CN104087576A

CN104087576A - 与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用

Info

Publication number: CN104087576A
Application number: CN201410273647.1A
Authority: CN
Inventors: 黄三文; 祝光涛; 林涛; 张俊红; 伦尧尧; 杜永臣; 王孝宣
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: CN104087576B

Abstract

本发明提供与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用，所述分子标记包含2个SNP标记和2个InDel标记。SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为A的为粉果番茄。SNP-s位于SlMYB12起始密码子下游第307bp处，此处碱基为T的为粉果番茄，此处碱基为C的为红果番茄。InDel-p是位于SlMYB12基因起始密码子上游约4kb处大小为603bp的序列，该序列缺失的为粉果番茄。InDel-i位于SlMYB12基因起始密码子下游第248bp处，该位点后有一个A插入的为粉果番茄。本发明的分子标记可应用于番茄分子标记辅助育种中，大大加快番茄的育种进程。

Description

与番茄果实颜色性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与番茄果实颜色性状相关的分子标记。

背景技术

番茄果实颜色是一个重要的农艺性状，同时直接影响着消费者的需求。早期经典遗传试验证明番茄果实的颜色由果皮和果肉颜色共同决定，番茄果皮的颜色分为黄色和透明两种，由y基因决定，黄色果皮对无色果皮为显性，黄色果皮的产生是因为果实在成熟过程中果皮中大量积累黄色的类黄酮类物质，无色果皮中缺少该物质的积累。果肉的颜色主要由红色和黄色，由r基因控制，不同颜色果皮和果肉的组合会产生不同外观颜色的果实。栽培番茄的果肉多为红色，因为果皮颜色的不同出现了红果和粉果两种。前人的研究表明，控制果皮颜色的y基因是一个转录因子SlMYB12,此基因的表达导致番茄果皮中积累大量类黄酮而为黄色，最终果实呈现为红色，粉果的果皮中因没有类黄酮的积累而呈现粉色。但是影响该基因表达的关键位点却一直没有发现,目前为止，尚未发现与果皮颜色直接相关的分子标记。

在我国番茄的消费以鲜食为主，粉果番茄因其果皮较薄、质地松软、口感较佳而受到消费者的青睐。现在育种中，对不同果实材料的筛选由于缺少与果皮颜色控制基因相关的分子标记，往往借助成熟期表型鉴定的传统方法，这种方法具有很强的滞后性，并且耗费大量的人力和物力。开发与果皮颜色相关的分子标记，不仅从苗期就可完成果实颜色的鉴定，同时可以大规模地对不同材料进行筛选，具有重要的应用价值和社会效益。

随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究广泛开展，并在植物育种中应用，产生了巨大的影响。InDel(insertion-deletion)插入缺失标记，此类标记的设计是根据在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，根据发生插入或缺失位点的两侧保守序列分别设计引物，进行该区域的PCR扩增，即为InDel标记。SNP(singlenucleotide polymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，此类标记因具有广泛的基因组分布性，同时可进行大规模群体筛选。SNP检测技术主要包括因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术和焦磷酸测序法等，随着检测技术的不断进步，SNP标记得到了更为广泛的应用。

分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农作物育种中的作用将日益突出。在番茄育种中，育种专家希望选择与番茄果实颜色密切相关的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。

发明内容

本发明的目的是提供一套与番茄果实颜色性状高度相关的分子标记及应用。

为了实现本发明目的，本发明的与番茄果实颜色性状相关的分子标记，包含2个SNP标记和2个InDel标记：

第1个SNP标记SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为一般为红果番茄，此处碱基为A的一般为粉果番茄；

第2个SNP标记SNP-s位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第307bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为T的为粉果番茄；

第1个InDel标记InDel-p是位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游约4kb处大小为603bp的DNA序列，该序列缺失的为粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

第2个InDel标记InDel-i位于番茄SlMYB12基因起始密码子下游第248bp处，该位点后具有一个A插入的为粉果番茄。

本发明还提供用于检测上述分子标记的特异性引物对，其中：

用于检测标记SNP-p的特异性引物对为：

正向引物F5’-GCCTTCTTCTACACCCTT-3’(Seq ID No.2)

反向引物R5’-ACACCAGTGCTCCTCCTA-3’(Seq ID No.3)。

用于检测标记SNP-s和标记InDel-i的特异性引物对为：

正向引物F5’-AATAATGGGAAGAACACC-3’(Seq ID No.4)

反向引物R5’-TTCTGGACCTAGACTAAA-3’(Seq ID No.5)。

用于检测标记InDel-p的特异性引物对为：

正向引物F5’-AGTGACGAACAACCGACCTA-3’’(Seq ID No.6)

反向引物R5’-CCTCACAAACGCGGACAAA-3’(Seq ID No.7)。

本发明还提供一种鉴定番茄果实颜色的方法，包括以下步骤：

1)提取待测番茄的基因组DNA；

2)以待测番茄的基因组DNA为模板，利用用于检测上述分子标记的特异性引物对，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物。

前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记SNP-p的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条398bp大小的条带，说明扩增出特异性的目的条带，相关序列进行焦磷酸测序，如果目的条带的207bp处为C，表明待测番茄极有可能是红果，若目的条带的207bp处为A，表明待测番茄极有可能是粉果。

前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记SNP-s和标记InDel-i的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条439bp大小的条带，说明扩增出特异性的目的条带，相关序列进行焦磷酸测序，目的条带在251处有碱基A插入的待测番茄为粉果；或者在311bp处碱基为T的待测番茄为粉果，在311bp处碱基为C的待测番茄为红果。

前述的方法，步骤2)中利用用于检测标记InDel-p的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μlTaq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条360bp大小的条带，表明待测番茄为粉果，如果检测结果仅含有一条者960bp大小的条带，表明此位点不存在缺失，为红果的基因型。

本发明还提供含有上述引物对的用于检测番茄果实颜色的试剂盒。

本发明进一步提供上述与番茄果实颜色性状相关的分子标记在番茄分子标记辅助育种中的应用。即根据基因型进行红果和粉果番茄品种的选育，从而加快番茄的育种进程。

首先对360份番茄种质材料进行重测序分析，同时对这360份材料进行果皮颜色表型进行鉴定。采用全基因组关联分析(GWAS)的方法，从10,990,318个SNP中找到了一个与番茄果色相关的SNP位点(图1)。根据番茄基因组拼接版本(SL2.40)和基因注释版本(ITAG2.3)，该SNP位点位于基因Solyc01g079620(SlMYB12)的ATG上游8616处(SL2.40ch01:71246984)，此位点碱基为C与红果表型高度连锁，此位点碱基为A与粉果表型高度连锁。对427个具有明确表型个体的基因型进行鉴定发现，205个红果中有204个个体为C，222个粉果中有220个个体为A。

为了进一步寻找控制番茄果色的关键变异位点，对基因Solyc01g079620与其上游基因Solyc01g079610之间区域(SL2.40ch01:71229871-71,258,882)所有的变异位点进行了分析，并结合PCR扩增并测序，发现在基因Solyc01g079620的ATG上游约4k处存在一个603bp(SL2.40ch：71250781-SL2.40ch:71250179)的变异，所有的红果个体(205个)基因组中都存在这一603bp的序列，在118个粉果中缺失此603bp。进一步地，对其余4份特异的粉果个体进行检测，对基因Solyc01g079620进行了扩增并测序。发现其中1份材料在基因的第二个外显子出现了一个SNP(SL2.40：71255952)发生了C-T转换，这种转换产生了一个TAA的终止密码子，造成了翻译的提前终止。对另3份材料的检测，发现在基因的第二个外显子发生了一个碱基A的插入(SL2.40ch01：71255892后)，这种插入产生一个TAG的终止密码子，造成翻译的提前终止。

综上，本发明共发现控制番茄果皮颜色基因(y)的三种变异类型：(1)启动子区域603bp缺失；(2)在基因编码区上1个碱基的替换产生了终止密码子；(3)在基因编码区上1个碱基的插入产生了终止密码子。(图6)

本发明可替代传统的待番茄成熟后判断番茄果色的方法，完全排除人为因素的影响，使结果更加准确可靠。与传统方法相比，本发明方法更为简单有效，能极大地提高时间效益和经济效益，并可用于大规模筛选育种材料，大大加快番茄的育种进程。

附图说明

图1为本发明利用GWAS分析方法从101万个SNP(最小等位基因频率>5％)中筛选到与果皮颜色相关联的SNP-p。该SNP位点(用箭头标记)位于番茄第1号染色体基因Solyc01g079620的ATG上游8616bp处。

图2为本发明利用BWA、SAMtools软件对目标区域成对reads的检测原理图，在粉果个体中存在603bp的缺失，缺失区域位于基因上游约4kb处。

图3为本发明对基因Solyc01g079620启动子区域的缺失状态的分子验证结果。其中，M为DNA Marker，电泳条带为960bp的个体为红果个体，电泳条带为360bp的个体为粉果个体。

图4为本发明对基因Solyc01g079620区域的测序检测结果，在编码区一个碱基A的插入产生了一个终止密码子TAG，导致翻译的提起终止，表现粉果的基因型。

图5为本发明对基因Solyc01g079620区域的测序检测结果，在编码区的一个碱基C-T的替换，产生了一个终止密码子TTA，导致翻译的提起终止，表现粉果的基因型。

图6为本发明对不同番茄果皮颜色个体检测发现的所有变异类型，图上方显示y基因所在的染色体物理位置，图中部为y基因的结构示意图，图下方是检测到的所有变异类型和表现型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 与番茄果实颜色性状相关的SNP-p标记的获得

对世界各地收集到的360份番茄材料，进行重测序，每份材料产生5G左右的数据量，平均覆盖5倍的番茄基因组，对群体中258份具有明确表型的个体(232红果和26粉果)进行全基因组关联分析，采用复杂线性模型(mixture line model)，利用tassel4.0软件，从101万个SNP中找到了一个与果皮颜色表型高度相关的SNP位点(图1)。该SNP位于基因Solyc01g079620(即基因SlMYB12)的ATG上游8616bp处(SL2.40ch01:71246984)，此位点C与红果表型高度连锁(232个红果全部为C)，A与粉果表型高度连锁(25个体为A,1个个体为C)。

利用跨含该SNP-p区域的引物对(Seq ID No.2-3)，进行红果和粉果的检测，具体方法如下：提取待测番茄的基因组DNA，利用用于检测标记SNP-p的特异性引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条398bp大小(Seq ID No.8)的条带，说明扩增出特异性的目的条带，相关序列进行焦磷酸测序，如果目的条带的207bp处为C，表明待测番茄极有可能是红果，若目的条带的207bp处为A，表明待测番茄极有可能是粉果。

实施例2 与番茄果实颜色性状相关的InDel-p标记的获得

从重测序材料中分别选取20个粉果和20个红果的测序数据(测序时建库长度为500bp，采用双末端测序策略)，利用BWA软件将它们的重测序数据分别与番茄参考基因组(版本SL2.40)进行比对，利用SAMtools软件将比对结果转换为可读文件。对基因Solyc01g079620与其上游基因Solyc01g079610之间区域(SL2.40ch01:71229871-71,258,882)的所有成对出现的reads(paired-end reads)进行检测，发现在所有红果个体中一对reads之间的距离都在500bp左右，然而在粉果个体中有异常reads的出现，它们的距离在1100bp左右，表明粉果个体中存在一个约600bp的缺失(图2)。

利用跨该缺失区域的引物对红果和粉果个体进行PCR检测，并进行焦磷酸测序，具体方法如下：提取待测番茄的基因组DNA，利用引物对(Seq ID No.6和7)进行检测，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl。

PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，35个循环；72℃10分钟。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统中观察，预期目的条带长度为300-1000bp，对扩增序列进行测序检测。

结果分析：电泳检测PCR扩增产物，红果个体条带约为960bp，粉果个体的条带约为360bp(图3)，测序结果显示在粉果个体中存在603bp的缺失(Seq ID No.1)。

实施例3 与番茄果皮颜色性状相关的SNP-s、InDel-i标记的获得

对SlMYB12基因编码区进行PCR检测并进行焦磷酸测序，具体方法如下：

扩增所用正向引物为F5’-AATAATGGGAAGAACACC-3’反向引物为R5’-TTCTGGACCTAGACTAAA-3’。

PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统中观察，目的条带大小为439bp(Seq ID No.9)，并对扩增产物进行测序检测。.

结果分析：目的条带在251处有碱基A插入的待测番茄为粉果(图4)；或者在311bp处碱基为T的待测番茄为粉果，在311bp处碱基为C的待测番茄为红果(图5)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.与番茄果实颜色性状相关的分子标记，其特征在于，包含2个SNP标记和2个InDel标记；

第1个SNP标记SNP-p位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游第8616bp处，此处碱基为C的为红果番茄，此处碱基为A的为粉果番茄；

第1个InDel标记InDel-p是位于番茄SlMYB12基因起始密码子上游4kb处大小为603bp的DNA序列，该序列缺失的为粉果番茄；所述序列的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

2.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，用于检测标记SNP-p的特异性引物对为：

正向引物F5’-GCCTTCTTCTACACCCTT-3’

反向引物R5’-ACACCAGTGCTCCTCCTA-3’。

3.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，用于检测标记SNP-s和标记InDel-i的特异性引物对为：

正向引物F5’-AATAATGGGAAGAACACC-3’

反向引物R5’-TTCTGGACCTAGACTAAA-3’。

4.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于，用于检测标记InDel-p的特异性引物对为：

正向引物F5’-AGTGACGAACAACCGACCTA-3’

反向引物R5’-CCTCACAAACGCGGACAAA-3’。

5.一种鉴定番茄果实颜色的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测番茄的基因组DNA；

2)以待测番茄的基因组DNA为模板，利用权利要求2-4的引物对，进行PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中利用权利要求2的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中利用权利要求3的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl；

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中利用权利要求4的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为：含1.5mmol/L Mg²⁺的1×PCR反应缓冲液2μl，2.5mM dNTPs0.8μl，10μM上、下游引物各0.3μl，2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，20ng/μl DNA模板2μl，ddH₂O补齐至20μl；

9.含有权利要求2-4所述引物对的用于检测番茄果实颜色的试剂盒。

10.权利要求1所述与番茄果实颜色性状相关的分子标记在番茄分子标记辅助育种中的应用。