CN114891918B - 与葡萄果实颜色相关的kasp标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP‑g6及其检测引物组，其位于葡萄基因组Chr2染色体的15988491bp位置，为T/C多态性；其检测引物组核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑3。本申请还提供了该标记在预测葡萄果实颜色和葡萄育种中的应用。

Description

与葡萄果实颜色相关的KASP标记及其应用
技术领域
本申请属于分子生物学领域和农业育种领域。具体地，本申请提供了与葡萄果实颜色相关的KASP标记及其应用。
背景技术
葡萄属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis L.)，是世界上栽培最广泛和经济价值最高的果树之一。果实颜色是葡萄的重要经济性状，主要由果皮花色苷含量和组分决定。MYBA1和MYBA2两个转录因子对葡萄果实花色苷的生物合成具有重要的调控作用，其突变很好地解释了葡萄黄绿色果实形成的机制。但是，对于红色系葡萄，果实从粉红色到紫黑色变异类型极为丰富，呈现典型的数量性状特点。对于红色系葡萄果实颜色变化的分子机制，目前研究尚不清楚。
KASP技术是新一代高通量自动化SNP检测技术，现已成为国际上SNP分型以及插入缺失变异检测的主要方法之一。其基本程序是：利用带有两种通用标签并连接SNP位点的两条正向引物和一条反向引物构成Primer mix。带有不同荧光信号的两条检测引物Mastermix，经三次PCR反应进行SNP位点荧光检测：PCR反应I：DNA模板变性，与相符合的KASP引物结合，退火延伸后，检测引物的序列被加上；PCR反应II：合成等位基因特异性的末端序列的互补链；PCR反应III：特异序列对应的检测引物随PCR反应进行指数性增长，荧光信号产生并被检测。此时只需要一台实时荧光定量PCR仪即可对荧光信号的类别以及含量进行检测。同其他检测技术相比，KASP技术只需合成两个带有不同颜色的荧光基团和双链通用的探针，不需要针对每个SNP位点分别设计荧光探针，具有高通量、准确、省时、便捷、低成本的特点，实现了更加灵活的检测，已成功用于超过100多个物种的基因分型、遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面。
发明内容
为了更深入地阐释红色系葡萄果实形成的分子机制，我们前期已经以欧亚种(V.vinifera)‘红地球’ב玫瑰香’杂交群体为材料，对其果实颜色进行了系统评价，基于群体基因组重测序开发的SNP标记构建了高密度遗传图谱，并进行了葡萄果实颜色QTL定位。
图谱信息：整合图谱中27454个SNP标记整合在1554个bin中，分布在19个连锁群，总遗传距离1442.638cM。标记之间的平均遗传距离0.928cM。每个连锁群的平均SNP和bin标记数分别为1445和82。连锁群的遗传距离最小的为34.051cM(LG3)，最大的为107.001cM(LG18)，单个连锁群的平均遗传距离为75.928cM。遗传图谱最大的gap出现在LG17，为15.945cM。19个连锁群gap小于5cM的平均占比达99.928％，其中8个连锁群占比达100％。
QTL位点信息：2017、2018和2019三年的果实颜色(CG)表型数据均定位到LG2上的一个主效QTL位点命名为col-2，此位点位于LG2上45.231-48.955cM，LOD峰值位置位于48.423cM处，LOD值为17.55。
我们根据SNP位点标记上下游核酸序列，设计了KSAP标记在杂交群体和自然群体中分别进行验证，以用于葡萄果实颜色的早期鉴定，缩短育种时间提高育种效率。
一方面，本申请提供了一种与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP-g6，其位于葡萄基因组Chr2染色体的15988491bp位置，为T/C多态性。
另一方面，本申请提供了检测上述与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP-g6的引物组，所述引物组包括序列为SEQ ID NO.2的上游分型引物，序列为SEQ ID NO.3的上游分型引物，序列为SEQ ID NO.4下游引物。
再一方面，本申请提供了检测葡萄果实颜色的试剂盒，其包含上述引物组。
又一方面，本申请提供了上述引物组或者试剂盒在葡萄育种中的应用。
还一方面，本申请提供了预测葡萄果实颜色的方法，其中包括检测上述与葡萄果实颜色相关的KASP标记KASP-g6的步骤。
进一步地，所述方法中使用上述引物组或者试剂盒进行PCR反应。
进一步地，葡萄果实黄绿色单株表现为TT纯合，葡萄红色系果实单株表现为较浅的TC或色深的CC。
进一步地，所述PCR反应体系为10.125ul：2X KASP master mix，5ul；72X primermix，0.125ul；DNA样品5ul。
进一步地，所述PCR反应条件如下：预变性95℃，10min；降落PCR变性95℃，20sec，梯度退火温度61-55℃，60sec，10个循环；扩增PCR变性95℃，20sec，退火温度55℃，60sec，35个循环；荧光扫描25℃，30sec。
进一步地，所述PCR反应在96孔板上进行。
附图说明
图1为标记KASP--g6在杂交群体中的分型结果图；
图2为标记KASP--g6在自然群体中的分型结果图。
具体实施方式
实施例1
材料：
用于验证的材料为：‘红地球’ב玫瑰香’F1杂交群体95株，164株不同果实颜色的自然群体。
实验方法：
SNP筛选：
提取DNA、构建文库并测序后，使用Soapnuke软件去除含测序接头的、低质量的以及N碱基的比例大于1％的reads，得到高质量的Clean data数据用于后续的比对分析。使用短序列比对软件BWA(0.7.15)的“mem”算法(比对参数为：-t 5-k 30-M–R)将过滤后得到的clean data比对到葡萄参考基因组上(PN40024 assembly 12X)(Jaillon et al 2007)。生成比对结果文件sam文件，然后使用picard(1.54)软件的SortSam.jar工具将sam文件转变为sortbam文件。将比对结果文件经samtools软件进行比对文件格式的转换，利用picard(1.54)软件的MergeSamFiles.jar工具合并同一样品不同文库/lane的比对文件，利用picard(1.54)软件的MarkDuplicates.jar工具对制备文库时PCR扩增中所产生的duplicates进行标记。使用GATK(3.7)软件(De Summa et al2017)的RealignerTargetCreator和IndelRealigner工具对Indel附近的序列进行重新比对和矫正，以提高Indel周围SNP位点的准确性，经处理后的bam文件再进一步进行变异检测。
采用GATK(3.7)流程中的分析工具，对处理后的比对结果文件进行变异检测。首先进行一次初步的变异检测并构建一个可信度较高的已知的SNP和indel数据集，利用该结果对比对结果reads的碱基质量值进行重新校正(BaseRecalibrator和PrintReads工具)，使校正后的比对文件中reads的碱基质量值能够更加接近与参考基因组之间真实的错配概率，然后使用校正后比对文件进行后续的变异检测。然后使用变异检测工具HaplotypeCaller获取每个个体每条染色体的gvcf变异检测结果文件。最后利用GenotypeGVCFs工具将个体gvcf进行整合，最终得到群体变异结果，并用SelectVariants和VariantFiltration工具对检测到的变异进行进一步的提取和过滤(过滤参数：QD<2.0/FS>60.0/MQ<40.0/MQRankSum<-12.5/ReadPosRankSum<-8.0)，以得到高度可信的群体SNP。对得到的群体SNP进一步进行过滤，过滤掉reads支持数(DP)小于10、质量值(GQ)小于40、缺失率大于20％以及非二态型的SNP位点，以获得高质量的群体SNP标记。
获取到29058个多态性群体SNP标记，经偏分离检验进行进一步过滤，其中，有1604个SNP标记的基因型频率显著偏离预期的孟德尔频率，占总SNP数目5.52％，其中不符合1:1分离的有1544个，不符合1:2:1分离的有60个。过滤掉这1604个偏分离的SNP标记后，最终剩余27454个SNP标记用于高密度遗传图谱的构建。
遗传图谱构建和QTL定位：
使用LepMap3软件进行图谱构建(Rastas et al 2013,Rastas 2017)。首先使用该软件的ParentCall2功能筛选得到可用于软件分析的information marker。然后使用该软件的Filtering2功能(参数：dataTolerance＝0.1；removeNonInformative＝1)对偏分离标记进行过滤，过滤掉子代偏分离的基因型位点。再使用该软件的SeparateChromosomes2功能进行连锁群的划分，将LOD值设置为7时，可将所有标记划分为19个连锁群，且与基因组的染色体的信息对应性较好。然后再使用JoinSingles2All功能将未能划入连锁群的singlemarker尝试再划入连锁群中。最后使用OrderMarkers2功能计算各个连锁群的遗传距离。最终获得该群体的高密度遗传图谱。
利用构建的遗传图谱，结合群体果实颜色的表型数据，使用MapQTL 6.0软件进行QTL定位。选择MQM mapping分析方法，使用的算法为Kosambi’s。
利用开发的SNP标记分别构建了两个亲本的遗传图谱和整合遗传图谱。母本‘红地球’的遗传图谱中包含有12325个SNP的733个bin标记分布在19个连锁群，总遗传距离1271.352cM，平均遗传距离1.734cM，平均每个连锁群有770个SNP标记。父本‘玫瑰香’的遗传图谱中含有15404个SNP的929个bin标记分布在19个连锁群，总遗传距离1614.853cM，平均遗传距离1.738cM，平均每个连锁群有811个SNP标记。
整合图谱中27454个SNP标记整合在1554个bin中，分布在19个连锁群，总遗传距离1442.638cM。标记之间的平均遗传距离0.928cM。每个连锁群的平均SNP和bin标记数分别为1445和82。连锁群的遗传距离最小的为34.051cM(LG3)，最大的为107.001cM(LG18)，单个连锁群的平均遗传距离为75.928cM。遗传图谱最大的gap出现在LG17，为15.945cM。19个连锁群gap小于5cM的平均占比达99.928％，其中8个连锁群占比达100％。
基于构建的高密度遗传图谱，结合前期群体果实颜色性状的表型数据，进行QTL定位。果实颜色分级(CG)和色差值(CA)的定位结果较为一致，2017、2018和2019三年的表型数据均定位到LG2上的3个QTL位点，将其分别命名为col-2-1、col-2-2和col-2-3。利用CA的表型数据，在2017年和2018年还定位到位于LG4的一个QTL位点，命名为col-4-1。位点col-2-1在三年CA的表型定位中LOD值分布在18.48-21.03，解释表型变异系数(PVE)最高达64.3％，表明这是一个控制葡萄果实颜色性状的主效QTL位点。此外，2017和2018年CA定位到的col-4-1位点LOD值分别为4.8和4.31，解释表型变异系数分别为19％和22.2％。
葡萄果实颜色与果皮中的花色苷密切相关，结合前期实验中杂交群体果皮中花色苷的检测结果，基于该高密度遗传图谱，从果皮中花色苷的总量(TA)和组分的角度进行了QTL定位，而花色苷的组分主要考虑花翠素类花色苷的占比(DC)、甲基化花色苷的占比(MC)和酰基化类花色苷的占比(AC)。与CG和CA定位结果一致的是，TA、DC、MC和AC均定位到了主效QTL位点col-2-1。TA、DC和MC也定位到位于2号染色体的col-2-2和col-2-3。TA和AC还定位到位于17号染色体的另外两个较为显著的QTL位点，col-17-1和col-17-2。此外，基于这四组表型，还定位到了位于4号染色体的col-4-1(DC和MC)和col-4-2(AC)，位于6号染色体上的col-6-1(MC和AC)，以及位于11号染色体的col-11-1(AC)和col-11-2(TA)等QTL位点。
根据前期定位位点的SNP信息，参考葡萄基因组，根据13个KASP位点(KASP-g2、KASP-g3、KASP-g4、KASP-g5、KASP-g6、KASP-g7、KASP-g8、KASP-g9、KASP-g10、KASP-g12、KASP-g13、KASP-g14、KASP-g15)设计13组KASP引物。
KASP-g6所在位置得核酸序列为SEQ ID NO.1，其KASP引物序列为：上游分型引物1(F1)SEQ ID NO.2；上游分型引物2(F2)SEQ ID NO.3；下游引物SEQ ID NO.4。KASP-g2所在位置得核酸序列为SEQ ID NO.5，其KASP引物序列为：上游分型引物1(F1)SEQ ID NO.6；上游分型引物2(F2)SEQ ID NO.7；下游引物SEQ ID NO.8。部分详细序列见下(由于序列表篇幅原因，在此仅展示第一组KASP-g2序列以及经研究可用的KASP-g6，较大字母代表变化的位点)：
SEQ ID NO.2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATACCTCTGAATATCCTTAAAGGTA；
SEQ ID NO.3：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTACCTCCGAATATCCTTAAAGGTG；
SEQ ID NO.4：CTAAAAGTGTGATGCTTTTAATGATGTTC。
SEQ ID NO.6：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTAAGACTTTATGAAAAATAACA；
SEQ ID NO.7：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCTTAAGACTTTATGAAAAATAAAG；
SEQ ID NO.8：ATATTTAATAAAAGGAGTGAATAAACTTG。
引物稀释：新合成引物，用TE(pH 8.0)溶解至50μM，然后按照上游分型引物1(F1)：上游分型引物2(F2)：下游引物(R)＝1:1:3的比例混合后上机，每10μL反应体系加0.125μL引物混合物。
DNA样本稀释和添加：384孔板反应体系的总反应体积为10ul，DNA在反应体系中样本含量为2.5-3ng/ul，即每孔样本总量约25-30ng。
PCR反应体系约10ul：2×KASP master mix，5ul；72×primer mix，0.125ul；DNA样品5ul；采用96孔位板。
PCR反应条件如下：预变性95℃，10min；降落PCR变性95℃，20sec，梯度退火温度61-55℃，60sec，10个循环；扩增PCR变性95℃，20sec，退火温度55℃，60sec，35个循环；荧光扫描25℃，30sec。
实施例2
标记KASP-g6在95株F1杂交群体中分型结果显示，基因型和果实颜色表型的符合率为98.94％(图1)，仅有一株基因型为TT的后代单株的果实表现为红色。标记KASP--g6在164株自然群体分型结果显示，其基因型和果实颜色表型的符合率为84.15％(图2)，其中红色葡萄果实基因型和表型的符合率为77.06％，黄绿色葡萄果实的基因型与表型符合率为98.18％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 与葡萄果实颜色相关的KASP标记及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 220
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
tgatcaggtt tgaaaaagta aaagaaaaaa aaaaaggtaa tagggtgccc aggcctaaaa 60
gtgtgatgct tttaatgatg ttcaaaacta caaagtcaaa tacctttaag gatattcaga 120
ggtataattt catatatttt aaaagtcatc caaccctaaa attacatata tttttatcga 180
ttcctccatt ttcaagtgct aaaaaatgaa tataataatc 220
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tatacctctg aatatcctta aaggta 46
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> artificial
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat ttacctccga atatccttaa aggtg 45
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 4
ctaaaagtgt gatgctttta atgatgttc 29
<210> 5
<211> 301
<212> DNA
<213> artificial
<400> 5
tttcactatg ttgggcattg tattaacaat gtaacaattt ttttttttaa tatatgcaca 60
tttattgaaa aatatatatg ccttaagact ttatgaaaaa taacacatgt aatacaagtt 120
tattcactcc ttttattaaa tatttttagg tatacttaga ttttgggaat aagtgacatg 180
tgtatgaaag gtgcaaaagc ctctttattt ctttagctaa gagactaatt taattggata 240
tttttttgta ttaatggttc actttacaat gtactacttt ttaggggatt tgtcataatt 300
t 301
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc tccttaagac tttatgaaaa ataaca 46
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<400> 7
gaaggtcgga gtcaacggat tgccttaaga ctttatgaaa aataaag 47
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<400> 8
atatttaata aaaggagtga ataaacttg 29

Claims (4)

1.预测葡萄果实颜色的方法，其特征在于，所述方法包括使用核苷酸序列为SEQ IDNO.2的上游分型引物，核苷酸序列为SEQ ID NO.3的上游分型引物以及核苷酸序列为SEQID NO.4下游引物进行PCR反应扩增葡萄DNA样品，检测位于葡萄基因组的KASP标记KASP-g6的T/C多态性；按照以下原则预测葡萄果实颜色：葡萄果实黄绿色单株表现为TT纯合，葡萄红色系果实单株表现为较浅的TC或色深的CC；所述KASP-g6的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR 反应的反应体系为10.125ul：2X KASPmaster mix，5ul；72X primer mix，0.125ul；DNA 样品5ul。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述PCR 反应的反应条件如下：预变性95℃，10min；降落PCR变性95℃，20sec，梯度退火温度61-55℃，60sec，10个循环；扩增PCR变性95℃，20sec，退火温度55℃，60sec，35个循环；荧光扫描25℃，30sec。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR反应在96孔板上进行。
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