化
1、LAMP反应体系的优化：
利用本发明引物组，对LAMP反应体系进行多次优化，最终确定反应体系中各成分最佳浓度为MgSO4 10mmol/L，dNTP Mix 1.4mmol/L，内引物CLSV-FIP、CLSV-BIP各1.6μmol/L，外引物CLSV-F3、CLSV-B3各0.2μmol/L，环引物CLSV-LB 0.4μmol/L，8000U Bst 2.0DNA聚合酶0.5μL。MgSO4、dNTP浓度优化结果见图1和图2.
2、LAMP反应温度优化：
按照优化后的体系，在PCR仪上设置50℃-70℃的温度梯度(梯度分别为：50℃、51.4℃、53.8℃、57.5℃、60℃、65.9℃、68.5℃、70℃)，设置空白对照。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，不同温度下苦楝树缩叶病毒LAMP反应体系扩增后，电泳图如图3所示。实验结果表明，在57℃下，反应无法进行，57℃—70℃之内，随着温度升高，扩增效率逐渐增加，在60℃往后扩增效率没太大的变化，因此本发明选择最适反应温度为60℃。
3、LAMP反应时间优化：
按照优化后的体系，将反应时间分为20min、40min、60min、80min、100min。设置空白对照，将不同反应时间的LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳，不同时间下苦楝树缩叶病毒LAMP反应体系扩增后，电泳图如图4所示。实验结果表明，在40min后就有产物产出，为了产量更多一些，本发明选择60min作为最佳反应时间。
4、LAMP反应灵敏度测定：
按照实施例1中步骤1的方法提取到苦楝树缩叶病毒的DNA，进行10倍梯度稀释，选择原浓度为10ng/μl的苦楝树缩叶病毒DNA进行稀释，以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，为模板，设置阴性对照。先进行普通PCR反应，电泳图如图5所示再按照(1)优化后的体系，进行扩增，不同模板浓度下苦楝树缩叶病毒LAMP反应体系扩增后，电泳图如图6所示。将两个实验结果进行对比，很明显能看到LAMP比普通PCR灵敏度高，随着浓度的降低而减少。再将梯度稀释的样本进行LFD检测，如图7所示，很明显的能看到，随着浓度减少检出量也逐渐降低。使用本发明提供的引物组进行苦楝树缩叶病毒的LAMP灵敏度检测为原浓度的10-8倍。
实施例3
用本发明LAMP-LFD技术对植物盲样进行苦楝树缩叶病毒的检测
取九个未知样品，利用CLSV特异性引物
CLSV-d1-F：GAGAATGATGTATCCCACGG；
CLSV-d1-R：CCTGATCCTGAATATGTGTTGT。
对样品进行PCR扩增，目的条带大小143bp，为将扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳，设置空白对照，结果如图8所示，其中1#、4#、8#、9#为病毒阳性样本。再将九个未知样进行本发明的LAMP-LFD可视化检测，设置空白对照，结果如图9所示。同样获得中1#、4#、8#、9#为阳性的结果。实验证明，本发明引物组针对苦楝树缩叶病毒的准确率较高。
序列表
<110> 中国计量大学
<120> 一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagaaatgga gaaacaaacg t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacctttcc aaatctctgt 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcccttctc ttccctcagc gagaatgatg tatcccacgg 40
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtcccaga taagaagagt gttccctgat cctgaatatg tgttgt 46
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgctagagg atcctgctac 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacagaata ttctgtgtc 19

Claims (6)

1.一种用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组，其特征在于：包括5条引物CLSV-F3、CLSV-B3、CLSV-FIP、CLSV-BIP、CLSV-LB和1条探针引物：CLSV-FITC Pb，所述引物序列分别为：
CLSV-F3：5’—GAGAAATGGAGAAACAAACGT—3’；
CLSV-B3：5’—CAACCTTTCCAAATCTCTGT—3’；
CLSV-FIP：5’—GTCCCTTCTCTTCCCTCAGCGAGAATGATGTATCCCACGG—3’；
CLSV-BIP：5’—CTGTCCCAGATAAGAAGAGTGTTCCCTGATCCTGAATATGTGTTGT—3’；
CLSV-LB：5’—TCGCTAGAGGATCCTGCTAC—3’；
探针引物CLSV-FITC Pb：5’—GGACAGAATATTCTGTGTC—3’；
其中，CLSV-FIP的5’端为生物素标记；探针CLSV-FITC Pb的5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2.一种利用权利要求1所述引物组的苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取病毒浸染组织的DNA；
2)环介导等温扩增反应：将获得的DNA在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应，扩增反应体系中包括10×Buffer 2.5μL，MgSO4 5～15mmol/L，dNTP Mix 0.5～1.0mmol/L，CLSV-FIP、CLSV-BIP各1.6μmol/L，CLSV-F3、CLSV-B3各0.2μmol/L，CLSV-LB 0.4μmol/L，160U Bst 2.0DNA聚合酶0.5μL，模板1μL，加无菌双蒸水补足至25μL；
3)LFD检测：将上述扩增反应体系中的CLSV-BIP换成等摩尔量的经异硫氰酸荧光素标记的探针引物CLSV-FITC Pb；60～65℃反应40min～60min，反应结束后加入100μLHybriDetect Assay Buffer混匀，将横向试纸条检测端垂直插入待测液中，静置5min，肉眼观察结果。
3.根据权利要求2所述的苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特在于，所述LAMP反应最佳体系中，MgSO4浓度为10Mm,dNTP Mix浓度为0.6Mm。
4.根据权利要求2所述的苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特点在于，LAMP的反应温度为60℃。
5.根据权利要求2所述的苦楝树缩叶病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特点在于，LAMP的反应时间为60min。
6.权利要求1所述用于检测苦楝树缩叶病毒的LAMP-LFD可视化检测引物组在苦楝树缩叶病毒的诊断、检测、鉴定中的应用。
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