CN1831137A - 一种番茄种子带细菌性斑点病菌快速检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为“一种番茄种子带细菌性斑点病菌快速检测的方法”，属生物技术领域。本发明涉及的番茄种子带细菌性斑点病菌快速检测方法，其特征是该方法应用免疫吸附分离和PCR相结合的方法，从而提高了灵敏度和准确性并且快速。还涉及PCR引物序列、番茄细菌性斑点病菌冠毒素基因的DNA序列。本发明在番茄细菌性斑点病防治和种子带菌检测方面，具有很高的应用价值。

Description

一种番茄种子带细菌性斑点病菌快速检测的方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域。进一步，本发明涉及一种番茄种子带细菌性斑点病菌检测的方法。更进一步，本发明涉及应用免疫吸附分离病菌技术和PCR技术以使种子带菌检测快速、灵敏和准确。

技术背景：

番茄为我国人们喜食的蔬菜，每年种植850万亩左右，占商业蔬菜面积的6％～7％，设施农业中，番茄也占很大比重。番茄生产的好坏，将直接影响我国的菜篮子工程。番茄细菌性斑点病(Pseudomonas syringae pv.tomato(0kabe)Young，Dye & Wilkie)是一种严重影响番茄产量和品质的重要病害。病菌主要为害番茄(Lycopersicon esculentum)，其寄主为番茄(Lycopersicon esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)，接种寄主为茄子(Solanummelongena)。此病害可为害番茄茎、叶、花、叶柄和果实；病原菌接种到土壤中可抑制种子发芽并引起苗期猝倒病，还可抑制感病番茄植株发育。自1933年首次报道以来，该病在美国、前苏联、澳大利亚、加拿大等几个国家和中国的台湾省有发生报道，可造成严重的产量损失，减产高达75％～100％。1998～2004年我们在东北三省、河北省、天津市、新疆和甘肃省的番茄上发现番茄细菌性斑点病，经调查此病发生有上升趋势，对我国的番茄生产构成了严重威胁(赵廷昌孙福在等，番茄细菌性斑点病研究进展，植物病理学研究进展，中国农业科技出版社，2001，p271～275.)。

番茄细菌性斑点病的病原菌为丁香假单胞番茄致病变种[Pseudomonas syringae pv.tomato(Okabe)Young，Dye & Wilkie]。该病菌在种子、病残体、土壤和杂草上(不显症)越冬。病菌在干燥种子上可存活二十年，病菌可随种子远距离传播。播种带菌种子，病菌很快侵染子叶及真叶，引起幼苗发病。幼苗发病后移栽入大田，病叶上的菌借雨水、风、昆虫及农事操作等途径传播，形成再侵染，造成流行。由于该病危害严重，各发生国家都十分重视，对病原菌的鉴定、生理生化特性、致病机理、检验技术、接种技术、发病规律已做了一些研究，取得了一定进展。番茄细菌性斑点病的病原菌有2个生理小种，小种1号侵染品种Ottawa而不侵染品种ONT7710；小种2号侵染Ottawa和ONT7710。25℃以下的温度和相对湿度80％以上的条件有利发病。国外研究者鉴定了大量品种的抗病性，筛选出了很多各种水平的抗性品种，研究了抗性遗传规律。值得一提的抗性品种有pI126430、Ontario7710和Rehovot13(抗病基因不同)。在种子带菌的快速检测研究方面，目前所用技术和方法涉及到了病菌的富集分离和真空浸透接种、血清学、噬菌体和DNA探针杂交等。研究表明：真空渗透接种方法可检测到每克土壤中或每毫升测试悬液中含有的10个细菌细胞；含有蔗糖、赤藓醇及DL-乳酸盐作单一炭源的Misaghi与Grogen的缺铁培养基上不同发光能力而易于区分P.syringae pv.tomato、P.syringae pv.syringae、P.viridiflava；抗血清能够区分Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，P.syringae pv.tomato，Xanthomonascampestris pv.vesicatoria；分离并测定了鉴定用噬菌体的特性，应用病原型指示噬菌体可快速检测番茄叶和果部病斑上的病菌，获得了专化噬菌体；构建的Pst-DNA探针可用于确定番茄上的P.syringae pv.tomato及区分P.syringae pv.tomato与P.syringae pv.syringae等其它病原菌；利用控制冠毒素(coronatine)产生的染色体上的5.3kb XhoI片段的探针，确定番茄上的P.syringae pv.tomato(赵廷昌 孙福在等，番茄细菌性斑点病研究进展，植物病理学研究进展，中国农业科技出版社，2001，p271～275.)。

近年来人们开始应用PCR的方法来对病菌进行鉴定和检测。PCR方法灵敏、准确、方便、快速，可在短时间内扩增出数百万个特异DNA序列的拷贝。目前研究人员已在检测种子带菌方面应用PCR技术做了大量工作，设计得到了大量相关引物。利用特异引物的新方法使细菌性病害检测能力得到加强。如用对16S和23S rRNA基因通用的引物来扩增病原物及其亲缘关系相近的细菌菌系，然后分析得到的扩增片段。基于对DNA序列数据的对比分析，特别是非同源部分的表现分析，可设计特异引物用专一性检测某病原。

现已证明PCR要比ELISA或免疫荧光等方法检测病原要灵敏得多。免疫学和PCR技术相结合的检测方法包括免疫PCR和免疫磁性分离-PCR。免疫磁性分离所用的磁性免疫微球(IMMS)是近年发展起来的一类新型功能性材料，它是磁性微球(MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小，比表面积大，故而偶联容量较高，悬浮稳定性较好，便于各种反应高效而方便地进行；又因其具有顺磁性，在外电场的作用下固液相的分离十分简单，可省去过滤、离心等繁杂操作，并可在磁场作用下定位，方便地进行分离同配体相对应的物质。该方法应用于种子带菌检测的具体做法是：包被于IMMS上的抗体选择性吸附目标菌，洗掉未吸附的污染物，然后对目标菌扩增培养，进行PCR扩增目的片段，根据所得结果判断目标菌是否存在。

病害防治需要快速、可靠、灵敏的种子带菌检测方法。种植、选择性培养基和ELISA的检测方法，在种子带菌检测上应用较多，但速度慢、准确率相对较低；对ELISA有时会有假阳性。随着分子生物学，尤其是PCR技术的不断发展，应用与PCR技术相关联的检测方法逐渐发展起来。应用免疫分离-聚合酶链式反应技术检测目标细菌，与上述方法相比，更能够省时、省空间，快速、准确、灵敏。将这项技术应用于番茄细菌性斑点病的种子带菌检测，对于该病害的综合防治来讲是首要的，是一项开创性的工作，具有重要的理论意义和实际应用价值。可为种子带菌的快速检验提供技术方案，可为其他病害的种子带菌检测提供指导和借鉴，填补国内该病害领域研究的空白。

本发明利用免疫吸附免疫分离的方法和PCR的方法相结合来检测番茄种子带细菌性斑点病菌。

发明内容：

1.番茄细菌性斑点病菌抗血清制备

参照《兽医微生物学及免疫学技术》(曹澍泽等，北京：北京农业大学出版社，1992)、《植病研究方法》(方中达，北京：中国农业出版社，1998)、《精编分子生物学实验指南》(F·奥斯伯等，北京：科学出版社，1998)中的方法进行菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备、菌体全蛋白抗原的制备、免疫家兔、测定血清效价、抗体专一性(试管凝集法、间接ELISA法)、间接ELISA法测定抗原的检测精度。采用硫酸铵沉淀法纯化抗血清中免疫球蛋白(IgG)。在4℃不断搅拌下，往2体积的含有IgG的混合物中，逐滴加入1体积pH7.0的SAS溶液。加完后置于4℃，不间断地搅拌此混合物2～4小时以形成沉淀，12,000g离心20min。用预冷的33％SAS溶液在旋涡混合器上振荡洗涤沉淀，所用溶液的体积与原含IgG的混合物等体积。12,000g离心20min，尽弃上清，加入与原含IgG混合液等体积的PBS(pH7.4)，在旋涡混合器上温和振荡以将沉淀溶解。4℃透析IgG溶液48h以上，期间换3次缓冲液(每次换4L)。将透析管内溶物分装于1.5mL eppendorf管，-20℃冷冻。

2.番茄细菌性斑点病菌PCR检测

参照《精编分子生物学实验指南》(F·奥斯伯等，北京：科学出版社，1998)方法提取番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的染色体DNA，电泳检测。以番茄细菌性斑点病菌染色体DNA为模板，用高保真DNA Taq plusI DNA多聚酶进行PCR扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋，北京：高等教育出版社，1993)进行。所用引物含有如下序列：

引物1(+)(正向引物)：5’ACA TCA TTG CCA GTT ACG GTA C      3’

引物1(-)(反向引物)：5’CGT CAT AAA TGC TGT ACT AAA GAG G  3’

上海生工生物技术有限公司(中国上海市松江工业区茸兴路111号)合成引物，利用琼脂糖电泳检测扩增结果，按照天为时代公司(中国北京清华大学学研大厦B座1115室)提供的PCR Fragment Recovery Kit使用说明书进行PCR产物的回收。把PCR回收产物与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌JM109，重组质粒的提取(碱裂解法)后，进行PCR的鉴定。对PCR鉴定得到阳性克隆进行序列测定，DNA序列测定由上海博亚生物工程公司(中国上海市龙吴路1594号)完成。获得冠毒素基因的DNA序列(SEQ ID NO2)。引物特异性检测的PCR反应，使用上述的引物，以全部靶标菌和非靶标菌的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司(中国上海市松江工业区茸兴路111号)的Taq DNA Polymerase，选用Mg²⁺分装buffer，以50μl体系进行扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋，北京：高等教育出版社，1993)进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，(溴化乙锭)EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。用无菌水配制目标菌菌株3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液和非靶标菌3×10⁸CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml EP管中，沸水煮15分钟。吸取2μl作为模板，以50μl体系进行扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋，北京：高等教育出版社，1993)进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，(溴化乙锭)EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。

3.番茄细菌性斑点病病菌的IMS-PCR检测

将免疫磁珠(IMBs)充分震荡2min至磁性液体变为均一悬浊液，从中吸取500μl(约2×10⁸)，放入4ml离心管。用PBS(pH7.2)洗涤IMBs 3-4次，每次洗涤后将EP管放在磁珠架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗涤完毕，加入3ml PBS重悬磁珠。加入纯化的IgG100μg，于4℃缓慢摇动孵育24h。用4ml PBS-BSA洗涤IMBs 3～4次，并将IMBs重悬于3mlPBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1×10⁷个/ml，待用。吸取包被过的IMBs 50μl加到装有稀释成各种浓度的菌悬液或待检测液的EP管中，混匀。室温缓慢摇动孵育1h，将EP管置于磁珠架上，静置5min，吸去上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15min，取4μl上清液用于PCR反应。PCR反应条件和反应体系与直接菌体PCR反应相同。反应后用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

4.模拟种子带菌直接检测

把培养24小时新鲜的番茄细菌性斑点病菌(Pst26)配成3×10⁸CFU/ml菌悬液浸泡灭菌的番茄种子4小时，然后晾干。把上述种子与健康种子一起放入液体KB培养基中培养8小时。带菌种子比率分别为20/100，10/100，1/100，2/500，1/500，1/1000。取其中的1ml液体做IMS-PCR。

本发明应用免疫学技术、聚合酶链式反应(PCR)技术相结合的检测技术检测目标细菌，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法相比，更能够省时、省空间、准确、灵敏，更能建立快速、准确的种子带菌检测技术。该技术可应用于对番茄种子带细菌性斑点病菌进行快速分子检测，可为番茄的安全生产、种子引进和外销提供技术保障，具有实际的应用价值。

附图说明：

图1为抗体试管凝集法效价测定结果。

图2为抗体ELISA法效价测定结果。

图3为抗体87特异性测定结果。

图4为抗体18特异性测定结果。

图5为全抗体特异性测定结果。

图6为抗体87 ELISA法测定部分目标菌及部分非目标菌的结果。

图7供试菌株总DNA电泳图谱。

其中，道M代表λDNA/HindIII；道1代表Pst的DNA；道2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分别代表非Pst菌株的DNA。

图8为Pst26的总DNA的PCR结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8和9分别代表λDNA/Marker II；镁离子是1.0Mm；1.0Mm；1.0Mm1.0Mm；1.5mM；1.5mM；1.5mM；2.0mM；2.0mM；2.0mM；道1，4，7号为对应的阴性CK。

图9为不同菌株PCR的结果

其中，上排，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分别代表λDNA/Marker II；Pst26；阴性对照；psl-1；JM109；cm；2038；3935；c.m.s；Isl-4；Pslb-27；Aac13。下排道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分别代表DNA/Marker II；Pst26；阴性对照；00224；Po41；2814；SDTB；Eccz；1526；5796；xv；2835。

图10为全菌体的不同浓度的PCR结果。

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、M分别代表λDNA/Marker II；菌的浓度为3×10⁸CFU/ml；3×10⁷CFU/ml；3×10⁶CFU/ml；3×10⁵CFU/ml；3×10⁴CFU/ml；3×10³CFU/ml；3×10²CFU/ml；3×10¹CFU/ml；3×10⁰CFU/ml；λDNA/Marker II。

图11为为全菌体的不同浓度的IMS-PCR结果。

其中，道M、1、2、3、4、5和6分别代表λDNA/Marker II；Pst菌体浓度3×10⁵CFU/ml；3×10⁴CFU/ml；3×10³CFU/ml；3×10²CFU/ml；3×10⁸CFU/ml的杂菌；空白对照。

图12为种子带菌IMS-PCR检测结果

其中，道M、1、2、3、4、5、6、7和8分别代表λDNA/Marker II；Pst26DNA；阴性对照；带菌种子占总种子比率20/100；10/100；1/100；2/500；1/500；1/1000。

具体实施方式：

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了番茄细菌性斑点病菌的抗血清获得、特异性引物的设计，然而这并不意味本发明的引物序列只限于用番茄带细菌性斑点病菌的检测。因此，使用本发明所描述的番茄细菌性斑点病菌的检测技术(免疫磁性分离-PCR技术(IMS-PCR))，检测用引物，以本领域普通技术人员所具有的任何涉及上述的引物、方法检测其他作物病原细菌和其他方面的应用，均包括在本发明所要求的权利范围之内。由于本发明是对番茄细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的检测，因此应用本发明对任何种子带细菌性斑点病菌的检测均也包括在本发明所要求的权利范围之内。

实施例1.番茄细菌性斑点病菌的抗血清获得

参照《兽医微生物学及免疫学技术》、《植病研究方法》、《精编分子生物学实验指南》中的方法进行菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备、菌体全蛋白抗原的制备、免疫家兔、测定血清效价和抗体专一性(试管凝集法、间接ELISA法)、间接ELISA法测定抗原的检测精度。

制备无鞭毛的整个菌体抗原和硫酸铵沉淀法制备菌体蛋白抗原，将得到的干燥蛋白配成浓度300μg/ml的蛋白溶液，即为注射用蛋白抗原。参照《植病研究方法》免疫家兔，取血收集全部血清，加NaN₃防腐。试管凝集法(见图1)和ELISA法测定效价(见图2)，全菌体免疫家兔得到效价为640的血清。两种蛋白抗原：Pst2844-87菌体蛋白抗原及pst18菌体蛋白抗原免疫家兔，得到效价均在1280以上，但不到2560(见图3、图4、图5)，三种抗血清分别记为：抗全菌体血清、抗87血清和抗18血清。间接ELISA确定合适待测菌悬液浓度和检测抗体专一性，3×10⁶可作为检测用浓度。三种抗体对所有供试pst菌都呈阳性反应，与非抗原菌有假阳性反应(见图6)。说明所获得的血清直接用于病菌的检测存在着假阳性的风险，但对于本发明来说只是利用抗血清的免疫分离作用，完全可以利用所获得的抗血清。

实施例2.番茄细菌性斑点病菌的常规PCR检测

参照《精编分子生物学实验指南》，采用CTAB法提取所有靶标及非靶标细菌(表1和表2)的染色体DNA，见图7，为部分菌株染色体DNA。

                    表1供试番茄细菌性斑点病(靶标)菌株

代号	菌株学名	中文名
			Pst1～Pst35	Pseudomonas syringae pv.tomato	丁香假单胞菌番茄致病变种

Pst38Pst40～Pst45Pst47Pst2844-87

P.syringae pv.tomatoP.syringae pv.tomatoP.syringae pv.tomatoP.syringae pv.tomato

丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌番茄致病变种丁香假单胞菌番茄致病变种

               表2供试非番茄细菌性斑点病(非靶标)菌株

代号	菌株学名	中文名
			2826773331832584C.m.mC.m.sEccZ4-215231411850JM109Psl-1Psl-2Psl-8Psp5SM-15B-139352814	Acidovorax avenae subsp.cattleyaeA.avenae subsp.konjaciA.avenae subsp.avenaeCurtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciensClavibacter michiganensis subsp.michiganensisC.michiganensis subsp.sepedonicumErwinia carotovora subsp.carotovoraE.carotovora subsp.atrosepticaE.hebicolaE.ananasEscherichia coliPseudomonas syringae pv.lachrymansP.syringae pv.lachrymansP.syringae pv.lachrymansP.syringae pv.phaseolicolaP.syringae subsp.savastanoiP.syringae pv.maculicolaP.syringae pv.maculicolaP.syringae pv.apii	燕麦食酸菌卡特莱兰亚种燕麦食酸菌蘑芋亚种燕麦食酸菌燕麦亚种萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种密执安棒形杆菌密执安亚种密执安棒形杆菌环腐亚种胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种草生欧文氏菌凤梨腐烂病欧文氏菌大肠杆菌丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌流泪致病变种丁香假单胞菌菜豆致病变种丁香假单胞菌萨氏亚种丁香假单胞菌斑点致病变种丁香假单胞菌斑点致病变种丁香假单胞菌芹致病变种

283530233113245221895707ISL4TE-6PO41SDTB00224Xcm6XV14008

P.syringae pv.tabaciP.syringae pv.syringaeP.syringae pv.coronafaciensP.syringae pv.pisiP.syringae pv.glycineaP.cichoriiP.fluorescens biovar IIRalstonia(Pseudomonas)solonacearumRalstonia(Pseudomonas)solanacearumXanothomonas oryzae pv.oryzicolaXanothomonas oryzae pv.oryzaeX.campestris pv.malvacearumX.campestris pv.vesicatoriaX.campestris pv.campestris

丁香假单胞菌烟草致病变种丁香假单胞菌丁香致病变种丁香假单胞菌燕麦晕斑致病变种丁香假单胞菌豌豆致病变种丁香假单胞菌大豆致病变种菊苣假单胞菌荧光假单胞菌II型茄假单胞菌茄假单胞菌油菜黄单胞菌水稻生致病变种油菜黄单胞菌水稻致病变种油菜黄单胞菌锦葵致病变种油菜黄单胞菌疱斑致病变种油菜黄单胞菌油菜致病变种

运用Beacon Designer 2.0和DNA Club等软件进行引物设计，确定引物为(SEQ ID NO1)：

Primer1(+)(正向引物)：5’ACA TCA TTG CCA GTT ACG GTA C3’22bp

Primer1(-)(反向引物)：5’CGT CAT AAA TGC TGT ACT AAA GAG G3’25bp

使用所设计的斑点病菌引物进行引物专一性检测，以全部靶标菌和非靶标菌的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司(中国上海市松江工业区茸兴路111号)的Taq DNAPolymerase，选用Mg²⁺分装buffer，以50μl体系进行扩增。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，溴化乙锭染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。经过多次PCR，进行反应条件和Mg²⁺浓度的摸索，最终确定退火温度为60℃，Mg²⁺浓度为1.5mM。在此反应条件下进行PCR，以所有靶标菌株染色体DNA为模板的反应均成阳性，扩增产生670bp条带一条(SEQID NO2，黑体字母之间为为冠毒素部分基因DNA序列)，而全部非靶标菌均呈阴性(见图8)。图9为以部分靶标和非靶染色体DNA为模板进行PCR的电泳结果。表明引物是特异性的，可用于区分目标菌和非目标菌。

使用所设计的斑点病菌引物，以菌株Pst-26的染色体DNA为模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相应buffer，以50μl体系进行扩增。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。经过PCR产物的回收、测序，获得扩增产物的全序列(SEQ ID NO2序列)，即为番茄细菌性斑点病菌的冠毒素基因部分DNA序列。

用无菌水配制果斑病菌菌株Pst-26的3×10⁸～3×10¹CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml离心管中，沸水煮15分钟。分别取4μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应。实验参照《现代分子生物学实验技术》进行。反应结束后，用1％agarose、TAE缓冲液进行电泳，(溴化乙锭)EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定以Pst-26进行直接菌体PCR，其反应呈阳性的最小菌浓度约为3×10⁵CFU/ml，如图10所示。

实施例3.免疫吸附PCR(IMS-PCR)检测番茄斑点病菌

在4℃不断搅拌下，往2体积的含有IgG的混合物中，逐滴加入1体积pH7.0的SAS溶液。加完后置于4℃，不间断地搅拌此混合物2～4小时以形成沉淀，12,000g离心20min。用预冷的33％SAS溶液在旋涡混合器上振荡洗涤沉淀，所用溶液的体积与原含IgG的混合物等体积。12,000g离心20min，尽弃上清，加入与原含IgG混合液等体积的PBS(pH7.4)，在旋涡混合器上温和振荡以将沉淀溶解。4℃透析IgG溶液48h以上，期间换3次缓冲液(每次换4L)。将透析管内溶物分装于1.5mL eppendorf管，-20℃冷冻。

将免疫磁珠(IMBs)充分震荡2min至磁性液体变为均一悬浊液，从中吸取500μl(约2×10⁸)，放入4ml离心管。用PBS(pH7.2)洗涤IMBs 3-4次，每次洗涤后将EP管放在磁珠架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗涤完毕，加入3ml PBS重悬磁珠。加入纯化的IgG100μg，于4℃缓慢摇动孵育24h。用4ml PBS-BSA洗涤IMBs 3~4次，并将IMBs重悬于3mlPBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1×10⁷个/ml，待用。

吸取包被过的IMBs 50μl加到装有稀释成各种浓度的菌悬液或待检测液的EP管中，混匀。室温缓慢摇动孵育1h，将EP管置于磁珠架上，静置5min，吸去上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15min，取4μl上清液用于PCR反应。PCR反应条件和反应体系与直接菌体PCR反应相同。反应后用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

不同浓度的全菌体IMS-PCR结果，由图11可知，菌的浓度从到10⁶CFU/ml到10²CFU/ml都有带，带的亮度随菌的浓度增加而变亮；而杂菌和对空白照都没有带。也就是说IMS-PCR的检出临界值是10²CFU/ml。

实施例4模拟种子带菌直接检测

带菌种子抽样的模拟，将健康番茄种子1000粒置于500ml三角瓶，121℃灭菌20分钟，待用。制备Pst-26 3×10⁸CFU/ml菌悬液，浸泡无菌正常种子30分钟，于超净工作台吹干。将不同数量的种子放入三角瓶中，模拟带菌种子比率分别为20/100，10/100，1/100，2/500，1/500，1/1000。取其中的1ml液体做IMS-PCR。吸取1ml培养液，置于1.5ml EP管中。加入包被过的IMBs 50μl，室温缓慢摇动孵育1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5分钟，吸取上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15分钟，取4μl上清液用于常规PCR。经过IMS-PCR，发现每千粒灭菌种子中含有的一粒病种子仍可以检测到(见图12)。

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ ID NO1(番茄细菌性斑点病菌检测用引物)：

正向引物(22bp)：5’acatcattgc cagttacggt ac     3’

反向引物(25bp)：5’cgtcataaat gctgtactaa agagg  3’

SEQ ID NO2(番茄细菌性斑点病菌(Pst26)菌株冠毒素基因DNA部分测序)：

aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac gattacatca ttgccagtta    60

cggtacgggc taggagaaag tgttgacatt cgaattgatc cgctcgggtt catagtcgca    120

acaaatcgct ctggagacgg tgggatgtcg gcatggatac ccattgcgtg ctgcagagct    180

tcgcgcatgt cactccaatc agttatagcg ctacgcatat cgtccacatt ctcatgtggc    240

agcattcccg gattgattcc tgacgctccc gtcatgtacc tatgctgcat gtccgccata    300

tccagtgttc tttgcgtatg tgagtaaaga ttgttgtagc gatttctcag gctttgaggt    360

gcttggctac taacaaattc atgctgatct cttggtagac cagcagactc cgcaagttga    420

tgtctgacgc tcagcagttg actggacgtt acgttatctt cgtcacccga gttgttacta    480

actcggtctg gggagttcac ctgatgggcc atcctggatc cgccgacaca tatatttccc    540

attcgtatac cctctttagt acagcattta tgacgaatct ctagaggatc cccgggtacc    600

gagctcgaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgta tccgctcaca    660

attccacaca                                                           670

Claims (4)

1.一种番茄细菌性斑点病种子带菌快速检测的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

1)制备番茄细菌性斑点病菌抗血清，用该血清制备免疫磁珠。

2)以番茄细菌性斑点病菌染色体DNA或病菌菌体为模板，进行PCR扩增。

3)免疫磁珠吸附富集番茄细菌性斑点病病菌，进行PCR扩增。

4)带菌番茄种子培养基中培养，免疫磁珠吸附富集菌体，进行PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的一种番茄细菌性斑点病种子带菌快速检测的方法，其特征在于以含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列为引物进行PCR特异性扩增。

3.根据权利要求1所述的一种番茄细菌性斑点病种子带菌快速检测的方法，其特征在于特异性扩增产物含有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。

4.一种来自番茄细菌性斑点病菌的冠毒素基因的DNA序列，其特征是该序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。

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