CN102534010A

CN102534010A - 稻瘟病菌无毒基因分子检测引物及其应用

Info

Publication number: CN102534010A
Application number: CN2012100135279A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李祥晓; 徐建龙; 王疏; 黎志康
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明涉及稻瘟病菌无毒基因分子检测的引物及其用法，用于稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子检测，属于农作物病害防治和抗病育种领域。设计了两对引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，可以分别检测稻瘟病菌的无毒基因Avrpik和Avrpizt，特异性扩增的DNA片段长度分别为184bp和153bp。适用于稻瘟病菌纯培养物和发病部位稻瘟病菌群体无毒基因组成的分析。

Description

稻瘟病菌无毒基因分子检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及稻瘟病菌无毒基因分子检测的引物及其用法，专用于稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子检测，属于农作物病害防治和抗病育种领域。

背景技术

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae(无性态：Pyricularia oryzae)引起的一种突发性强、易于流行的水稻病害，是世界各水稻产区广泛分布的重要病害之一。利用寄主抗性，培育和种植抗病品种可以有效地控制植物病害的发生。迄今，通过广泛的遗传分析，已定位了85个稻瘟病抗性基因和347个数量性状位点(Quantitative trait loci，QTL)，绝大部分的基因和QTL被定位在水稻的不同染色体上，其中pi21、Pi21、Pi22、Pi23、Pi34、Pi35(t)、Pb1、Pif、Pikur1、Pikur2、Pi-sel 11个属于单基因控制的部分抗性基因，其余的74个均为主效抗性基因。在85个基因中，70个基因采用分子标记进行了染色体定位，5个基因通过与已知基因的等位性测定确定了其染色体位置。目前已从水稻中克隆了13个稻瘟病抗性基因，即Pib、Pita、Pi2、Pi9、Pi-zt、Pi-d2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3、Pikh以及2个QTL位点，即P21和Pb1。

水稻对稻瘟病的抗性属于典型的小种专化性抗性，水稻的抗病基因与病菌的无毒基因之间存在特异性识别。病菌无毒基因与寄主植物抗病基因之间可以发生符合“基因对基因假说”的相互作用，即寄主植物中每个显性的抗病基因，在病原菌中对应一个显性的无毒基因。寄主的抗病基因产物通过直接或间接的方式对病原菌的无毒基因产物进行识别，启动防卫反应，进而产生对病原菌的抗性，只有寄主植物中存在相应的抗病基因，而病菌中又存在相应的无毒基因，植株才会表现出抗病性。

目前虽然已鉴定出较多的抗稻瘟病基因，但是考虑到基因的抗谱，在特定水稻种植地区能够应用的抗病基因数目仍然有限。由于QTL表达受环境等因素影响较大，长期以来抗病育种中应用的大都是主效抗病基因，因此，导致生产中存在的突出问题是携带单一稻瘟病抗病基因的水稻品种大面积推广种植3-5年后即变为感病品种，这也是长期困扰育种家和植物病理学家的难题。

稻瘟病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，无毒基因是病原菌中决定寄主植物品种特异抗性表达与否的基因，其缺失、表达破坏或功能区域的变异将导致病原菌群体中产生新的毒性小种，继而导致含有对应抗病基因的作物品种丧失抗病性。了解和监测田间稻瘟病菌的无毒基因组成可以为通过品种合理布局和轮换防治稻瘟病以及选用抗病基因进行抗病育种工作提供重要的信息。

鉴定稻瘟病原菌无毒基因的传统方法是利用携带单一稻瘟病抗病基因的近等基因系或单基因系，通过在水稻苗期进行人工接种，观察植株的抗感反应型来分析病菌所携带的无毒基因。采用人工接种技术鉴定病菌的无毒基因，首先需要从植株的发病部位分离获得病菌的单孢子培养物，然后种植鉴别品种，在4-5叶期喷雾接种。该方法的主要缺陷是需要分离病菌，人工接种耗时较长，从育苗至完成植株表型调查至少需要30天；另外，人工接种后水稻植株需要低温和保湿处理，如果同时对多个菌株进行接种分析，需要相互隔离，因而需要较大的能控制环境条件的空间。

稻瘟病菌无毒基因的克隆和分子检测技术的发展为检测病菌无毒基因提供了可能。目前国内外研究者已定位了40多个稻瘟病菌无毒基因，其中9个已被克隆。PWL1和PWL2首先被克隆出来，2000年以后，AvrPi-ta、Avr1-CO39、ACE1、AvrPiz-t、AvrPia、AvrPii、AvrPik/km/kp等7个无毒基因又先后被克隆。设计稻瘟病菌无毒基因特异性引物，通过PCR或荧光定量PCR技术，将有效地分析稻瘟病菌无毒基因，可以为快速鉴定田间稻瘟病菌的无毒基因组成和分布提供一种新技术。

发明内容

本发明的目的在于提供瘟病菌无毒基因分子检测的引物，用于稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子检测。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

稻瘟病菌无毒基因快速分子检测引物，包括稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt特异性扩增引物两对，即Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，其序列分别为：

Avrpik-F 5’-actttgggaactgtcgctgtc-3’；

Avrpik-R 5’-agctgtaacaggttccagcatc-3’；

Avrpizt-F 5’-aaaccagggcagccaaaga-3’；

Avrpizt-R 5’-attcccaatcgagccaacg-3’。

其中Avrpik-F/R在携带无毒基因Avrpik的稻瘟病菌株上扩增出184bp的产物；Avrpik-F/R在携带无毒基因Avrpizt的稻瘟病菌株上扩增出153bp的产物(图1)。上述稻瘟病菌无毒基因分子检测引物的用法包括：

(1)稻瘟病菌单孢菌株无毒基因的检测

将稻瘟病菌菌株转接在番茄燕麦培养上，于26℃条件下培养5-7天，刮取培养基表面的菌丝和孢子约5mg用于DNA提取。液氮研磨菌体，加入600μl CTAB抽提液，65℃处理30min，每隔10min震荡一次，加入等体积的苯酚，置于摇床上轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min，取上清，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min，小心抽取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min。重复上两个步骤，直至有机相和水相之间无蛋白层出现，取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，产生絮状沉淀，用玻璃棒将DNA搅出，置于1.5mL干净离心管，75％乙醇清洗2次，吹干后溶于TE，保存于-20℃备用。

采用两对特异性引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25μl，含10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，10μmol/L 1.0μl正向和反向引物，5U/μl Taq酶0.2μl，，20ng/μl模板DNA2μl，ddH₂O 16.3μl。PCR反应程序为：94℃5min，94℃45s，56或59℃45s，72℃1.5min，35个循环，终延伸72℃10min。扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，经染色后观察扩增产物的大小判定结果。

(2)稻瘟病病样上稻瘟病菌无毒基因的检测

田间采集稻瘟病病样，用于提取DNA。称取5mg植株病斑处标样，采用(1)的方法提取DNA，或者采用Epicentre公司的MasterPure^TM DNA Purification Kit提取、纯化DNA。DNA样品溶解于10～20μl TE中，经琼脂糖凝胶电泳检测后保存于-20℃备用。

采用两对特异性引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25μl，含10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，10μmol/L 1.0μl正向和反向引物，5U/μl Taq酶0.2μl，20ng/μl模板DNA2μl，ddH₂O 16.3μl。PCR反应程序为：94℃5min，94℃45s，56-59℃45s，72℃1.5min，35个循环，以及终延伸72℃10min。扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，经染色后观察扩增产物的大小判定结果。

本发明一方面提供了检测稻瘟病无毒基因Avrpik和Avrpizt的特异性引物。为避免由于引物专化性较低，PCR反应中出现假阴性结果或对非目标真菌和非目标无毒基因产生非特异扩增，本发明根据无毒基因Avrpik(GeneBank No.AB498879)和Avrpizt(GeneBank No.EU837058)自身的序列，采用软件CLUSTAL与稻瘟病菌其它无毒基因序列进行比较，寻找特异性序列区域；选择Avrpik和Avrpizt特异性序列区域设计PCR引物，通过Blastn pogram(Http://www.Ncbi.nlm.nil.gov/blast)比较所设计的引物和探针序列与其它生物种是否具有显著的同源性。本发明设计的Avrpik和Avrpizt的特异性引物与其它生物种和无毒基因没有显著同源性。

本发明另一方面提供了使用本发明的特异性引物对稻瘟病菌无毒基因进行检测的方法，该方法的实验步骤为：从待测样品提取DNA，进行PCR检测，通过观察扩增产物的大小判定样品是否携带Avrpik和Avrpizt基因。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1)特异性好、鉴定速度快

采用人工接种的方法鉴定稻瘟病的无毒基因不仅需要从发病部位分离单孢子菌株，还需要种植水稻鉴别品种。本发明设计的引物是稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt的特异性序列，扩增的特异性高，采用基因特异性引物PCR检测方法克服了传统人工接种鉴别技术费事费力的缺点。

2)实用性好、应用范围广

采用设计的特异性引物进行PCR分析，不仅可以检测稻瘟病菌纯合菌株是否含有Avrpik和Avrpizt基因，也可以直接分析水稻稻瘟病病样处病菌无毒基因的组成，直接用于田间稻瘟病菌种群动态的快速检测。

附图说明

图1引物对Avrpik-F/R和AvrpiztF/R对稻瘟病菌基因组DNA的PCR扩增。M：DNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-2：以引物对Avrpik-F/R分别扩增与Pik基因产生抗病反应和感病反应的菌株6a-5和6a-12；3-4：以引物对Avrpizt-F/R分别扩增与Pizt基因产生抗病反应和感病反应的菌株9a-6和8b-2。

图2引物对Avrpik-F/R对来自黑龙江省的稻瘟病菌株的PCR扩增。M：DNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-20：代表来自黑龙江的稻瘟病菌株2a-6，4a-2，6b-11，14b-4，5a-8，18a-1，21b-4，22a-1，22b-3，29a-5，6a-5，10b-1，15b-2，15b-4，19b-1，21b-2，22a-6，25a-7，28a-1，31a-2。

图3采用引物对Avrpizt-F/R对来自黑龙江省的稻瘟病菌株的PCR扩增。M：DNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-20：代表来自黑龙江的稻瘟病菌株4a-2，5a-8，6b-11，6a-5，10b-1，14b-4，19b-1，2a-6，21b-2，15b-2，21b-4，22a-1，22b-3，15b-4，18a-1，22a-6，25a-7，29a-5，28a-1，31a-2。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。

(1)黑龙江省不同地区稻瘟病菌无毒基因分析

将2009年秋季从黑龙江省建三江，尚志、绥化、佳木斯农科所和856农场水稻田采集稻瘟病病样，单孢分离获得的稻瘟病菌株用于Avrpik和Avrpizt无毒基因的检测分析。

首先将保存在滤纸片上的稻瘟病菌各菌株在番茄燕麦培养基斜面上活化，然后在番茄燕麦培养基平板上继代，在26℃条件下培养5-7天，刮取培养基表面的菌丝和孢子约5mg用于DNA提取。液氮研磨菌体，加入600μl CTAB抽提液，65℃保温处理30min，每隔10min震荡一次，加入等体积的苯酚，置于摇床上轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min，取上清，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min，小心抽取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻摇10min，10000rpm，4℃离心10min。重复上两个步骤，直至有机相和水相之间无蛋白层出现，取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇，产生絮状沉淀，用玻璃棒将DNA搅出，置于1.5mL灭菌的离心管，75％乙醇清洗2次，吹干后溶于TE，保存于-20℃备用。

采用两对特异性引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25μl，含10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，10μmol/L 1.0μl正向和反向引物，5U/μl Taq酶0.2μl，20ng/μl模板DNA2μl，ddH₂O 16.3μl。PCR反应程序为：94℃5min，94℃45s，56或59℃45s，72℃1.5min，35个循环，终延伸72℃10min。扩增产物在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，经染色后观察扩增产物的大小判定结果。

图2和图3表明经过特异性引物对Avrpik-F/R扩增，20个菌株中有8个扩增出约184bp的DNA片段，表明这些菌株携带Avrpik基因；12个菌株扩增出约153bp的DNA片段，表明这些菌株携带Avrpizt基因。

为了比较该发明与传统人工接种方法鉴定结果的异同，采用携带Pi-k和Pi-zt基因的水稻单基因系IRBL6和IRBL11分别接种上述20个菌株，观察各菌株在上述两个单基因系上的反应。

将水稻单基因系IRBL6和IRBL11播于塑料育秧瘟内，每盘50穴，每穴播10～12粒，中间及两边播丽江新团黑谷作为感病对照。在植株三叶一心期采用喷雾法进行人工接种，用0.02％Tween20配制孢子悬浮液，分生孢子的浓度为2×10⁶个/ml。接种后黑暗处理24h，自然光照下生长5-7d，期间保持RH＞90％，待感病对照病情稳定后，按国际水稻所稻瘟病苗瘟分级标准进行调查，其中0～3级为抗病、4～9级为感病。3次重复。

表1显示采用Pi-k和Pi-zt特异性引物通过PCR检测的结果与采用抗病单基因系人工接种的结果一致。接种各菌株7-10d后，感病对照丽江新团黑谷叶片病斑面积达叶面积的50～70％，病级均达到9级。IRBL6和IRBL11接种各菌株后叶片的反应为1-8级，其中经PCR检测Avrpik为阳性的菌株，接种IRBL6后叶片的病级均小于3级，表现为抗病反应；经PCR检测Avrpizt为阳性的菌株，接种IRBL11后叶片的病级均在3级以下，表现为抗病反应。两种检测方法均表明同一个菌株可以同时携带无毒基因Avrpik和Avrpizt，但携带Avrpi-zt的频率高于Avrpi-k，在黑龙江地区同时应用抗性基因Pi-zt和Pi-k有利于降低稻瘟病危害。

表1采用PCR和人工接种检测稻瘟病菌的无毒基因Avrpik和Avrpizt

表1中+和-分别表示PCR阳性和阴性反应；S和R分别表示植株表现感病和抗病。

(2)检测稻瘟病病样上稻瘟病菌无毒基因的组成

采用引物对Avrpik-F/R和AvrpiztF/R，对2009年秋季在黑龙江省稻田采集的稻瘟病病样进行PCR检测。样本为发病的穗颈。对颈部样本进行反复清洗，镜检确认样本表面无菌丝和孢子后，剪取约1cm长有病斑的颈，采用Epicentre公司的MasterPure^TM DNA Purification Kit提取、纯化DNA。每个样品的DNA分别溶解于10μl TE缓冲液，取1μl DNA溶液作模板，进行PCR分析，反应体系和反应条件与实例1相同。

表2采用PCR从瘟病菌样本上检测无毒基因Avrpik和Avrpizt

表2结果表明，以从稻瘟病病样提取的DNA为模板，采用引物对Avrpik-F/R和AvrpiztF/R进行PCR检测，能够快速地鉴定侵染植株的稻瘟病菌是否携带无毒基因Avrpik和Avrpiz。除无五常外，其它4个地区的样品中均能检测到Avrpik和Avrpizt基因，表明抗病基因Pi-zt和Pi-k合理利用和布局将有助于提高稻瘟病的防治效果。

Claims

1.稻瘟病菌无毒基因分子检测引物，包括稻瘟病菌无毒基因Avrpik和Avrpizt特异性扩增引物两对，即Avrpik-F，Avrpik-R和Avrpizt-F，Avrpizt-R其序列分别为：

Avrpik-F 5’-actttgggaactgtcgctgtc-3’；

Avrpik-R 5’-agctgtaacaggttccagcatc-3’；

Avrpizt-F 5’-aaaccagggcagccaaaga-3’；

Avrpizt-R 5’-attcccaatcgagccaacg-3’。

其中引物对Avrpik-F/R在携带无毒基因Avrpik的稻瘟病菌株上扩增出184bp的产物；引物对Avrpizt-F/R在携带无毒基因Avrpizt的稻瘟病菌株上扩增出153bp的产物。

2.权利要求1所述的稻瘟病菌无毒基因分子检测引物的用法包括，可以检测稻瘟病单孢菌株是否携带无毒基因Avrpik和Avrpizt，也可以直接检测稻瘟病样上稻瘟病菌无毒基因的组成。