CN108411017A

CN108411017A - 检测丁香假单胞菌番茄致病变种的lamp引物及方法

Info

Publication number: CN108411017A
Application number: CN201810562670.0A
Authority: CN
Inventors: 陈振东; 柴阿丽; 李宝聚; 石延霞; 谢学文
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明公开了一种检测丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP引物及方法。本发明提供了检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增引物组，由SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的5条引物组成。本发明的检测技术灵敏度高、特异性好、操作简单、污染率低、检测时间短，可直接对细菌菌悬液或番茄发病组织的浸提液进行检测，为病害的早期诊断及现场检测提供一种可靠的方法。

Description

检测丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP引物及方法

技术领域

本发明属于基因诊断领域，涉及检测丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP引物及方法，具体涉及一种基于环介导等温扩技术检测丁香假单胞菌番茄致病变种的方法、引物组及应用，可用于田间番茄细菌性斑点病的早期快速、特异性诊断。

背景技术

番茄细菌性斑点病(Bacterial speck of tomato)又称番茄细菌性斑疹病、叶斑病等，可造成5％～75％的产量损失。该病害于1933年首次在美国报道，之后在以色列、法国、印度、澳大利亚等20多个国家发生，并造成严重损失。近年来，该病害在我国主要的番茄种植基地中均有发生，发病严重的地区田间病株率达到95％。引起番茄细菌性斑点病的病原是丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato，Pst)，可危害番茄的叶片、茎杆、花、叶柄和果实，不同发病部位症状具有多样性，一般发病初期产生黑色斑点，病斑周围有或无黄色晕圈，后逐渐扩展成油渍状黑色斑块，严重时整株枯死。因其危害的严重性，Pst病菌在2007年已列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》以及2006年《全国农业植物检疫性有害生物名单》。

丁香假单胞菌番茄致病变种的鉴定多依赖于传统的形态特征、培养性状、生理生化反应和致病性测定，但较为耗时费力。以分子生物学为基础的PCR、IMS-PCR、实时荧光定量PCR等技术已广泛应用于蔬菜病原细菌的检测，但这些技术仍然需要昂贵的设备，难以推广到生产基层。等温扩增技术(Isothermal amplification technology)是通过添加特异性引物和不同活性酶或蛋白使核酸在恒温下达到快速扩增的技术，其操作简单方便，不需要高精度的热循环仪，非常适应于现场检测。近十年发展起来的等温扩增技术主要有链置换等温扩增(Strand displacement amplification，SDA)、滚环核酸扩增(Rolling circleamplification，RCA)、依赖解旋酶等温扩增(Helicase-dependent isothermal DNAamplification，HDA)、环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、序列特异性核酸体外扩增(Nucleic acid specific-based amplification，NASBA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)等技术。王念武等(2014)根据番茄细菌性斑点病菌Pst的一段特异蛋白基因序列，建立了Pst基于锁式探针的超分支滚环扩增(HRCA)的快速特异检测方法，DNA的最低检测浓度为500fg/μL，检测灵敏度比常规PCR方法高出一个数量级。魏梅生等(2016)依据番茄细菌性斑点病菌Pst的HrpZ_Pst基因序列设计并筛选出特异性扩增引物，建立了Pst的重组酶聚合酶等温扩增(RPA)快速特异检测方法，对病菌DNA的检测灵敏度为75fg/μL，与普通PCR扩增相当。RCA和RPA检测技术可在1.5h内即可完成扩增检测，但仍然离不开琼脂糖凝胶电泳。

环介导恒温扩增(LAMP)是众多等温扩增技术中的一种，其反应过程中通过链置换酶(Bst酶)的高效作用下，在恒温水浴条件下，靶序列的扩增反应仅需1h即可完成。如果在LAMP反应体系中加入染料，在反应结束时即可实现可视化，不需要进行琼脂糖凝胶电泳检测即可对结果进行判断，是一种简便、准确、时间短、操作简单、设备要求低、结果易于观察的检测方法。近年来，LAMP技术因其特异性和高效率而被广泛应用于病毒、细菌和真菌等病原物的诊断。但目前国内外尚未见到LAMP技术在丁香假单胞菌番茄致病变种检测和应用研究方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测技术中的不足，针对现有丁香假单胞菌番茄致病变种检测技术灵敏度低、操作程序繁琐、检测成本高以及不能直接进行现场检测等问题，提供了一种高灵敏性、高特异性、耗时短，并可用于直接现场检测的分子诊断技术。

第一方面，本发明要求保护一种检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增引物组。

本发明所提供的检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B。

所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4和引物5组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成。

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；或者分别为将SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5中的至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列。

其中，SEQ ID No.1为正向外引物F3；SEQ ID No.2为反向外引物B3；SEQ ID No.3为正向内引物FIP；SEQ ID No.4为反向内引物BIP；SEQ ID No.5为环引物B-Loop。

所述引物组中的各引物可分别单独包装。

第二方面，本发明要求保护检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂。

本发明所提供的检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂中含有前文所述的引物组。

进一步地，对于含有所述引物组A的所述试剂而言，其中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5在所述试剂中的摩尔比可为1:1:8:8:8。对于含有所述引物组B的所述试剂而言，其中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4在所述试剂中的摩尔比可为1:1:8:8。

进一步地，所述试剂中还可含有链置换型DNA聚合酶和/或荧光显色剂。

更进一步地，所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。所述荧光显色剂可为钙黄绿素。

第三方面，本发明要求保护一种检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂盒。

本发明所提供的检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂盒中含有前文所述的引物组或所述试剂。

第四方面，本发明要求保护一种检测待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种的方法。

本发明所提供的检测待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种的方法，可包括如下步骤：从待测样品中提取总DNA，作为模板，以前文所述的引物组或所述试剂或所述试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；然后按照如下(A1)或(A2)确定所述待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种：

(A1)反应结束后，观察所述待测样品的反应液的颜色变化；若所述待测样品反应液由橙色变为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有丁香假单胞菌番茄致病变种；

(A2)反应结束后，将所述待测样品的反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测；若得到梯形条带，则所述待测样品中含有或候选含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有丁香假单胞菌番茄致病变种；

A3)反应结束后，观察所述待测样品的反应液是否产生白色沉淀(即是否出现明显的浑浊)；若所述待测样品反应液产生白色沉淀，则所述待测样品中含有或候选含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有丁香假单胞菌番茄致病变种。

进一步地，进行所述环介导等温扩增时采用的反应条件可为63℃条件下的恒温反应60min。

第五方面，本发明要求保护如下任一应用：

(a)前文所述的引物组在制备前文所述试剂或所述试剂盒中的应用。

(b)前文所述的引物组或所述试剂或所述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种中的应用。

(c)前文所述的引物组或所述试剂或所述试剂盒或所述方法在诊断番茄细菌性斑点病中的应用。

在第四方面和第五方面中，所述待测样品既可为微生物样品(如表1中的各种菌)，也可为植物样品(如番茄，具体如番茄叶片、茎段等)。

本发明开发了一种基于环介导等温扩增技术检测丁香假单胞菌番茄致病变种的分子检测方法，本方法具有检测时限短、灵敏度高、检测成本低以及检测结果易观察等特点，能够直接检测植物材料中的病原菌，并可用于对番茄发病植株上丁香假单胞菌番茄致病变种的现场检测，为番茄细菌性斑点病的早期诊断、检测提供新的技术支撑。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

(1)特异性强，灵敏度高

所设计的LAMP引物可特异性扩增丁香假单胞菌番茄致病变种的hrpZ基因，而对其他常见蔬菜的病原细菌无任何扩增，表明引物特异性强；本发明所建立的LAMP检测方法灵敏度高，最低可检测到16.1fg·μL^-1DNA，显著高于常规PCR检测方法。

(2)步骤简单、成本低

本发明中无需普通PCR中的凝胶电泳及计算机扫描即可对反应结果进行判定；本发明无需依赖热循环仪以及凝胶成像仪等昂贵的设备即可进行结果检测，节省了一定的经济成本。

(3)检测速度快、结果直观

本发明所建立的技术只需1小时左右即可完成整个检测过程，比普通PCR的检测时间缩短了将近2h，比荧光定量PCR也缩短了将近0.5h；本发明不需要借助计算机分析软件，仅用肉眼观察溶液颜色的变化即可判断检测结果。

(4)实用性好，应用范围广

本发明所建立的方法，可检测发病番茄植株上不同部位的丁香假单胞菌番茄致病变种，并且可以直接对细菌菌悬液以及发病组织的浸提液进行直接检测，为病害的早期诊断检测提供新技术，为病害的预测预报提供新的理论支持，并可应用于田间现场的直接检测。

附图说明

图1为本发明中所有引物设计的基因位点。

图2为本发明设计的用于检测丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP外引物特异性检测结果。纵轴为浊度，横轴为反应时间。

图3为本发明提供的LAMP引物组扩增DNA模板灵敏度检测结果。a为本发明提供的LAMP引物组检测待检样品反应溶液颜色结果；b为本发明设计的引物组扩增待检样品产物凝胶电泳检测结果；c为普通PCR检测待检样品的灵敏度结果。其中M为BM 2000DNA Marker；1-12分别为161ng·μL^-1、16.1ng·μL^-1、1.61ng·μL^-1、161pg·μL^-1，16.1pg·μL^-1、1.61pg·μL^-1、161fg·μL^-1、16.1fg·μL^-1、1.61fg·μL^-1、0.161fg·μL^-1、0.0161fg·μL^-1、0.00161fg·μL^-1丁香假单胞菌番茄致病变种基因组DNA；N为阴性对照。

图4为本发明提供的LAMP引物组检测细菌菌悬液的灵敏度检测结果。a为本发明提供的LAMP引物组检测待检样品反应溶液颜色结果；b为本发明设计的引物组扩增待检样品产物溶液凝胶电泳检测结果；c为普通PCR检测待检样品的灵敏度检测结果。M为BM 2000DNAMarker；1-9分别为1.05×10⁸cfu·mL^-1、1.05×10⁷cfu·mL^-1、1.05×10⁶cfu·mL^-1、1.05×10⁵cfu·mL^-1、1.05×10⁴cfu·mL^-1、1.05×10³cfu·mL^-1、1.05×10²cfu·mL^-1、1.05×10¹cfu·mL^-1、1.05cfu·mL^-1丁香假单胞菌番茄致病变种菌悬液；N为阴性对照。

图5为本发明提供的LAMP技术检测人工接种丁香假单胞菌番茄致病变种发病叶片的结果。a为不同病斑直径的发病叶片；b为本发明提供的LAMP引物检测人工接种发病叶片浸提液反应溶液颜色结果；c为LAMP反应产物凝胶电泳检测结果。M为BM 2000DNA Marker；1-6分别代表病斑直径为0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm的发病叶片浸提液；7为无菌水接种后的番茄叶片浸提液；N为阴性对照。

图6为本发明提供的LAMP技术检测人工接种丁香假单胞菌番茄致病变种发病茎秆的结果。a为不同病斑直径的发病茎秆；b为本发明提供的LAMP引物检测人工接种发病茎秆浸提液反应溶液颜色结果；c为LAMP反应产物凝胶电泳检测结果。M为BM 2000DNA Marker；1-5分别代表病斑直径为0.05mm、0.1mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm的发病茎秆浸提液；6为无菌水接种后的番茄茎秆浸提液；N为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、LAMP特异性引物的设计与合成

用DNASTAR软件对从NCBI数据库下载的7个丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato，Pst)菌株(Genbank号：AF232004，EF095961，JQ083376，JQ083377，JQ083378，JQ083353，EF095960)，6个近缘种P.syringaepv.lachrymans(Genbank号：GU947714，JN624877)、P.syringae pv.japonica(Genbank号：AB720062)、P.syringae pv.japonica(Genbank号：AB720062)、P.syringae pv.syringae(Genbank号：AF031667)、P.syringae pv.aptata(Genbank号：AF092879)、P.avellanae(Genbank号：AM230707)的HrpZ基因序列进行序列比对，借助荣研公司在线软件PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp)设计Pst病菌的LAMP扩增反应的特异性引物。引物碱基序列如下：

正向外引物F3：5’-TTGCAGTCGGTTTCGTCG-3’(SEQ ID No.1)；

反向外引物B3：5’-GCGCAGCGCTGGATTG-3’(SEQ ID No.2)；

正向内引物FIP：5’-TTGCCCGTCGGGTTAGCCG-GGGTACACCGGTCGACAAT-3’(SEQ IDNo.3)；

反向内引物BIP：5’-AATCAGGACCTGGGTCAACTGC-TGTTGCCAGCATCCTGAAGC-3’(SEQID No.4)；

环引物B-Loop：5’-TGCAACGCGGGCTGGAA-3’(SEQ ID No.5)。

图1为本发明中所有引物设计的基因位点。

实施例2、丁香假单胞菌番茄致病变种LAMP引物特异性检测

菌株和模板DNA：将丁香假单菌番茄致病变种以及其他对照菌株(表1)从4℃冰箱储存的试管内取出，用接菌环于NA固体培养基上划线，置于细菌培养箱中25℃培养16h，挑取单菌落转移至NA液体培养基中，于180rpm、25℃的摇床中匀速培养20h。将培养好的细菌菌悬液置于4℃冰箱或冰上备用。将各菌株过夜培养，取1.5mL菌液，用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取供试菌株DNA，用dd H₂O稀释DNA原液，-40℃保存。DNA浓度和纯度用超微量分光光度计NanoDrop 2000c(Thermo Scientific)测定。

表1特异性检测菌株

注：IVF CAAS Lab：中国农业科学院蔬菜花卉研究所；ATCC：美国菌种保藏中心；VRI GXAAS：广西农业科学院蔬菜研究所。

以表1中病原细菌基因组DNA为模板，利用本发明实施例1设计的LAMP引物及相应的反应条件对上述菌株进行LAMP反应，以检测引物特异性。

LAMP反应程序：LAMP反应体系总体积为25μL，其中Reaction Mix(荣研生物科技(中国)有限公司；货号：SLP204；包含40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO₄，20mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.2％吐温20，1.6mol/L甜菜碱，2.8mmol/L的dNTPs)12.5μL，F3引物(10μM)0.5μL，B3引物(10μM)0.5μL，FIP引物(20μM)2μL，BIP引物(20μM)2μL，环引物B-Loop(20μM)2μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，钙黄绿素1μL，模板DNA(或菌悬液)2μL，d H₂O 1.5μL。阳性对照由试剂盒(荣研生物科技(中国)有限公司，货号：SLP204)提供，反应体系总体积25μL，其中Reaction Mix(荣研生物科技(中国)有限公司，货号：SLP204；包含40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L KCl，16mmol/L MgSO₄，20mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.2％吐温20，1.6mol/L甜菜碱，2.8mmol/L的dNTPs)12.5μL，引物PM DNA 2.5μL，模板PC DNA 2μL，Bst聚合酶1μL，DW 7μL。反应条件：将配制好的PCR反应管置于实时浊度仪(LA-320c；Teramecs，Kyoto，Japan)中恒温反应并实时监测，63℃反应60min。

反应结果的测定：可以采用目测观察和琼脂糖凝胶电泳的方法进行测定。

目测观察：(1)由于在扩增反应体系中加入了钙黄绿素荧光染料，反应结束后观察反应液颜色由橙色变成绿色为阳性，表示样本DNA中含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则不含有丁香假单胞菌番茄致病变种。(2)反应结束后，观察所述待测样品的反应液是否产生白色沉淀(即是否出现明显的浑浊)；若所述待测样品反应液产生白色沉淀，表示样本DNA中含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则不含有丁香假单胞菌番茄致病变种。

琼脂糖凝胶电泳检测：LAMP反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，使用电压为80V，电泳时间为40min。电泳结束后，于紫外灯下成像观察扩增条带，出现典型梯形条带即为阳性，表示样本DNA中含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则不含有丁香假单胞菌番茄致病变种。

图2给出了LAMP外引物特异性检测结果，从图中可以看出只有丁香假单胞菌番茄致病变种与阳性对照显示出明显的浑浊(反应液产生白色沉淀)。本发明设计的引物组仅对丁香假单胞菌番茄致病变种的DNA进行扩增，而对蔬菜上其他常见细菌基因组DNA及阴性对照无任何扩增，表明该引物组对丁香假单胞菌番茄致病变种的特异性很好。

实施例3、丁香假单胞菌番茄致病变种LAMP检测灵敏度

将丁香假单胞菌番茄致病变种基因组DNA和菌悬液用无菌水进行10倍梯度稀释，各取2μL不同浓度的模板进行LAMP检测。其中基因组DNA浓度为161ng·μL^-1-0.00161fg·μL^-1，菌悬液浓度为1.05×10⁸cfu·mL^-1-1×10⁰cfu·mL^-1；按照实施例2中所用反应体系及程序进行LAMP反应。同时以普通PCR作为对照。普通PCR的反应体系总体积为25μL，其中2×TaqPCR Master Mix(包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液)12.5μL，模板DNA 2μL，引物MM5F/MM5R(MM5F：GAACGAGCTGAAGGAAGACA；MM5R：CAGCCTGGTTAGTCTG GTTA)各1μL，ddH₂O8.5μL。扩增程序为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

如图3所示，丁香假单胞菌番茄致病变种DNA模板浓度在1.61pg·μL^-1以上时，可以实现可视化观察(图3中a)；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现DNA模板浓度在16.1fg·μL^-1时仍可获得梯度条带(图3中b)；而普通PCR检测中，DNA模板浓度在161pg·μL^-1时以上可获得明显扩增条带，DNA模板浓度在16.1pg·μL^-1时扩增条带较为模糊，DNA模板浓度低于16.1pg·μL^-1时几乎无扩增产物(图3中c)。

如图4所示，丁香假单胞菌番茄致病变种悬液模板浓度在1.05×10³cfu·mL^-1以上时，可以实现可视化观察，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测亦可获得明显梯度条带(图4中a和b)；而普通PCR检测中，菌悬液模板浓度在1.05×10⁸cfu·mL^-1时可获得明显扩增条带，菌悬液模板浓度在1.05×10⁷cfu·mL^-1时扩增条带较为模糊，菌悬液模板浓度低于1.05×10⁷cfu·mL^-1时无扩增产物(图4中c)。

以上灵敏性检测结果表明，LAMP反应对丁香假单胞菌番茄致病变种DNA的检测限为16.1fg·μL^-1，比常规PCR灵敏度高1000倍；对丁香假单胞菌番茄致病变种菌悬液浓度的检测限为1.05×10³cfu·mL^-1，比常规PCR灵敏度高10000倍。

实施例4、人工接种发病组织中丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP检测

采用喷雾接种法，用浓度1.05×10⁸cfu/mL的丁香假单胞菌番茄致病变种菌悬液喷雾接种番茄幼苗，以喷无菌水作为对照。接种后，将番茄苗置于温度18-25℃、湿度85％的温室条件下，观察病害发展情况。

接种10d后，选取发病植株不同病斑大小的叶片、病茎，用75％乙醇表面消毒30s，再用无菌水冲洗3遍。在病斑边缘剪取大小为直径5mm的叶片和茎表皮组织，剪碎后置于无菌水中浸泡10min。以无菌水接种植株的叶片和茎表皮作对照，取2μL浸提液作为模板进行LAMP检测。按照实施例2中所用反应体系及程序进行LAMP反应。

图5与图6为人工接种发病组织中丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP检测结果。结果显示，所有不同病斑扩展时期的病叶和病茎均检测为阳性，其反应管内的反应液颜色为绿色，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳表现为梯形条带，而以无菌水接种植株的叶片、茎表皮样品以及阴性对照的琼脂糖凝胶电泳均无条带，反应液颜色不变。检测结果表明，本发明提供的丁香假单胞菌番茄致病变种LAMP检测技术可以直接对发病组织的浸提液进行检测，而不用进行植物基因组DNA的提取，可以有效减少时间成本以及经济成本。

本发明提供的丁香假单胞菌番茄致病变种LAMP检测技术特异性好，灵敏度高，对样本DNA的检测灵敏度达到16.1fg·μL^-1，对菌悬液的检测灵敏度达到1.05×10³cfu·mL^-1，明显高于常规PCR；此外，与传统PCR相比，本发明的检测技术可以直接对发病组织的浸提液进行检测，并且检测时间短、检测成本低廉、检测结果直观。本发明提供检测技术对设备要求较低，操作简便，为实现病害的现场检测提供了理论依据。

对比例:

LAMP反应引物设计是获得成功检测的关键。本发明在实际操作过程中，针对Pst病菌的HrpZ基因序列设计了大批量的引物(部分引物见表2)，根据LAMP反应要求的条件进行筛选(具体操作参见实施例1)。结果显示，LAMP反应外引物P17对Pst病菌有特异性扩增，而对其他对照病菌无特异性扩增，扩增产物电泳条带明亮、唯一；而其他外引物P36、P50、P88、P115等可以从Pst病菌中扩增出目的片段，但也可以从对照菌株(表1)中的一个或多个病原菌产生扩增，因此不具有特异性。根据检测引物特异性的要求，对照LAMP反应条件，引物P17扩增效率和特异性良好，可作为对Pst病菌特异性检测的LAMP反应外引物。

表2本发明设计的部分LAMP外引物序列

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 检测丁香假单胞菌番茄致病变种的LAMP引物及方法

<130> GNCLN180974

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ttgcagtcgg tttcgtcg 18

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gcgcagcgct ggattg 16

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ttgcccgtcg ggttagccgg ggtacaccgg tcgacaat 38

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

aatcaggacc tgggtcaact gctgttgcca gcatcctgaa gc 42

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tgcaacgcgg gctggaa 17

Claims

1.检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4和引物5组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4和所述引物5的核苷酸序列分别为SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5；或者分别为将SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5中的至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列。

2.检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂，其特征在于：所述试剂中含有权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5在所述试剂中的摩尔比为1:1:8:8:8；

或

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4在所述试剂中的摩尔比为1:1:8:8。

4.根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于：所述试剂中还含有链置换型DNA聚合酶和/或荧光显色剂。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段；

所述荧光显色剂为钙黄绿素。

6.检测丁香假单胞菌番茄致病变种的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物组或权利要求2-5中任一所述的试剂。

7.一种检测待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种的方法，包括如下步骤：从待测样品中提取总DNA，作为模板，以权利要求1所述的引物组或权利要求2-5中任一所述的试剂或权利要求6所述的试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；然后按照如下(A1)或(A2)或(A3)确定所述待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种：

(A3)反应结束后，观察所述待测样品的反应液是否产生白色沉淀；若所述待测样品反应液产生白色沉淀，则所述待测样品中含有或候选含有丁香假单胞菌番茄致病变种；反之，则所述待测样品中不含有或候选不含有丁香假单胞菌番茄致病变种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：进行所述环介导等温扩增时采用的反应条件为63℃条件下的恒温反应60min。

9.如下任一应用：

(a)权利要求1所述的引物组在制备权利要求2-5中任一所述试剂或权利要求6所述试剂盒中的应用；

(b)权利要求1所述的引物组或权利要求2-5中任一所述的试剂或权利要求6所述试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有丁香假单胞菌番茄致病变种中的应用；

(c)权利要求1所述的引物组或权利要求2-5中任一所述的试剂或权利要求6所述试剂盒或权利要求7或8所述的方法在诊断番茄细菌性斑点病中的应用。

10.根据权利要求7-9中所述的方法或应用，其特征在于：所述待测样品为微生物样品或植物样品。