CN108034753A

CN108034753A - 一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108034753A
Application number: CN201810035647.6A
Authority: CN
Inventors: 肖栋; 刘东让; 侯喜林; 李英; 张昌伟; 刘同坤; 王建军; 胡春梅
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-05-15

Abstract

本发明提供了一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示BrFLC1_A10基因的第58个碱基，所述碱基为A或C，SNP分子标记的基因型为A/A时，不结球白菜为早开花型；SNP分子标记的基因型为C/C时，不结球白菜为晚开花型。本发明还提供用于检测与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记的特异性引物对，同时提供不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记在鉴定不结球白菜开花时间以及在不结球白菜辅助育种中的应用。还提供用于检测与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记的特异性引物对在鉴定不结球白菜开花时间中以及在不结球白菜辅助育种中的应用。

Description

一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学，分子标记领域，具体涉及一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

不结球白菜(Brassica rapa ssp.Chinensis)是十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)中重要的叶菜类蔬菜，起源于中国。不结球白菜在中国被广泛栽培，长江中下游地区占蔬菜复种面积的30％-40％，在东南亚、日本、美国以及欧洲国家也均有广泛引种。

开花时间是不结球白菜营养生长到生殖生长的重要标志，而其开花时间、抽薹时间与其商品性有密切关系，不结球白菜中未成熟先抽薹、开花的现象直接影响了不结球白菜的产量和质量。我国长江中下游地区不结球白菜生产中一个很大的难题就是控制先期抽薹、开花。因此，选育耐抽薹、晚开花优质的新品种，已经成为不结球白菜育种中的重要目标。开发与开花时间相关的分子标记，可分子标记辅助育种提供一定的理论依据；对于选育耐抽薹、晚开花的新品种具有十分重要的应用价值。

抽薹、开花是由内源发育信号和多种环境因素共同调控的，其中环境温度和光周期是影响植物开花时间的主要因子。例如：开花时间受春化途径、光周期途径和生理钟反应、自主途径、赤霉素途径、环境温度途径和年龄途径的调控等，其中春化途径是指用10℃以下的低温处理数周或数天，已有研究表明，春化途径中主要的调控基因是FLC(FLOWERINGLOCUS C)家族基因，基于大白菜基因组测序信息(http://brassicadb.org/brad/)，FLC家族基因全长在白菜A基因组上的位置为第10号染色体A10：13856133..13860473(版本1.5)，DNA序列长度为4341bp，它是抑制开花的主要因子，编码MADs-box的转录调控因子。MADs-box的转录调控因子在植物提上发挥重要作用，在营养生长向生殖生长的转变及花器官的形成均有调控作用。本发明在春化途径调控开花时间的候选基因BrFLC1_A10基因上找到的与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP属首次发现。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示BrFLC1_A10基因的第58个碱基，所述碱基为A突变为C，导致氨基酸由苏氨酸到脯氨酸的突变。

本发明第二个目的是提供用于检测与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记的特异性引物对。

进一步的，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-AAATTAGGGCGCAAAGCA-3′；

反向引物：5′-AGAGAACGGAAAGCTGACGA-3′。

本发明第三个目的是提供不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记在不结球白菜春化途径影响开花时间中的应用。

进一步的，包括如下步骤：

(1)提取待测不结球白菜基因组DNA；

(2)利用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序，确定SNP位点碱基，从而鉴定不结球白菜开花时间。

进一步的，步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；最后72℃延伸5min:；4℃保存。

进一步的，步骤(2)中，PCR反应体系以20ul计，为：Mix10ul、模板DNA1ul、上游引物1ul、下游引物1ul、dd H₂O7ul。

进一步的，SNP分子标记的基因型为A/A时，不结球白菜为早开花型；SNP分子标记的基因型为C/C时，不结球白菜为晚开花型。

本发明第四个目的是提供不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记在不结球白菜辅助育种中的应用。

本发明第五个目的是提供用于检测与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记的特异性引物对在鉴定不结球白菜开花时间中的应用。

本发明第六个目的是提供用于检测与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记的特异性引物对在不结球白菜选育中的运用。

本发明BrFLC1_A10基因的第58个碱基A-C的变异(基因组位置，A10：13856190)显著影响开花时间，A位点连锁早开花类型，C位点连锁晚开花类型；且该位点的变异是非同异突变，导致氨基酸由苏氨酸(ACC)变为脯氨酸(CCC)。可以为不结球白菜春化途径影响开花时间研究提供理论依据，为选育晚开花不结球白菜品种提供有效手段。该SNP位点可以做为分子标记进行辅助育种工作，提高晚开花不结球白菜的育种效率，具有快速、准确、不受环境条件干扰的优点；在聚合有利性状的同时，还可以通过遗传背景选择，减少连锁累赘，加快育种进程。

附图说明

图1：BrFLC1_A10上SNP分子标记差异点位置示意图；

图2：实施例1中F₂代分离群体验证不同基因型的开花时间箱型图；

其中○表示最大值，△表示最小值，□表示平均值，*表示P值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明选择春化途径调控开花时间的候选基因BrFLC1_A10，在起源于36个国家的213份白菜类作物上，使用测序平台IlluminaHiSeq^TM2000进行混池(10个单株)样本深度测序(有效深度>200X)，挖掘其多态性，共鉴定了380个多态性(SNP/SNV)位点。利用这些位点信息与该自然群体在长日照条件下春化和未春化处理植株的开花时间进行关联分析(广义线性模型，generalized linear model，GLM)，发现位于BrFLC1_A10基因第一个外显子上的一个A-C的变异位点与开花时间显著相关(LOD＝12.8)，该位点是BrFLC1_A10基因第58个碱基，该位点的突变会影响氨基酸由苏氨酸(ACC)到脯氨酸(CCC)的突变。

进一步，对该位点在F₂代分离群体上进行了验证，选用的供试材料为纯合的一年生早花类型Yellow sarson‘YS-143’为母本和两年生晚花类型普通白菜Pac choi‘PC-175’为父本。选取亲本各10株以及F₂分离群体180株，于2016年9月14日至2017年2月26日生长于南京农业大学句容农博园塑料大棚里。观察其开花时间，开花时间调查标准为从催芽到第1朵花开放所需要的时间(天数)。选取F₂群体中极早和极晚开花的植株各24株，使用一代测序技术测定该位点序列。

DNA提取方法为CTAB法，步骤为：(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB 15g、1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)75mL、0.5mol/L的EDTA 30mL、NaCl 61.4g，加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL Buffer TE溶解DNA。

PCR引物利用Primer3Input(version 0.4.0)设计，上游引物位于BrFLC1_A10基因上游启动子区域，距起始密码子18bp长度，下游引物位于BrFLC1_A10基因第一个外显子上，距起始密码子92bp长度，上下游引物之间有113bp长度的序列。用于扩增该位点的引物序列为，正向引物：5′-AAATTAGGGCGCAAAGCA-3′；反向引物：5′-AGAGAACGGAAAGCTGACGA-3′。PCR体系如表1所示。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；最后72℃延伸5min:；4℃保存。

表1 PCR反应体系

测序发现在24株极早开花的植株中，该位点基因型为A/A的有18株(与早花型母本YS-143一致)，占总株数的75％，开花时间为25-36d，平均开花时间31d，基因型为A/C的有3株，C/C的有3株；在24株极晚开花的植株中，该位点基因型为A/A的有0株，A/C的有5株，基因型为C/C的有19株(与晚花型父本PC-175一致)，占总株数的79％，开花时间为55-78d，平均开花时间为60d。因此，BrFLC1_A10该位点基因型为A/A植株的开花时间远早于基因型为C/C植株的开花时间。t测验分析表明，两者之间呈极显著差异(P<0.01)。该验证证明，BrFLC1_A10基因的第58个碱基A-C的变异(A10：13856190)显著影响开花时间，可以为不结球白菜春化途径影响开花时间研究提供理论依据。同时，该SNP位点可以做为分子标记进行辅助育种工作，加快育种进程。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4341

<212> DNA

<213> 不结球白菜(Brassica rapa)

<400> 1

atggggagga agaaacttga aatcaagcga attgagaaca aaagtagccg acaagttacc 60

ttctctaaac gacgcaacgg tctcatcgag aaagctcgtc agctttccgt tctctgtgac 120

gcatccgtcg ctcttcttgt cgtctccgcc tccgggaaac tctacagctt ctcctccggt 180

gataagtacg acttttccta ttctggggtt ttccattatt attgttaatt actaactttt 240

tttcacaaaa aaatataatt atttttaaaa aatacttcct gcgaatcttg tgtggttttc 300

ttggtgtgtg tgttgctact gtgtgttttc tatggccatg agaaatacat gagacaacca 360

aatcaaaaga cgaacaatgt tgtgatgagc taaagcttct ttcttttttt ctttcttttc 420

tctctcttct tcttcttctt cttacaattt ttctgcatgg attttttttt acaaaaaaaa 480

ttgtatgtcc ttcaagatct ttgacacgct gtgatgcata cttgatgtta ctttgtgaag 540

tttatatcca tctttgattg ttagttcatc agctttttag ctttaggaac tcctaatgtt 600

tcagaagagt tttatgtcaa agtaattgtt gattcatgtt tctctttgta gagcaattaa 660

atccattgga tctctcagat ttgtatgcaa tgaaatgcac ttgggggaga tctatagaat 720

ggctgtgaag ttgatgctga ataatagata gagtgtagat tattgtagat caattctttc 780

ttttttttgg ccaaaatagt agatcaattc ttgtaatttc tctctttacc gtgaggttat 840

tacttgatgc ttaccaatat aaagtttcct aactgattct taatttgcat aaagatagta 900

cctttgaatt ttggtagttt tttcagtaaa aaaaaaagaa ttttggtagc ttctggaaaa 960

cacagactca ctgttagtta attttattcg atctagtatc gattgcggtt attttaatcg 1020

gaagcgttgt gtgcactgtg catatataac tctttgtctc gcacataata tacactaatt 1080

ggtctatttt aagactaatt aaattaagtt ttctcttgga ttttcgtaca atacaaatat 1140

acaatgcaaa cccatgtaga taaagttagt gggattgatg gtatattaat agatcaacaa 1200

gtctgcttta attataggta tgccagtgtg cgactatatt ttaggcatac ctaatgattt 1260

tctagaagtt tttctccctt ttattgattt gttgctataa gattatccca agcgtttagt 1320

ttcgcaccct agtagttacg gcacatgcat atgctacatt atgtaattgg atgatagctt 1380

ttaatcgaac tttgtagctt tgttcatttg aattgacaac ccacaacatt gtagcttttg 1440

ttatggaaat gtacgatcac acaaccttgc aactcgtgtt tcttgttgtg gggaattgac 1500

aataacataa cgtatttcct ttggtgcctc ttggaaacca accacctcac caaaaccttt 1560

cttcatggag aaaattgcaa ccccttgtca aaatttaaat ttggtgaagt gtttacttaa 1620

ccctataata ttaaccaact gattgtacag gtttgtctat gttagtgaag atcgcaggtc 1680

atgtctcaat taattaatac ttgttcactc ctcacattga atattaatta agtccagcct 1740

tggaatagct aatcgagatt agttgttgag caaaagaaga aaggctttta gaacctggaa 1800

tttgaccttt agttactcaa taactcaatt gtgcatcctt gattttgttg caaagagctt 1860

aacttcacgg tggaattgaa accttttaac acaaaactgt tgaattagtg gaactgtttt 1920

tcaaatttgc tgggacttct ataaagtcat aaataggaaa tttttgactg tgttcagctg 1980

tcgcttctat gtttttagtt tacatttaca ccttaattgt ttgtttgcat ttacatttgc 2040

gtttccttgt tctagttttc taattactaa aatgtcgatg gacaaacgtg tggggcaaaa 2100

agaaataatt ggggacttag aagcaaactg tcttcacttt gagattaggg ttcgtgtgtg 2160

taccttagtt ttacattaaa atcaaaacca gcgttagaaa ttgattaata ggctaaaata 2220

aaagactaca tatgcaatct ttaattttat ttcaaaattt ccttgagtga caatttcttt 2280

ttcattatat cagtttacaa tatacatgta aagccataag attcatgaga caaccaaact 2340

tagggtaatt cgtggtaaat attagagttc ctttttttcc ttggaagagg ctttttttgg 2400

aacacacctt ggaagagatt aaaagatcat ctgaccatta aaatactgct tagaaaacca 2460

aatgtggttc tgcttaaacg taaatactag tttttctgga atgttaatga aaactatgtt 2520

tgaaaattga acttttgtct ctaattgtct tctctgccct atacatgttc catagtttcc 2580

agttcattct ttcaagggtt agctggtagt tttgatccta acatactttg attttttctt 2640

ctcttctctc cagcctggtc aagatccttg atcgatatgg aaagcaacat gatgatgatc 2700

ttaaagcctt ggtaatacat gcaacactaa tcttctattt gatgtagttt cttaggatta 2760

aatttaccaa attccttgat agtttctact gatcagtagc aattcatgta ggtttgaggg 2820

tttgattttt tttggggggt gttagaatgc attggcatgc ccgcacttaa cggtacacat 2880

ataattacta ttttggagct gtagttatca aaagtttgtt ttcaagatca gcaaattggt 2940

tatacagaga ttgattagga gtgggtaaaa cacatgttta gcaccttaaa tttgtggaga 3000

tcttgtttta ggaattgcgg tattaaacta tttattatct attagttccc ttagtgatcc 3060

ctatatatga gaagatggat cctcatgcac aaccagattt ttaagcttat attacttatc 3120

catgaacagg atcgtcagtc aaaagctttg gactgtggtt cacaccatga gctactggaa 3180

cttgtggaaa ggttagtact aactaaaact cttctctcct ttgatcacag aggaattagg 3240

gtttcttgtc atgctatgat atatgcagca agcttgagga atcaaatgtc gataatgtaa 3300

gtgtgggttc cctggttcag ctggaggaac accttgagaa cgccctctcc gtaacaagag 3360

ctaggaaggt acgttacttc cgtgatgtct tctcttttct tacttttttg tttcaagaac 3420

aaccatgcgc ttatatttaa ttactttgtt gcagacagaa ctaatgttga agcttgtcga 3480

gaaccttaaa gaaaaggtta gatatatgct tccaagttta tagctagcac tttagttata 3540

ttatggtcgt gttgtgttag tttatctaag tctgcttcat gaggtcgcaa gcctatctcc 3600

aacctattgc caatgtatcc tagtcttttc aggaccattt gaatgttttg aattaaaagt 3660

ctgaagttag gtctataaac tttatatatg agtaaattga tgtgttgatc tttaaaacag 3720

gagaagttgc tggaagagga gaaccatgtt ttggctagcc aggtaactaa agtttttttt 3780

gttacggttt aagtttcgat ccgattggca cagttcaagt atatagttct tacttttact 3840

tgctcaaggg taattatata acttgaaaaa gggaaacttg aaaaagggaa gattacatat 3900

tatctgggga gcctaaacca aagtgaagct tgtaggctag tagagaatat gctattttgc 3960

aggctgaaac atgcttgcaa acttaaagtt aaaagctcaa aagtcagaaa cacaaagcat 4020

gaaagcaaga ttcataatcg ttatcagttt aaatttgtag tagcaaaaga atattcctcg 4080

ggtaattaat aaatacagaa atacaatgat agagagagaa gggaatagcc ggaaaagaaa 4140

aaaaagagag ttgaattatt tctaaatgga taaaaagtgg gtttgaccta atatgtattt 4200

attttacaga tggagaagag taatcttgtg cgagccgaag ctgataatat ggatgtctca 4260

ccaggacaaa tctccgacat caatcttccg gtaacgctcc cactgcttaa gggggggtta 4320

gtgggagtgg aatttttata g 4341

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaattagggc gcaaagca 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagaacgga aagctgacga 20

Claims

1.一种与不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于如SEQ ID NO.1所示BrFLC1_A10基因的第58个碱基，所述碱基为A突变为C，导致苏氨酸到脯氨酸的突变。

2.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记的特异性引物对。

3.根据权利要求2所述的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-AAATTAGGGCGCAAAGCA-3′(SEQ ID NO.2)；

反向引物：5′-AGAGAACGGAAAGCTGACGA-3′(SEQ ID NO.3)。

4.权利要求1所述的不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记在鉴定不结球白菜开花时间中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测不结球白菜基因组DNA；

(2)利用权利要求3所述的引物对对权利要求1所述的SNP分子标记进行PCR扩增；

(3)对PCR产物进行测序，确定权利要求1所述的SNP分子标记的碱基，从而鉴定不结球白菜开花时间。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，运行35个循环；最后72℃延伸5min:；4℃保存；PCR反应体系以20ul计，为：Mix10ul、模板DNA1ul、上游引物1ul、下游引物1ul、ddH₂O7ul。

7.根据权利要求4所述的应用，SNP分子标记的基因型为A/A时，不结球白菜为早开花型；SNP分子标记的基因型为C/C时，不结球白菜为晚开花型。

8.权利要求1所述的不结球白菜开花时间紧密连锁的SNP分子标记在不结球白菜选育中的运用。

9.权利要求2所述的特异性引物对在鉴定不结球白菜开花时间中的应用。

10.权利要求2所述的特异性引物对在不结球白菜选育中的运用。