CN113774161A

CN113774161A - 花生荚果和种仁大小主效qtl的kasp分子标记及应用

Info

Publication number: CN113774161A
Application number: CN202111147869.5A
Authority: CN
Inventors: 鲁清; 陈小平; 洪彦彬; 李少雄; 梁炫强; 刘海燕; 李海芬; 刘浩; 王润风
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113774161B

Abstract

本发明涉及分子遗传育种技术领域，公开了花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记，包括SNP1和SNP2，所述SNP1分子标记引物包括正向引物一、正向引物二和通用反向引物一，所述SNP2分子标记引物包括正向引物三、正向引物四和通用反向引物二；还公开了应用。本发明的KASP分子标记遗传距离合适，定位的花生荚果和种仁大小主效QTL遗传力高，技术可靠、经济、简便，可实现高通量分型，能够同时对花生地下荚果和种仁大小两个重要产量性状进行标记辅助选择，鉴定准确且快速，可有效避免花生地下荚果选育的复杂工序，提高育种效率，具有广阔的应用前景。

Description

花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体涉及花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记及应用。

背景技术

花生是我国主要油料与经济作物之一，种植面积常年保持在7000万亩，年总产1700万吨，花生油及花生制品在我国农业经济发展中占有重要地位，进一步提高花生年产量对保障我国花生产业发展具有十分重要的意义。但目前由于耕地面积有限，通过增加播种面积达到提高总产的空间不足，因此在当前稳定的播种面积下，通过提高单产是实现我国花生稳产高产的最有效途径。研究表明花生荚果大小对单产有最直接的贡献，但由于花生是一种“地上开花、地下结果”的作物，其收获的荚果位于地下，在常规杂交选育过程中对产量相关性状的表型选择变得繁琐复杂。育种过程中需经过拔株、抖土、筛选等过程，该过程劳动强度大、选种效率低，并且这种表型选择受环境影响大、选择准确性低。因此急需创新型育种技术来克服传统花生育种方法的遗传改良周期长、难度大、效率低、准确性差等缺陷。

目前随着花生基因组测序的完成，利用基因组分子标记的辅助育种策略成为花生育种新方向。近年来，随着数量性状基因座(QTL)作图方法的不断完善，使得基于分子标记的优良基因型选择成为可能，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁或关联关系，开发可用的分子标记应用于辅助选择育种。以往常用的分子标记如SSR、DArT、CAPS等，操作过程繁琐复杂，检测效率低，难以满足生产需要。因此，建立更加快速、高效、便捷的标记检测技术成为当务之急。而SNP标记以其数量多、分布广、检测通量大、速度快等特点成为新一代遗传标记，目前，KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是国际上主要的SNP基因分型方法之一。

目前基于KASP技术开发SNP标记并应用于花生产量性状的辅助育种尚未见报道，因此，为了有效避免花生地下荚果选育的复杂工序，提高花生育种效率，发明人开展了花生荚果和种仁性状的QTL定位，并基于序列信息开发SNP分子标记，建立花生产量性状杂交后代早期的辅助选择方法。

发明内容

基于以上问题，本发明提供花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记及应用，本发明定位的花生荚果和种仁大小主效QTL遗传力高，技术可靠、经济、简便，可实现高通量分型，鉴定准确且快速，可有效避免花生地下荚果选育的复杂工序，提高育种效率。

为解决以上技术问题，本发明提供了花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记，所述主效QTL被命名为qB06YD1，qB06YD1定位于花生B06染色体上，与qB06YD1连锁的KASP分子标记包括SNP1和SNP2，qB06YD1的定位区间大小为SNP1与SNP2之间的246.7Kb范围；所述SNP1分子标记包括正向引物一、正向引物二和通用反向引物一，所述正向引物一、正向引物二和通用反向引物一的核苷酸序列分别见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3；所述SNP2分子标记包括正向引物三、正向引物四和通用反向引物二，所述正向引物三、正向引物四和通用反向引物二的核苷酸序列分别见SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6。

为解决以上技术问题，本发明还提供了KASP分子标记在制备选育大荚果和大种仁花生品种的试剂盒中的应用，所述试剂盒包含SNP1分子标记和SNP2分子标记中的任意一种，所述试剂盒可选育出包含宽荚果、厚荚果、重百荚、长种仁、重百仁五个优良产量性状的花生品种。

进一步的，所述试剂盒可用于KASP扩增检测，KASP的PCR反应总体系为5μl，包括基因组DNA 2.43μl、2×KASP Master Mix 2.5μl、KASP引物混合工作液0.07μl，其中KASP引物混合工作液为SNP1分子标记和纯化水的混合液或SNP2分子标记和纯化水的混合液。

进一步的，所述KASP的PCR反应程序如下：第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃梯度PCR，1min，每个循环降低0.6℃，进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，进行26个循环；第四步：10℃保存。

进一步的，所述试剂盒通过KASP扩增技术鉴定花生杂交后代单株的基因单倍型，若后代单株扩增鉴定到的单倍型为优势单倍型AA型，则筛选保留该单株。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的KASP分子标记遗传距离合适，定位的花生荚果和种仁大小主效QTL遗传力高，技术可靠、经济、简便，可实现高通量分型，能够同时对花生地下荚果和种仁大小两个重要产量性状进行标记辅助选择，鉴定准确且快速，可有效避免花生地下荚果选育的复杂工序，提高育种效率，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的实施例的花生B06染色体荚果和种仁大小主效QTL(qB06YD1)的关联定位图；

图2为本发明的实施例基于两个显著性SNP设计的KASP标记在育成品种中的基因分型结果图；

图3为本发明的实施例的两个SNP位点单倍型分析比较结果图；

图4为本发明的实施例的双亲杂交后代群体不同单倍型百荚重和百仁重显著性差异分析结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例：

本实施例对来自全世界15个国家的390份花生资源品种开展了10X的全基因组重测序，共获得12.93Tb测序数据，通过遗传变异分析，在花生全基因组水平共鉴定到3029805个SNP，通过质控过滤，最终筛选了2568601个SNP构建了一张高密度遗传变异图谱。之后利用遗传变异图谱开展群体结构分析，明确关联群体不同的亚群结构，获得群体结构Q矩阵；同时，开展关联群体个体间亲缘关系评估，获得亲缘关系K矩阵。分别调查了四个不同环境下的荚果长、荚果宽、荚果厚、百荚重、种仁长、种仁宽、种仁厚和百仁重等8个主要的产量性状。为了降低环境效应对关联分析结果的影响，利用最佳线性无偏预测(Best linearunbiasedprediction，BLUP)对同一性状不同环境下的表型进行预测，获得BLUP预测表型值。

以上述获得的Q和K矩阵为矫正因子，利用混合线性模型(Efficient Mixed-ModelAssociation eXpedited，EMMAX)结合上述遗传变异图谱和BLUP预测表型值开展花生产量性状全基因组关联分析，对关联结果进行Bonferroni校正，以1E-06为阈值进行显著性关联位点筛选。最终在B06染色体上找到一个荚果和种仁产量性状主效QTL，见附图1，箭头表示对应性状显著性关联位点。本实施例将该主效QTL命名为qB06YD1，qB06YD1的两个显著关联标记SNP1和SNP2同时与荚果宽、荚果厚、百荚重、种仁长、百仁重五个产量性状显著关联，区间大小为246.7Kb。qB06YD1对百荚重和百仁重两个性状的表型变异解释率分别达到29.56％和40.00％，表明该QTL是一个效应值较大的产量性状主效QTL，具有重要的育种价值。

本实施例利用上述SNP1和SNP2标记位点两端100bp侧翼序列设计引物，开发KASP标记。通过“伏花生”参考基因组(NCBI数据库：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；登录号SDMP00000000)搜索B06染色体SNP1和SNP2的物理位置，根据该位置提取各SNP上下游100bp序列，依据KASP引物设计原理，开发SNP的KASP标记引物，具体引物序列见表1。

表1两个SNP位点及对应的KASP引物序列

本实施例对上述两个KASP标记在育成品种中的准确性及优异单倍型进行了验证和分析，选取已完成重测序的11份小荚果花生品种和12份大荚果花生品种为试验材料。苗期取幼嫩叶片，提取基因组DNA，利用上述KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应总体系为5μl，包括基因组DNA2.43μl、2×KASPMaster Mix 2.5μl、KASPAssay Mix(引物混合工作液)0.07μl，其中，KASP引物混合工作液包括FAM荧光结合的特异序列正向引物(F1)、HEX荧光结合的特异序列正向引物(F2)、通用反向引物(R)和纯化水。PCR反应程序如下：第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃梯度PCR，1min，每个循环降低0.6℃，进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，进行26个循环；第四步：10℃保存。通过KASP荧光分析仪Pherastar(LGC公司)，参照其分型操作指南，扫描分析上述PCR结果。

见表2和附图2，试验结果显示利用本实施例设计的两个KASP标记(SNP1和SNP2)对试验材料的两个SNP位点进行基因分型，其结果与重测序获得的基因型结果完全一致，表明本实施例所设计的KASP标记准确可靠，可用于分子育种辅助选择。

表2两个KASP标记与重测序的基因分型结果比较

本实施例对上述两个SNP位点进行基因分型鉴定，其中SNP1基因型为C/A，SNP2基因型为G/A，共有AA和CG两种单倍型，见附图3，其中AA和CG分别表示两个位点的两种单倍型，表型值均为四个不同环境下的BLUP预测表型。进一步的单倍型表型差异分析显示AA单倍型为优势单倍型，在荚果长、荚果宽、荚果厚、百荚重、种仁长、种仁宽、种仁厚和百仁重等8个主要的产量性状上均极显著大于CG单倍型，这为分子标记辅助选择的单倍型鉴定筛选提供了理论基础。

以表2中大荚果品种“粤油101”和小荚果品种“全健豆拧”为亲本杂交，对103个F4杂交后代群体进行KASP标记基因分型。见附图4，其中，44个单株与大荚果品种“粤油101”单倍型一致，都为AA型；36个单株与小荚果品种“全健豆拧”单倍型一致，都为CG型；其余单株为其他类型。百荚重和百仁重两个重要产量性状表型统计分析显示，44个AA单倍型均极显著大于36个CG单倍型。这表明本实施例的KASP分子标记能够用于花生荚果产量的分子辅助育种。

本实施例研发的KASP标记遗传距离合适，技术可靠、经济、简便，可实现高通量分型，能够用于花生地下荚果和种仁大小的分子标记辅助选择；在进行产量育种时，可在播种前进行室内发芽后提取种苗基因组DNA，利用本实施例的两个KASP标记进行基因分型，提早筛选优异单倍型(AA类型)，建立产量性状杂交后代早期的辅助选择技术，可有效避免花生地下荚果选育的复杂工序，提高育种效率。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院作物研究所

<120> 花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atagctagac atgtacgtgt a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atagctagac atgtacgtgt c 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacgagtgag tattccagag ttgc 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaataactt ttcaaaag 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaataactt ttcaaaaa 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattgttgat gaagttattt aaa 23

Claims

1.花生荚果和种仁大小主效QTL的KASP分子标记，其特征在于，所述主效QTL被命名为qB06YD1，qB06YD1定位于花生B06染色体上，与qB06YD1连锁的KASP分子标记包括SNP1和SNP2，qB06YD1的定位区间大小为SNP1与SNP2之间的246.7Kb范围；所述SNP1分子标记包括正向引物一、正向引物二和通用反向引物一，所述正向引物一、正向引物二和通用反向引物一的核苷酸序列分别见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；所述SNP2分子标记包括正向引物三、正向引物四和通用反向引物二，所述正向引物三、正向引物四和通用反向引物二的核苷酸序列分别见SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

2.权利要求1所述的KASP分子标记在制备选育大荚果和大种仁花生品种的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含SNP1分子标记和SNP2分子标记中的任意一种，所述试剂盒可选育出包含宽荚果、厚荚果、重百荚、长种仁、重百仁五个优良产量性状的花生品种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可用于KASP扩增检测，KASP的PCR反应总体系为5μl，包括基因组DNA2.43μl、2×KASP Master Mix 2.5μl、KASP引物混合工作液0.07μl，其中KASP引物混合工作液为SNP1分子标记和纯化水的混合液或SNP2分子标记和纯化水的混合液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述KASP的PCR反应程序如下：第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃梯度PCR，1min，每个循环降低0.6℃，进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，进行26个循环；第四步：10℃保存。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒通过KASP扩增技术鉴定花生杂交后代单株的基因单倍型，若后代单株扩增鉴定到的单倍型为优势单倍型AA型，则筛选保留该单株。