CN108998563A - 精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用 - Google Patents

精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用 Download PDF

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Hebei Normal University of Science and Technology
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Abstract

本发明公开了精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用，包括SEQ ID NO：1～10所示的引物，本发明采用PCR技术鉴定葡萄果皮色泽性状紧密相关的两个MYB基因位点的标记基因MYBA1和MYBA2，通过该方法可快速鉴定大量葡萄种质资源的果皮颜色，有助于葡萄果皮色泽性状的分子设计育种；本发明可以在幼苗期对自交群体或杂交群体的MYB基因型、单倍型以及果皮色泽性状进行早期鉴定，进而实现幼苗的早期选择与淘汰，提高了葡萄果皮色泽性状育种工作的准确性和效率，加快育种进程。

Description

精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用
技术领域
本发明属于植物遗传学、果树育种学、植物分子育种领域，涉及控制葡萄果皮着色与否的2个MYB基因位点(MYBA1和MYBA2)的标记基因及其PCR扩增特异性引物序列与PCR反应体系。
背景技术
葡萄是全球性重要果树之一，是世界上加工深度最高、加工产品最丰富的浆果类水果。色泽是葡萄浆果外观品质的重要组成部分，它不仅决定鲜食葡萄市场价值，而且影响其加工用途与加工品的质量。决定葡萄果皮外观颜色的色素主要是花色苷，各种花色苷在果皮中的比例以及累积水平的不同使得葡萄果皮呈现出红色、紫色或黑色。花色苷具有较高的抗氧化活性，对心血管疾病、神经元和衰老相关疾病具有一定的预防功效，还可以有效抑制肥胖和降低血脂，改善血糖平衡等，同样花色苷赋予葡萄更高的营养价值。
在植物中，对玉米、金鱼草、矮牵牛等的花青素代谢途径研究已经比较成熟，分离和克隆了很多花青素生物合成相关基因。近年来，随着分子生物学的发展以及葡萄基因组测序的完成，人们已经在分子水平上对葡萄着色机理逐渐有了重要的认识。但葡萄花青素形成的潜在机制仍未阐明完全，MYB转录因子如何参与葡萄着色性状形成的调控、花青素各种转录因子的互作机制以及MYB基因位点及其组成的单倍型特点与葡萄果实色泽之间的关系等问题需要研究和探讨。
在葡萄育种实践中，对葡萄重要农艺性状大多是通过表现型间接对基因型进行选择，致使育种周期长，效率低，制约着葡萄品种改良的进程。标记基因辅助选择，尤其是利用目标性状关联的功能性标记基因进行辅助选择，可以将传统的表型选择转变为直接的基因型选择，从而能够极大提高育种的效率，加速遗传改良。因而，开发具有葡萄果实色泽性状的标记基因并进行辅助选择育种研究，意义重大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够快速鉴定葡萄的果皮色泽性状，有效用于葡萄果皮色泽性状分子设计育种的方法。
本发明还要解决的技术问题是提供上述葡萄果皮颜色的引物在检测葡萄果皮颜色中的应用。
精确鉴定葡萄果皮颜色的引物，包括如下核苷酸序列：
(1)扩增VvmybA1a基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID N0：2所示，
(2)扩增VvmybA1b、VvmybA1c、VlmybA1-3基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示，
(3)扩增VvmybA2r和VvmybA2w基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ IDN0：6所示，
(4)扩增VlmybA1-2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID N0：8所示，
(5)扩增VlmybA2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID N0：10所示。
葡萄果实是否着色以及色泽类型是由位于2号染色体上MYBA1和MYBA2两个MYB基因位点决定的，它们组成了长度约为200Kb的高度连锁基因簇。它们通过调节UFGT的表达从而调控花色苷的生物合成。
在不同的葡萄品种中，MYBA1位点的基因类型主要有VvmybA1a，VvmybA1b、VvmybA1c三种等位基因，其中VvmybA1b、VvmybA1c是具有调控葡萄着色功能的，而VvmybA1a由于启动子区域有转座子GRET1序列的插入导致其不能表达，是没有功能的。另外，在一些欧美杂种葡萄中还存在一个具有功能的Vlmyb1-3(图1)。
MYBA2位点的基因有VvmybA2r和VvmybA2w两个等位基因，其中VvmybA2r是具有调控功能的，VvmybA2w的编码区存在两个SNP(CGA突变成CTA和CA的缺失)使其编码的氨基酸以及阅读框发生改变从而导致了其不能够调节UFGT的表达。在欧美杂交种的少数品种中的MYBA2位点还有VlmybA2和VlmybA1-2两种有功能的等位基因。
另有少数品种的MYBA1和MYBA2两个基因位点的基因发生缺失从而导致了不能够合成花色苷。MYBA1和MYBA2位点的基因均能独立地参与控制花色苷的生物合成而使葡萄果皮呈现颜色，如果两个MYB基因位点中只有一个位点的基因发生突变并丧失调控果实着色的功能，另一个会继续独立调控花色苷的合成(图2和图3)。
上述精确鉴定葡萄果皮颜色的引物在鉴定葡萄果皮颜色中的应用。
精确鉴定葡萄果皮颜色的方法，包括如下步骤：
(1)提取葡萄基因组；
(2)以步骤(1)得到的基因组为模板，分别以权利要求中所示的7对核苷酸序列为引物，进行PCR反应；
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
若使用SEQ ID NO：1和SEQ ID N0：2所示的引物序列，能扩增出1559bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA1a基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示的引物序列，能扩增出1675bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA1b基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示引物序列，能扩增出846bp大小的片段，说明葡萄品种含有VvmybA1c基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示引物序列，能扩增出999bp大小的片段，说明葡萄品种含有VlmybA1-3基因；
若使用SEQ ID NO：5和SEQ ID N0：6所示的引物序列，能扩增出1446bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA2w或VvmybA2r基因；回收PCR产物，再测序鉴定，测序结果与VvmybA2w和VvmybA2r基因序列进行比对，若测序结果与VvmybA2w序列一致，说明该葡萄品种含有VvmybA2w基因；若测序结果与VvmybA2r序列一致，说明该葡萄品种中含有VvmybA2r基因；
若使用SEQ ID NO：7和SEQ ID N0：8所示的引物序列，能扩增出251bp大小的片段，说明该葡萄含有VlmybA1-2基因；
若使用SEQ ID NO：9和SEQ ID N0：10所示的引物序列，能扩增出161bp大小的片段，说明该葡萄含有VlmybA2基因；
当葡萄品种中同时含有VvmybA1a基因和VvmybA2w基因时，该葡萄品种为不着色品种；
当葡萄品种中含有VvmybA1b、VvmybA1c、VvmybA2r、VlmybA2、VlmybA1-2、VlmybA2中的一种或多种基因时，该葡萄品种为有色品种。
所述不着色品种，其葡萄果皮的颜色为白色(包括黄色、绿色、黄绿色、绿黄色等)，所述有色品种，其葡萄果皮的颜色为粉红色、红色、紫红色、紫黑色和蓝黑色。
葡萄基因组的提取方法如下：
(1)准确称取0.1g葡萄叶片加入2.0mL EP管中，在液氮中研磨成粉；
(2)加入700μL 65℃预热的2×CTAB裂解液后，轻缓颠倒混匀，置于65℃水浴锅中裂解30min，每隔5min轻缓颠倒一次；
(3)水浴结束后放凉至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻缓颠倒混匀后，放置10min，12000rpm离心l0min；吸取上清液于新的2.0mL离心管中，加入等体积的1％CTAB溶液，轻轻混匀，观察沉淀生成(溶液变得稍许混浊))，若未观察到沉淀。室温放置过夜；
(4)室温12000rpm离心5min；弃上清液并将沉淀重溶于100μL 1M的NaCl溶液中，室温，12000rpm离心5min；转移上清液至另一个离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，12000rpm离心l0min；
(5)弃上清液，加入lmL的70％乙醇洗涤2次；去除乙醇后，加入50μL双蒸水溶解DNA，-20℃冰箱保存；
(6)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。
其中，所述标记基因VvmybA1a的GenBank登录号为:AB111100.1；
标记基因VvmybA1b的GenBank登录号为:AB111101.1；
标记基因VvmybA1c的GenBank登录号为:AB242302.1；
标记基因VlmybA1-3的GenBank登录号为:AB427165.1；
标记基因VvmybA2r的GenBank登录号为:DQ886419.1；
标记基因VvmybA2w的GenBank登录号为:DQ886420.1；
标记基因VlmybA1-2的的GenBank登录号为:AB427164.1；
标记基因VlmybA2的GenBank登录号为:AB073013.1。
VvmybA1a基因的特异性引物为：
VvmybA1a-F(SEQ ID NO.1)：5'-AAAAAGGGGGGCAATGTAGGGACCC-3'；
VvmybA1a--R(SEQ ID NO.2)：5'-GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3'。
VvmybA1b基因的特异性引物为：
VvmybA1b-F(SEQ ID NO.3)：5'-GGACGTTAAAAAATGGTTGCACGTG-3'；
VvmybA1b--R(SEQ ID NO.4)：5'-GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3'。
VvmybA1c基因的特异性引物为：
VvmybA1c-F(SEQ ID NO.3)：5'-GGACGTTAAAAAATGGTTGCACGTG-3'；
VvmybA1c--R(SEQ ID NO.4)：5'-GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3'。
VlmybA1-3基因的特异性引物为：
VlmybA1-3-F(SEQ ID NO.3)：5'-GGACGTTAAAAAATGGTTGCACGTG-3'；
VlmybA1-3-R(SEQ ID NO.4)：5'-GAACCTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3'。
VvmybA2r基因的特异性引物为：
VvmybA2r-F(SEQ ID NO.5)：5'-GAAGGAGCCGGTCTCTTGTG-3'；
VvmybA2r-R(SEQ ID NO.6)：5'-GTGTTTGCATCCACTGCTCA-3'。
VvmybA2w基因的特异性引物为：
VvmybA2w-F(SEQ ID NO.5)：5'-GAAGGAGCCGGTCTCTTGTG-3'；
VvmybA2w-R(SEQ ID NO.6)：5'-GTGTTTGCATCCACTGCTCA-3'。
VlmybA1-2基因的特异性引物为：
VlmybA1-2-F(SEQ ID NO.7)：5'-CACCACTTGAAAAAGAAGGTC-3'；
VlmybA1-2-R(SEQ ID NO.8)：5'-TCTTGATCCAGCTCAGCTAAC-3'。
VlmybA2基因的特异性引物为：
VlmybA2-F(SEQ ID NO.9)：5'-GCTGAGCATGCTCAAATGGAT-3'；
VlmybA2-R(SEQ ID NO.10)：5'-TCCCACCATATGATGTCACCC-3'。
在本发明中，使用SEQ ID NO：5和SEQ ID N0：6所述的特异性引物序列对葡萄基因组DNA进行扩增，在长波紫外灯下，选择目的条带割胶回收。利用Axyprep DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收方法参照其说明书。回收后，按照TaKaRa公司pMD19-TVector载体连接试剂盒说明书提供的方法，将回收纯化的DNA片段与载体连接，16℃反应2h，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，接种在含氨苄青霉素(Amp)的平板培养基上培养12～15h。挑取单克隆筛选活化，然后进行菌液PCR，检测后将菌液送上海美吉生物医药科技公司测序，进而区分VvmybA2w或VvmybA2r基因。通过对来自一个克隆的菌液进行重测序的措施确保测序结果的正确性。
通过检测葡萄的基因组DNA(其来源不受限制，例如可以来自葡萄的叶片、根、茎等提取)中是否具有上述基因，能够有效地鉴定其果皮色泽性状。具体地，当采用上述标记基因的特异性引物对待测葡萄基因组DNA样本进行PCR扩增和凝胶电泳检测时，通过PCR产物条带的大小和有无，能够判断出MYB基因类型，确定待测葡萄的果皮颜色性状，具体地，在葡萄样品中同时检测到VvmybA1a和VvmybA2w两种基因时，可精准预测该样品为不着色品种；当在葡萄样品中检测到VvmybA1b、VvmybA1c、VvmybA2r、VlmybA2、VlmybA1-2、VlmybA2的一种或多种时，可以精准预测该样品为有色品种。本发明的选择标记基因与葡萄的果皮色泽性状紧密相关，能够有效用于葡萄的分子标记辅助育种。进而能够根据实际育种中对果皮颜色的要求，对葡萄育种材料进行早期选择，进一步有效提高育种的效率和准确性，提高葡萄杂交群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出葡萄优良品种。例如，利用上述标记基因的特异性引物对待测葡萄基因组DNA进行扩增、凝胶电泳，当所选择的样品中仅扩增到VvmybA1a和VvmybA2w基因，即可容易地筛选获得该样本为不着色的葡萄品种，从而可以直接应用于葡萄色泽性状的分子设计育种实践。
有益效果：
(1)利用本发明的标记基因进行葡萄分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点；
(2)本发明提供的葡萄果皮颜色性状相关的分子标记不受葡萄的生长阶段的限制，可用于葡萄的早期选育，可显著促进葡萄的育种进程；
(3)根据葡萄果皮色泽性状的标记基因的PCR产物条带的大小和有无的方法，准确可靠，操作方便；
(4)葡萄果皮颜色性状相关的标记基因的确定，也为葡萄生长性状的标记辅助选择提供了科学依据。
附图说明
图1MYBA1和MYBA2基因位点等位基因结构图；
图2本发明中MYB基因位点基因类型及单倍型(Azuma等,2009；2011)；
图3所示的是本发明中葡萄果皮着色MYB基因位点对花色苷生物合成的调控示意图(孙欣等,2012)；
图4所示的是39个葡萄品种的Actin和8个标记基因的PCR产物的凝胶图；
图5所示的是24株‘摩尔多瓦’葡萄的自交群体幼苗Actin和8个标记基因的PCR产物的凝胶图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。
实施例1.不同葡萄品种MYBA1和MYBA2基因位点基因型鉴定
一、材料与方法：
1.试验于2017年2月在南京农业大学进行。选取的早生高墨等39个葡萄品种为江苏省农业科学院园艺研究所果树资源圃保存。采摘幼嫩叶片立即用液氮处理，保存于–80℃条件下备用。
2.葡萄DNA提取：采用CTAB法提取基因组DNA，具体操作如下：
(1)准确称取0.1g葡萄叶片加入2.0mL EP管中，于液氮中研磨成粉；
(2)加入700μL 65℃预热的2×CTAB裂解液后，轻缓颠倒混匀，置于65℃水浴锅中裂解30min，每隔5min轻缓颠倒一次；
(3)水浴结束后放凉至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻缓颠倒混匀后，放置10min，12000rpm离心l0min；吸取上清液于新的2.0mL离心管中，加入等体积的1％CTAB溶液，轻轻混匀，观察沉淀生成(溶液变得稍许混浊)，若未观察到沉淀。室温放置过夜；
(4)室温12000rpm离心5min；弃上清液并将沉淀重溶于100μL 1M的NaCl溶液中，室温，12000rpm离心5min；转移上清液至另一个离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，12000rpm离心l0min；
(5)弃上清液，加入lmL的70％乙醇洗涤2次；去除乙醇后，加入50μL双蒸水溶解DNA，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并将最终浓度稀释到30ng·mL-1，保存于–20℃备用。
3.DNA质量的检测：取2μL的DNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压为150V左右，当EB到达胶面1/3时取出，于紫外成像系统上拍照分析。DNA在Biophotometer(蛋白核酸分析仪)上检测浓度，体系为1μL DNA加入49μL DEPC处理的ddH2O，用DEPC处理的ddH2O调零，DNA浓度、OD260/OD280和OD260/OD230直接从仪器上读取。
4.PCR反应体系为20μL：10×Buffer 2.0μL、2.5mmol·L-1dNTPs 1.6μL、25mmol·L-1的Mg 2+1.2μL、Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.1μL、上游引物(10mmol·L-1)1.0μL、下游引物(10mmol·L-1)1.0μL、模板DNA(30ng·μL-1)2μL，最后用双蒸水补至20μL。
程序为：94℃变性3min；然后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物在1.3％琼脂糖凝胶中电泳30～60min，溴化乙锭染色，紫外透射仪上观察拍照。
5.VvmybA2r和VvmybA2w测序鉴定
在长波紫外灯下，将使用F5/R5特异性引物扩增出的条带进行割胶回收。利用Axyprep DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，回收方法参照其说明书。回收后，按照TaKaRa公司pMD19-TVector载体连接试剂盒说明书提供的方法，将回收纯化的DNA片段与载体连接，16℃反应2h，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，接种在含氨苄青霉素(Amp)的平板培养基上培养12～15h。挑取单克隆筛选活化，然后进行菌液PCR，检测后将菌液送上海美吉生物医药科技公司测序，确定该基因位点的基因型是VvmybA2r还是VvmybA2w。通过对来自一个克隆的菌液进行重测序的措施确保测序结果的正确性。
用于扩增看家基因Actin和使用8个标记基因的引物序列如表1。引物均上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成。
表1 PCR扩增标记基因的基因位点的引物序列
二、结果与分析：
为保证所扩增3个基因序列的正确性与可靠性，利用F0/R0、F1/R1、F2/R1、F3/R3、F4/R4、F5/R5等6组引物对39个葡萄品种进行PCR扩增，获得了清晰的DNA指纹(图4)，并对所有葡萄品种都进行两次PCR重复实验。对于PCR产物谱带信号较弱以及未有扩增产物的品种再重复一次PCR进行确认。根据看家基因片段清晰扩增产物条带，确定这些没有PCR扩增产物品种的真实情况。
根据PCR产物的谱带特点，可以将这些葡萄品种的VvmybA1基因型划分为以下情况：
(1)在5个品种中MYBA1和MYBA1基因位点仅扩增到不具有花色苷调控功能的VvmybA1a和VvmybA2w，MYBA1和MYBA2基因位点的基因型情况与这些葡萄品种白色果皮的特征相符合。
(2)34个果皮呈红或黑色的葡萄品种中均检测到了VvmybA1b或VvmybA1c或VvmybA2r或VlmybA1-3或VlmybA1-2或VlmybA2等具有花色苷调控功能的标记基因，其果皮着色情况与对应基因型鉴定结果是相符的。
在对213份葡萄种质果实色泽性状调查的基础上，利用本发明的特异性引物序列对其果皮着色性状进行鉴定，99.1％葡萄种质的鉴定结果与其果皮着色情况相吻合，具有特异性好，准确度高的特点。
实施例2.利用MYBA1和MYBA1基因位点的标记基因预测葡萄自交群体幼苗的着色情况
一、材料与方法
1.以南京农业大学葡萄种质资源圃提供的“摩尔多瓦”葡萄为亲本材料，构建自交群体。
2.葡萄DNA提取
参见实施例1中的方法。
3.DNA质量的检测
参见实施例1中的方法。
4.PCR反应体系
参见实施例1中的方法。
5.VvmybA2r和VvmybA2w测序鉴定
参见实施例1中的方法。
二、结果与分析：
为保证所扩增3个基因序列的正确性与可靠性，利用F0/R0、F1/R1、F2/R1、F3/R3、F4/R4、F5/R5等6组引物对24株自交群体籽苗进行PCR扩增，获得了清晰的DNA指纹(图5)，并对所有葡萄品种都进行两次PCR重复实验。对于PCR产物谱带信号较弱以及未有扩增产物的品种再重复一次PCR进行确认。根据看家基因片段清晰扩增产物条带，确定这些没有PCR扩增产物品种的真实情况。
根据PCR产物的谱带特点，可以将这些葡萄品种的MYBA1和MYBA2基因位点的基因型划分为以下情况：
(1)9个籽苗仅扩增出VvmybA2w、VvmybA1a，其单倍型为HapA/HapA，预测为不着色品种；
(2)12个籽苗扩增出VvmybA2w、VvmybA1a、VvmybA1c，其单倍型为HapA/HapC-Rs，预测为着色品种；
(3)3个籽苗扩增出VvmybA2w、VvmybA1c，其单倍型为HapC-Rs/HapC-Rs，预测为着色品种。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaggggg gcaatgtagg gaccc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaacctcctt tttgaagtgg tgact 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggacgttaaa aaatggttgc acgtg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaacctcctt tttgaagtgg tgact 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggagccg gtctcttgtg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgtttgcat ccactgctca 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccacttga aaaagaaggt c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcttgatcca gctcagctaa c 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctgagcatg ctcaaatgga t 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcccaccata tgatgtcacc c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gattctggtg atggtgtgag t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gacaatttcc cgttcagcag t 21

Claims (3)

1.精确鉴定葡萄果皮颜色的引物，其特征在于，包括如下核苷酸序列：
(1)扩增VvmybA1a基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID N0：2所示，
(2)扩增VvmybA1b、VvmybA1c、VlmybA1-3基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示，
(3)扩增VvmybA2r和VvmybA2w基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID N0：6所示，
(4)扩增VlmybA1-2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID N0：8所示，
(5)扩增VlmybA2基因的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID N0：10所示。
2.权利要求1所述精确鉴定葡萄果皮颜色的引物在鉴定葡萄果皮颜色中的应用。
3.精确鉴定葡萄果皮颜色的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取葡萄基因组；
(2)以步骤(1)得到的基因组为模板，分别以权利要求中所示的7对核苷酸序列为引物，进行PCR反应；
(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析；
若使用SEQ ID NO：1和SEQ ID N0：2所示的引物序列，能扩增出1559bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA1a基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示的引物序列，能扩增出1675bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA1b基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示引物序列，能扩增出846bp大小的片段，说明葡萄品种含有VvmybA1c基因；
若使用SEQ ID NO：3和SEQ ID N0：4所示引物序列，能扩增出999bp大小的片段，说明葡萄品种含有VlmybA1-3基因；
若使用SEQ ID NO：5和SEQ ID N0：6所示的引物序列，能扩增出1446bp大小的片段，说明该葡萄品种含有VvmybA2w或VvmybA2r基因；回收PCR产物，再测序鉴定，测序结果与VvmybA2w和VvmybA2r基因序列进行比对，若测序结果与VvmybA2w序列一致，说明该葡萄品种含有VvmybA2w基因；若测序结果与VvmybA2r序列一致，说明该葡萄品种中含有VvmybA2r基因；
若使用SEQ ID NO：7和SEQ ID N0：8所示的引物序列，能扩增出251bp大小的片段，说明该葡萄含有VlmybA1-2基因；
若使用SEQ ID NO：9和SEQ ID N0：10所示的引物序列，能扩增出161bp大小的片段，说明该葡萄含有VlmybA2基因；
当葡萄品种中同时含有VvmybA1a基因和VvmybA2w基因时，该葡萄品种为不着色品种；
当葡萄品种中含有VvmybA1b、VvmybA1c、VvmybA2r、VlmybA2、VlmybA1-2、VlmybA2中的一种或多种基因时，该葡萄品种为有色品种。
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