CN109402236A - 一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子植物学领域，公开了一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi‑25的检测方法，所述检测方法：取新鲜水稻植株，在‑80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

Description

一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法

技术领域

本发明属于分子植物学领域，尤其涉及一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产，严重时甚至会造成颗粒无收。稻瘟病又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等，是世界性的重要稻病，世界各稻区均可发生，其中以叶部、节部发生为多，发生后可造成不同程度减产，尤其穗颈瘟或节瘟发生早而重，可造成白穗以致绝产。目前，稻瘟病可能发生在各域内的任何年头、任何季节。稻瘟病是真菌寄生引起，病菌发育最适温病为25℃～28℃，高湿有利分生孢子形成飞散和萌发，而高湿度持续达一昼夜以上，则有利于病害发生流行。土壤温度低，阴雨连绵，日照不足有利于发病，大面积种植高优品种，抗病性差极易导致大面积发病。偏施、迟施氮肥，均易诱发稻瘟病。

源自籼稻品种"谷梅2号"的抗稻瘟病主效基因Pi-25，Pi-25定位于水稻第6染色体标记A7和RG456之间，对中国稻瘟菌菌系92-183(小种ZC15)有较强的叶瘟和穗瘟抗性。

现有的技术中，通常根据抗瘟表现对其进行判断，主要是水稻田间的自然鉴定、人工接种鉴定，工作量大，鉴别难度大、准确性差、研究人员室外工作时间长；其次采用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，该方法易造成假阳性的判断。综上，现有方法浪费大量的人力物力、工作量大、鉴别难度大、准确率低。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有的技术中，通常根据抗瘟表现对其进行判断，主要是水稻田间的自然鉴定、人工接种鉴定，工作量大，鉴别难度大、准确性差、研究人员室外工作时间长；

(2)采用分子标记辅助选择进行抗病育种时，所选用的多是与抗病基因连锁的SSR标记，该方法易造成假阳性的判断，鉴别不准确。

(3)现有技术中采用的PCR扩增仪在工作参数受温度、湿度的影响易波动，使得扩增的DNA质量差；电泳仪受电压的影响，出现波动引起电泳胶带出现模糊的现象，影响胶带质量；凝胶成像系统对电泳胶进行照相处理时，照片的清晰度不佳，电泳条带不清楚，影响对于结果的查看与分析。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，

本发明是这样实现的，一种稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，所述水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法包括：

步骤一：取新鲜水稻植株，在-80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；

步骤二：引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；

步骤三：基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；

步骤四：PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；

步骤五：酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；

步骤六：电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

进一步，所述步骤四中，PCR扩增体系为3μL DNA模板、0.7U Taq聚合酶、3μL 10×PCR缓冲液、2.0μL dNTPs(2.5mmol/L)、0.7μL正向引物(10μmol/L)和0.7μL反向引物(10μmol/L)，ddH₂O补足至20μL。

进一步，所述步骤四中，所述PCR扩增采用PCR扩增仪对DNA片段进行扩增，在扩增过程中，采用GM(1，N)模型对PCR扩增仪的工作参数的数据进行建模，保持扩增过程工作参数控制的准确度，提高扩增质量；具体实施如下：

(1)构造PCR扩增仪的数据时间序列，建立原始数据序：

选取被校正PCR扩增仪的测得值作为系统特征行为变量而对应的检测量设定为因子变量实验温度为因子变量湿度为因子变量

(2)进行数据处理，取X⁽⁰⁾为x⁽⁰⁾的1-AGO序列，即为一次累加序列：

其中，称D为X⁽⁰⁾的一次累加生成算子；

(3)建立起行为与因子间的灰微分方程，PCR扩增仪的灰色GM(1，N)模型及对应的白化方程为：

式中：k＝1，2，3，…，n，a为模型的发展系数，反映预测数据x₁的发展态势，b为灰作用量，反映数据间的变化关系；为PCR扩增仪的白化背景值，反映信息浓度的大小；

(4)通过对灰色模型在最小二乘法准则下的处理，可以得到：

且白化方程时间响应为：

式中：k＝2，3，…，n，B为GM(1，N)模型的系数矩阵，Y为行为变量矩阵；

(5)以上PCR扩增仪模型的建立以及运算，得到GM(1，N)模型在对应k处的预测值，其中通过累减生成算子可以得到：

(6)通过建立的GM(1，N)模型得到的在对应点处的预测值以及实际值比较，对PCR扩增仪采用的模型进行模型精度评价；

相对残差：

残差均值：

模型精度：

进一步，所述步骤六中的电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相；所述电泳，电泳仪内设有微型稳压器；稳压器中两个运放，均采用负反馈电路，且带隙电压基准电路的输出经过输出放大器的跟随结构直接输出，因此稳压器输出电压VOUT和偏移ΔVOUT：

其中R2/R3为带隙电压基准电路中的电阻比，V_EB1和V_EB2为NPN三极管Q1和Q2的发射极－基极电压，ΔV_IN1|diff和ΔV_IN2|diff分别为两级运放的输出电压偏移；

所述用凝胶成像系统对电泳胶进行照相，凝胶成像系统采用十字线灰度图像清晰度计算的改进模型，十字线灰度图像由mxn个像素构成，像素灰度值矩阵B(I，J)，其中0≤I≤m-1，0≤J≤n-1；

十字线灰度图像最大灰度值B_max，最小灰度值B_min，那么灰度差值的1/2用B_dif表示为：

灰度图像的清晰度为C，可得到十字线灰度图像清晰度改进模型为：

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，具有快速、高效、高精准性、节约大量人力等特点，并能大大降低鉴别难度。

本发明采用PCR扩增仪对DNA片段进行扩增，在扩增过程中，采用GM(1，N)模型对PCR扩增仪的工作参数的数据进行建模，保持扩增过程工作参数控制的准确度，提高扩增质量；电泳仪内设有微型稳压器，保证电泳仪能得到稳定的电压，不受电压的影响，保证电泳仪工程过程中的稳定性；凝胶成像系统采用十字线灰度图像清晰度计算的改进模型，在对电泳胶进行照相处理时，提高照片的清晰度，电泳条带清楚。

附图说明

图1是本发明实施例提供的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明实施例提供的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法：

S101：取新鲜水稻植株，-80℃冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；

S102：引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；

S103：基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；

S104：PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；

S105：酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；

S106：电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

步骤S104中，本发明提供的PCR扩增体系为3μL DNA模板、0.7U Taq聚合酶、3μL 10×PCR缓冲液、2.0μL dNTPs(2.5mmol/L)、0.7μL正向引物(10μmol/L)和0.7μL反向引物(10μmol/L)，ddH₂O补足至20μL。

所述PCR扩增，采用PCR扩增仪对DNA片段进行扩增，在扩增过程中，采用GM(1，N)模型对PCR扩增仪的工作参数的数据进行建模，保持扩增过程工作参数控制的准确度，提高扩增质量；具体实施如下：

Setp1：构造PCR扩增仪的数据时间序列，建立原始数据序：

选取被校正PCR扩增仪的测得值作为系统特征行为变量而对应的检测量设定为因子变量实验温度为因子变量湿度为因子变量

Step2：进行数据处理，取X⁽⁰⁾为x⁽⁰⁾的1-AGO序列，即为一次累加序列：

其中，称D为X⁽⁰⁾的一次累加生成算子。

通过数据的累加处理，提高序列的光滑度，降低了原序列数据的离散度，使得原始数据的特性与规律更明显；

Step3：建立起行为与因子间的灰微分方程，PCR扩增仪的灰色GM(1，N)模型及对应的白化方程为：

式中：k＝1，2，3，…，n，a为模型的发展系数，反映预测数据x₁的发展态势，b为灰作用量，反映数据间的变化关系；为PCR扩增仪的白化背景值，反映信息浓度的大小；

Step4：通过对灰色模型在最小二乘法准则下的处理，可以得到：

且白化方程时间响应为：

式中：k＝2，3，…，n，B为GM(1，N)模型的系数矩阵，Y为行为变量矩阵；

Step5：以上PCR扩增仪模型的建立以及运算，可以得到GM(1，N)模型在对应k处的预测值，其中通过累减生成算子可以得到：

Step6：通过建立的GM(1，N)模型得到的在对应点处的预测值以及实际值比较，对PCR扩增仪采用的模型进行模型精度评价；

相对残差：

残差均值：

模型精度：

步骤五中的酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；

步骤六中的电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

所述电泳，电泳仪内设有微型稳压器，保证电泳仪能得到稳定的电压，不受电压的影响，保证电泳仪工程过程中的稳定性；

稳压器中两个运放，均采用负反馈电路，且带隙电压基准电路的输出经过输出放大器的跟随结构直接输出，因此稳压器输出电压VOUT和偏移ΔVOUT可如下。

其中R2/R3为带隙电压基准电路中的电阻比，V_EB1和V_EB2为NPN三极管Q1和Q2的发射极－基极电压，ΔV_IN1|diff和ΔV_IN2|diff分别为两级运放的输出电压偏移。

所述用凝胶成像系统对电泳胶进行照相，凝胶成像系统采用十字线灰度图像清晰度计算的改进模型，在对电泳胶进行照相处理时，提高照片的清晰度，电泳条带清楚。

十字线灰度图像由m x n个像素构成，像素灰度值矩阵B(I，J)，其中0≤I≤m-1，0≤J≤n-1。

十字线灰度图像最大灰度值B_max，最小灰度值B_min，那么灰度差值的1/2用B_dif可表示为：

灰度图像的清晰度为C，可得到十字线灰度图像清晰度改进模型为：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法包括：

步骤一：取新鲜水稻植株，在-80℃进行冻干处理，研磨成细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻植株的DNA；

步骤二：引物：检测Pi25的引物对为CAP1F/R的引物序列，限制性内切酶为HincII；

步骤三：基因组DNA提取：用CTAB法提取水稻基因组DNA，1％的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA；

步骤四：PCR扩增：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，73℃延伸30s，35个循环；73℃延伸3min；

步骤五：酶切：取15μL的利用CAP1引物PCR扩增产物，加入3μL酶切缓冲液，1.5μLHincⅡ限制性内切酶，补ddH₂O 5μL至20μL体系，37℃对产物酶切位点进行酶切；

步骤六：电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相。

2.如权利要求1所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，PCR扩增体系为3μL DNA模板、0.7U Taq聚合酶、3μL 10×PCR缓冲液、2.0μLdNTPs(2.5mmol/L)、0.7μL正向引物(10μmol/L)和0.7μL反向引物(10μmol/L)，ddH₂O补足至20μL。

3.如权利要求2所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤四中，所述PCR扩增采用PCR扩增仪对DNA片段进行扩增，在扩增过程中，采用GM(1，N)模型对PCR扩增仪的工作参数的数据进行建模，保持扩增过程工作参数控制的准确度，提高扩增质量；具体实施如下：

(1)构造PCR扩增仪的数据时间序列，建立原始数据序：

选取被校正PCR扩增仪的测得值作为系统特征行为变量而对应的检测量设定为因子变量实验温度为因子变量湿度为因子变量

(2)进行数据处理，取X⁽⁰⁾为x⁽⁰⁾的1-AGO序列，即为一次累加序列：

其中，称D为X⁽⁰⁾的一次累加生成算子；

(3)建立起行为与因子间的灰微分方程，PCR扩增仪的灰色GM(1，N)模型及对应的白化方程为：

式中：k＝1，2，3，…，n，a为模型的发展系数，反映预测数据x₁的发展态势，b为灰作用量，反映数据间的变化关系；为PCR扩增仪的白化背景值，反映信息浓度的大小；

(4)通过对灰色模型在最小二乘法准则下的处理，可以得到：

且白化方程时间响应为：

式中：k＝2，3，…，n，B为GM(1，N)模型的系数矩阵，Y为行为变量矩阵；

(5)以上PCR扩增仪模型的建立以及运算，得到GM(1，N)模型在对应k处的预测值，其中通过累减生成算子可以得到：

(6)通过建立的GM(1，N)模型得到的在对应点处的预测值以及实际值比较，对PCR扩增仪采用的模型进行模型精度评价；

相对残差：

残差均值：

模型精度：

4.如权利要求1所述的水稻育种材料中抗稻瘟病基因Pi-25的检测方法，其特征在于，所述步骤六中的电泳完成后，用凝胶成像系统对电泳胶进行照相；所述电泳，电泳仪内设有微型稳压器；稳压器中两个运放，均采用负反馈电路，且带隙电压基准电路的输出经过输出放大器的跟随结构直接输出，因此稳压器输出电压VOUT和偏移ΔVOUT：

其中R2/R3为带隙电压基准电路中的电阻比，V_EB1和V_EB2为NPN三极管Q1和Q2的发射极－基极电压，ΔV_IN1|diff和ΔV_IN2|diff分别为两级运放的输出电压偏移；

所述用凝胶成像系统对电泳胶进行照相，凝胶成像系统采用十字线灰度图像清晰度计算的改进模型，十字线灰度图像由mxn个像素构成，像素灰度值矩阵B(I，J)，其中0≤I≤m-1，0≤J≤n-1；

十字线灰度图像最大灰度值B_max，最小灰度值B_min，那么灰度差值的1/2用B_dif表示为：

灰度图像的清晰度为C，可得到十字线灰度图像清晰度改进模型为：