CN113337636A - 一种鉴别番茄叶脉性状的snp位点、kasp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用，SNP位点位于SEQIDNo：1第404处，多态性为A/G，该碱基为A时，该番茄叶脉性状为暗脉；该碱基为G时，该番茄叶脉性状为明脉；利用该SNP位点，能将番茄明脉和暗脉很好地区别开。本发明涉及的番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记，采用KASP分子标记引物对番茄育种群体进行辅助选择，得到了叶脉为暗脉的番茄株系，这表明该分子标记用于番茄叶脉明暗性状的分子标记辅助选择是切实有效的，利用本发明进行分子标记辅助选择可提高选择效率，加快育种进程。

Description

一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，特别涉及一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用。

背景技术

光合效率是影响作物产量的关键因素。叶片是重要的光合器官，在植物应答环境、传导水分、运输养分等多个方面发挥着重要作用，是作物遗传改良的关键性状。叶脉作为叶片的重要组成部分，不仅发挥着支撑作用，而且叶脉密度、数目等与作物产量紧密相关，叶脉的布局和排列等形态特征在生态学、古生物学及植物分类学中也占有重要位置。因此，长期以来一直是国内外科学家研究的热点。

育种家在番茄生产中发现一个暗脉(obv)自然突变基因已被很好地固定在加工用的番茄品种中，该些品种在干旱、高光强等环境条件下显著提高了光合效率，增加了产量。野生种番茄叶脉均表现为透明叶脉，即明脉，暗脉obv突变可能来源于十九世纪二十年代一个品种Earliana，该性状为单隐性基因控制，是由于叶脉叶绿素含量增加而引起，对于叶片气体交换相关性状具有明显增益，可明显提高水分利用率和产量。番茄叶脉明暗是由于叶脉中叶绿素含量高低引起的，番茄下表皮细胞和叶肉细胞周围通常没有叶绿体，暗脉番茄材料却相反。其次，番茄暗脉表型是由于叶片中缺乏维管束鞘延伸(Bundle SheathExtensions,BSEs)引起的，暗脉叶片栅栏组织在上表皮具有连续性，而明脉的栅栏组织是不连续的。

本研究获得叶脉明暗性状的分子标记，可以为obv基因的品种选育提供更紧密连锁的分子标记。

发明内容

为解决现有技术中上述问题，本发明提供了一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用；该KASP分子标记在番茄苗期快速筛选和鉴定番茄叶脉明暗性状，可于植株早期快速稳定地筛选和鉴定番茄叶脉明暗性状。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点，所述SNP位点位于SEQ ID No：1第404处，多态性为A/G，该碱基为A时，该番茄叶脉性状为暗脉；该碱基为G时，该番茄叶脉性状为明脉。

本发明还提供了所述一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点在番茄叶脉性状的分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明还提供了针对所述鉴别番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记，该KASP分子标记的引物序列包括如SEQ ID No：4-6所示的引物。

本发明还提供了针对鉴别番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记的应用。

在本申请的一个优选实施方式中，所述应用为KASP分子标记在番茄叶脉性状的分子标记辅助选择育种中的应用。

在本申请的一个具体实施方式中，所述应用的方法包括以下步骤：

(1)番茄基因组DNA的提取；

(2)采用SEQ ID No：4-6所示的引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物：

(3)对扩增产物进行KASP基因分型检测，根据分型检测结果鉴别番茄叶脉性状。

进一步的，所述步骤(3)中，当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定番茄叶脉性状为暗脉纯合子；当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定番茄叶脉性状为明脉纯合子；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定番茄叶脉性状为明脉杂合子。

在本申请的一个具体实施方式中，所述应用的方法包括以下步骤：

(1)以暗脉材料05-49(暗脉)为母本，05-62(明脉)为父本以及F1的基因组DNA为模板，此SNP位点信息设计KASP引物，用所述分子标记物对父母本和F₁进行PCR扩增得到其扩增产物；

(2)扩增结束后，通过酶标仪的FAM和HEX光束扫描读取荧光值根据荧光信号颜色判断父母本和F₁基因型，得到能同时鉴定父本、母本及其杂合体的基因分型图。

所述步骤(1)中PCR反应温度程序是：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火1min(选用touch down程序，每循环降低0、6℃)，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性并延伸1min，继续扩增26个循环。

反应体系1ul。各PCR反应体系中，名称中含有“A1”的引物(接头序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)、名称中含有“A2”的引物(接头序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)和名称中含有“C”的引物的浓度比为2:2:5。具体反应体系如下：

所述步骤(2)中FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值，根据荧光信号颜色判断各单株基于特异SNP位点的基因型。SNP基因分型的整个实验步骤按照英国LGC公司的操作指南(www、lgcgenomics、com)进行，反应在1536微孔板(Part NO.KBS-0751-001)中进行。

本发明具备的有益效果在于：

(1)本发明涉及的鉴别番茄叶脉性状的SNP位点，多态性为A/G，该碱基为A时，该番茄叶脉性状为暗脉；该碱基为G时，该番茄叶脉性状为明脉，利用该SNP位点，能将番茄明脉和暗脉很好地区别开。

(2)本发明涉及的番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记，采用KASP分子标记引物对番茄育种群体进行辅助选择，得到了叶脉为暗脉的番茄株系，这表明该分子标记物用于番茄叶脉明暗性状的分子标记辅助选择是切实有效的，利用本发明进行分子标记辅助选择可提高选择效率，加快育种进程。

(3)本发明的KASP分子标记引物用于鉴别番茄叶脉是否具有暗脉性状，只需通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对样品的鉴别；不需要限制性内切酶酶切，标记的特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简便快捷具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量、自动化的优点，非常适合现代农业分子育种的实现。

附图说明

图1番茄叶片叶脉表型观察；

图2番茄叶片叶脉石蜡切片；

图3番茄叶脉obv性状的全基因组关联分析；

图4番茄叶脉obv性状的精细定位

图5番茄明脉与暗脉叶片光合指标；

图6番茄Micro-tom及obv基因编辑植株叶片叶脉表型与石蜡切片；

图7番茄Micro-tom及obv基因编辑植株、叶脉叶绿素含量与维管束中叶绿体数量；

图8番茄M82与obv超表达植株叶脉；

图9为KASP标记基因分型结果。图中，X轴和Y轴的散点图表示obv和obv基因型的等位基因鉴别。蓝点、绿点和红点分别代表突变型纯合子、杂合子和野生型纯合子。

具体实施方式

下面通过具体的实施案例对本发明做进一步的详细描述。

1、番茄叶片明脉与暗脉的鉴定。

两种基因型番茄材料的子叶在出芽时已经表现出不同的叶脉，随着真叶的发育，使得区分明暗脉表型更加容易。两者的叶片大小、厚度和形状差异不大，但是叶脉明暗表型差异显著，在阳光直射下，用肉眼可观察到明显的区别，如图1所示。

为进一步观察明暗脉材料的差异，采用石蜡切片观察材料明脉和暗脉叶片叶脉的横截面，可以明显看出，在明脉材料叶脉中维管束鞘延伸缺失，栅栏组织变得不连续；而在暗脉材料叶脉中维管束鞘延伸的存在，栅栏组织与叶脉保持连续状态，如图2所示。

测定明脉与暗脉番茄的光合指标，如图5所示，图5的结果表明，暗脉番茄叶片的光合速率、气孔导度和蒸腾速率分别是明脉番茄叶片的1.98倍、2.64倍和2.94倍，说明暗脉基因能够提高番茄叶片的光合效率。

1、番茄自然群体的全基因组关联分析(GWAS)

利用广泛收集的299份加工番茄种质材料为自然群体，其中包括明脉材料129份，暗脉材料163份，数据缺失7份，具体表型调查结果见附录1。通过对其进行表型观察记录，结合全基因组重测序数据，完成全基因组关联分析，如图3所示。明确了obv基因位于5号染色体长臂的末端，置信区间为SL2.50chr05：63,049,462bp-64,012,700bp，区间大小为963,238bp，并于SP5G连锁。

2、番茄明暗脉基因obv的遗传定位

利用番茄明脉材料05-62和暗脉材料05-49构建了1500株系的F2分离群体，表型鉴定符合3:1分离规律，说明暗脉性状由隐性单基因控制。根据GWAS结果，选取SNPs位点开发成KASP标记，结合表型鉴定结果，通过构建连锁图谱，完成obv基因的精细定位。根据重组单株的基因分型和表型鉴定结果，最终将obv基因定位到第5号染色体分子标记SNP20和SNP24之间，区间大小约为24.141kb，如图4所示。

3、确定突变位点，获得候选基因

利用SGN网站(https://solgenomics.net)，在定位的24.141kb区间内进行基因预测，发现在此区域内总共3个开放阅读框。我们利用EnsemblPlants网站(https://plants.ensembl.org/Solanum_lycopersicum/Info/Index)查看上述三个基因的表达情况，发现Solyc05g054030和Solyc05g054040在叶片中表达，对上述2个基因的全长逐个测序分析表明：Solyc05g054030的第三个外显子上存在1个碱基G替换为A的突变，位于CDS区第404个碱基处，编码第135个氨基酸；；Solyc05g054040编码区序列无差异；最终将Solyc05g054030确定为候选基因，该基因属于C2H2类型的锌指结构转录因子。该基因的核苷酸序列如下所示。

SEQ ID No：1

Solyc05g054030基因序列

>SL4.0ch05 SL4.0ch05:63395462..63398588(+strand)length＝3127

ATGCTAACTAGCAACTCTTTCTTGTTTGGTGCTCCTTCTAATTATTCTGATCCATTTTCTTCCCCAGAAAATGGTTTTATTATCAAAAGAAAAAGAAGACCTGCTGGTACTCCAGGTATATATATATATTTTTAATTAATTAATTAGTATATTTTTAAAAAAAAATTAATTTACATAAATATATGAAGAAAATGGTACTTTTTTTGATAATTATGTGAAAAAACACTTGAGTTTTAGCTCTTGTGTGTCTATTATATTTCTAAATTGATCAACATGTTCAGTCAGTGACGAAAACAGAATTTTCATCAGAGGATTCATGAGGATGTAACGAAAAGAATTCAGATGAACCTCCTTTTGGCTTTTTCTATCTCCGACCTTGTGTTTTTGAATTCAGAATTTAAACGTTATAGATGAGAAAGTTGAATTATGATTTAACCTTATCTTTATAGTCAAGGGCGGAGCTATAGGTAACAAAGATTGTTTGGTTGATACAACCCCTTTCGTCAGAAAATTATATTTTTATATATTTATTTTTTAAAAAAAATTCTTAACCTAATAGATTTAATTTTTTAAAATTTTCTTAACCTAATAAATTTAGATGTGAAAATTATATTTGAATTACTGGCTCCGCTACTATTGCTAACACACATATGTTTAGGGTTATTCGACTGGTAAGAATGCTATTGAATTCTGTTGAACTCGTAATAATTAAATTTACGAATTTGCACAGATCCCGATGCACAAGTTGTATATCTTACAGCTGAGATGTTAATGGAATCTGATCGTTACGTTTGTGAAATCTGCAACCTTAGCTTTCAAAGAGAGCAAAATCTACAAATGCATCGTCGTCGCCATAAGGTTCCATGGAAGTTGAAGAAGAAGGTAGTTTAATTTATGTATAATTACGTCATCAATATATCGTCTCATCTAAAATCTTAAACTGTTCGATAGAACACAAGTTCTTCATTCGTTCAATAGGGAGTGAGTCTTCCCCTTTTTGAAAAATGAGTTAATATCATGTGTAGACGGAGAATTCATATATCTGATAAGAACAGATGTTACACTTGATCTTAGCCACAAGACCGAGAAAGATATTGATGAGAACTATACAATTTTTATTTACTAAATTATACTTTATATTTCAACACATCTCCTCACGTGCAAGTCATGAAGTTCTTCTTCTTCTTTTTTATTACGAGAACGATACATTTTAATATTTAGAATTTCTCTGTTTATTCTTACTGAAATGATTTATAATAATCACACAAATTGCTAAGGCTTAGTTTTCGACAATAATTTTCAAAAGTCTTTCAATTCTAGACGTCACTCCCCAGTTAAATATAGTCACATAAATTGTAACTGACATATTAGATTATATGATTAGATATGTTAATTTTTTTAATTAAATATAAATATAATTTCATTTACTTGATTATATTTTCAACGTGATCATCAGGAAGAAGAGAAAAATGAGATGGATCAAGTTATTAAGAAGAGAGTATATGTGTGTCCAGAGCCAAGTTGTGTGCACCATGATCCATGTCATGCATTAGGTGATCTTGTTGGAATCAAAAAACATTTTAGAAGAAAACGTAGCAATTACAAACAATGGATTTGTCAAAAATGCAACAAAGGTTATGCTGTTCAATCAGATTATAAAGCTCACATCAAAACTTGTGGTACTAGAGGCCATTCTTGTGATTGTGGAAGAGTTTTCTCTAGGTAAATTCATCTTCTTAATTATATATCTGTGTTCTGTTTTACTTGAGTCGAGAATCTATAAGAAAAAATAGAATCTATTTATCCTCATAGGAGTAAGGTTACAACGTCCTATTCAGATTCCACTAAATATGTTATTGTTATAGTAATTTTTATCATCAGCGTATCTTTATTATCTAGGTTATATTAAATATACTACTAAAAAACGTTAAAGAATTAGCTATGAAATTCGTAGCTGGTTAATTTATAACTAAATAGTCTATATCTACTAAGATTGTCTCATTATAAAATGTCATTTCTATGTAGTCAAATAGAATTAGGTTTAATTCATTGTTTAGTGATATAAATTAAATTTATAAAAATCTTTTAAGTGACTTAATAGCGTAAAAAGTAAATTTACACTATCTTATATATAAAAATTATACACATATATCAAGATGAGATTACCACATGTTACTTGAATTGGTAACATCCTTTAGGTCTAAAACCTAATGTATATATATGTCTTGTAAATGTACAAACATATTTTGTGTGCTCACATTTGAAAATTTCTTCCTTATCTATATGATTATAAAAATCACTATCTTTTTAGTTAAAAACATGAATATTATTATCAGAAAATCACTAATTTTCGACGATATTATATGAGTCAAATTCTGATAGATTTGTTGGAAATATTTTTAATTAAAAATTAGCGATTTTCTGATAGTAAATTTGAGTTATATATAGTATGTTTCTTCTAATTAATCTACTTTTTTTTTCCTCCCATTTTTATTGTGTTTTTTTTTTCAGAGTTGAAACATTTATTGAGCATCAAGATTCATGCAAACCACAAAGTACAACTACTAAAGAATGTCATGATATGCAAATACCAAAACCAATTTTCTTGCCTACTACTACAACTCATATCCCACCACATGATCAATATTCAAAAATATTGCCTAATCTTGATCTTGAGCTTTTCACTTCTCCAAATTATTTCAACCAAAACACACACAATTTTTCATCATTTGTTGATCAAAGTGATCATCATCATCATAATAATAATTACATAGTCCAAAACAATGATATTGAAGTCAAAGAAATTATTGAAGAGGCAACAACACAAGTAACAAGATTGAAAAGTGAAGCAAATGAAATACTCAAAATAGCAATGGAAGAAAAGGCAATGGCTATAGAGAAGAGACAAGAAGCAAAGTGTTTGATTGAATTAGCCAACCTTGAAATGGCAAAAGCAATGGAAATTAGACAAAGTGTTTGTGCTTCATCATCATCATCATCACATGTCATGAAGATAATAAAATGTAGTTCTTGTAATAATAAACAATTTCAAAGTGTGTCATCATCAAAAGATGCTACTTTGACTAATAATTATTATTTGTCATCTTCTATTTATAGAAGATGATGA

SEQ ID No：2

编码序列(CDS)

ATGCTAACTAGCAACTCTTTCTTGTTTGGTGCTCCTTCTAATTATTCTGATCCATTTTCTTCCCCAGAAAATGGTTTTATTATCAAAAGAAAAAGAAGACCTGCTGGTACTCCAGATCCCGATGCACAAGTTGTATATCTTACAGCTGAGATGTTAATGGAATCTGATCGTTACGTTTGTGAAATCTGCAACCTTAGCTTTCAAAGAGAGCAAAATCTACAAATGCATCGTCGTCGCCATAAGGTTCCATGGAAGTTGAAGAAGAAGGAAGAAGAGAAAAATGAGATGGATCAAGTTATTAAGAAGAGAGTATATGTGTGTCCAGAGCCAAGTTGTGTGCACCATGATCCATGTCATGCATTAGGTGATCTTGTTGGAATCAAAAAACATTTTAGAAGAAAACGTAGCAATTACAAACAATGGATTTGTCAAAAATGCAACAAAGGTTATGCTGTTCAATCAGATTATAAAGCTCACATCAAAACTTGTGGTACTAGAGGCCATTCTTGTGATTGTGGAAGAGTTTTCTCTAGAGTTGAAACATTTATTGAGCATCAAGATTCATGCAAACCACAAAGTACAACTACTAAAGAATGTCATGATATGCAAATACCAAAACCAATTTTCTTGCCTACTACTACAACTCATATCCCACCACATGATCAATATTCAAAAATATTGCCTAATCTTGATCTTGAGCTTTTCACTTCTCCAAATTATTTCAACCAAAACACACACAATTTTTCATCATTTGTTGATCAAAGTGATCATCATCATCATAATAATAATTACATAGTCCAAAACAATGATATTGAAGTCAAAGAAATTATTGAAGAGGCAACAACACAAGTAACAAGATTGAAAAGTGAAGCAAATGAAATACTCAAAATAGCAATGGAAGAAAAGGCAATGGCTATAGAGAAGAGACAAGAAGCAAAGTGTTTGATTGAATTAGCCAACCTTGAAATGGCAAAAGCAATGGAAATTAGACAAAGTGTTTGTGCTTCATCATCATCATCATCACATGTCATGAAGATAATAAAATGTAGTTCTTGTAATAATAAACAATTTCAAAGTGTGTCATCATCAAAAGATGCTACTTTGACTAATAATTATTATTTGTCATCTTCTATTTATAGAAGATGA

SEQ ID No：3

氨基酸序列

MLTSNSFLFGAPSNYSDPFSSPENGFIIKRKRRPAGTPDPDAQVVYLTAEMLMESDRYVCEICNLSFQREQNLQMHRRRHKVPWKLKKKEEEKNEMDQVIKKRVYVCPEPSCVHHDPCHALGDLVGIKKHFRRKRSNYKQWICQKCNKGYAVQSDYKAHIKTCGTRGHSCDCGRVFSRVETFIEHQDSCKPQSTTTKECHDMQIPKPIFLPTTTTHIPPHDQYSKILPNLDLELFTSPNYFNQNTHNFSSFVDQSDHHHHNNNYIVQNNDIEVKEIIEEATTQVTRLKSEANEILKIAMEEKAMAIEKRQEAKCLIELANLEMAKAMEIRQSVCASSSSSSHVMKIIKCSSCNNKQFQSVSSSKDATLTNNYYLSSSIYRR*

4、obv基因的基因敲除试验

为进一步确定番茄叶脉为暗脉的表型是由于基因Solyc05g054030的变化造成的，在野生型Micro-Tom的背景下，通过Crispr/Cas9敲除实验验证obv基因功能。以pMGET(pKSE401-S)载体为骨架载体，采用T4连接法构建CRISPR/Cas9载体，以明脉番茄Micro-Tom为材料，获得转基因植株。最终共获得12棵转基因阳性株系，最终选择其中三棵阳性植株(Cris-1、Cris-3和Cris-24)开展进一步的实验，与野生型Micro-Tom的叶脉为明脉相比，三个转基因株系的叶脉都是暗脉，如图6所示。

石蜡切片实验观察敲除突变体与野生型叶脉横截面的结果显示，转基因植株Cris-24叶脉中的栅栏组织在上表皮是连续排列的，而野生型Micro-Tom叶脉中的栅栏组织则呈现不连续的排列，如图6所示，这与之前的石蜡切片结果完全一致。

同时，对上述材料叶脉中的叶绿素含量进行检测，结果如图7所示，由图7可知，Cris-obv叶脉中Chl a和Chl b的含量都是WT的1.4倍左右，明显比野生型中的叶绿素含量高；叶脉维管束中叶绿体数量明显增加。

5、obv基因的超表达试验

为进一步验证obv基因功能，我们进行了超量表达obv基因。将obv的全长编码序列(CDS)克隆到pBI121双元载体中，采用农杆菌GV3101介导的遗传转化方法，将超表达载体转化到暗脉番茄M82中，获得转基因植株。与野生型M82相比，转基因植株叶片的主脉和侧脉都呈现明脉表型，见图8。综合敲除和过表达实验的结果，我们可以确定Solyc05g054030就是调控番茄叶片暗脉形成的目标基因，该基因具有具有调控叶脉明暗的功能。

实施例二与叶脉暗脉基因obv紧密连锁的KASP标记获得

我们利用Premier5、0软件设计引物，分别以母本暗脉材料05-49和父本明脉材料的DNA为模版，扩增Solyc05g054030基因的基因组序列，所用引物序列见表1。

表1扩增三个基因全长所使用的引物列表

本发明通过一代测序对控制番茄明暗脉基因obv全长测序分析表明：Solyc05g054030的第三个外显子上存在1个碱基G替换为A的突变，位于CDS区第404个碱基处，编码第135个氨基酸，导致精氨酸(R)变为组氨酸(H)。

我们利用NCBI上的Protein BLAST工具，搜索了14条与obv蛋白相关的茄科植物和其他物种(烟草、水稻、拟南芥、大豆和葡萄)的同源蛋白，利用MEGA 7、0对同源性较高的obv氨基酸序列进行比对和进化树分析。结果表明在obv突变体存在一个氨基酸替换(R/H)，且该变异位点位于保守结构域，表明该突变位置对obv的分子功能具有重要意义。

我们根据该基因突变信息将SNP位点开发成KASP标记，本发明提供的一种番茄叶脉明暗性状的分子标记物，包括F1引物、F2引物和C引物，F1引物的核苷酸序列如SEQ IDNo：4所示，F2引物的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示，C引物的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示(表2)。

表2 KASP基因分型所使用的引物列表

利用暗脉材料05-49(母本)为母本，明脉材料05-62(父本)以及杂交产生F₁代对该引物对进行标记多态性检测，反应在1536微孔板(Part NO.KBS-0751-001)中进行，反应体系1μl，具体反应体系和PCR反应程序如下：

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火1min(选用touchdown程序，每循环降低0、6℃)，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性并延伸1min，继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用KASP基因分型平台(上海艾吉析科技有限，简称LGC公司)分型检测。通过酶标仪的FAM和HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断各SNP位点的基因型。结果表明母本05-49(暗脉)为蓝色，父本05-62(明脉)颜色为红色，F₁代颜色为绿色则为杂合基因型。分型图如图9所示。

实施例二与暗脉基因obv紧密连锁标记的应用

为了进一步验证标记的准确性，利用包括母本暗脉材料05-49，父本明脉材料05-62在内的课题组100份加工番茄的自然群体作为研究材料，将材料种植在试验田。待到4片真叶期对其明暗脉表型进行调查，在户外进行表型观察时，从一个基因型植株上至少剪下三个成熟的小叶，将叶片置于光照下，面对光源，从叶片背面对暗脉(obv)和明脉(OBV)进行观察区分。

利用CTAB法提取以上材料叶片的基因组DNA(Fulton et al、,1995)。利用实施例1中获得的标记KASP20对100份加工番茄的自然群体进行多态性检测，具体反应体系和PCR反应程序如下：

具体反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃退火1min(选用touchdown程序，每循环降低0、6℃)，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性并延伸1min，继续扩增26个循环。

扩增结束后，通过酶标仪的FAM和HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断各单株基于每个SNP位点的基因型。

利用所获得紧密连锁的分子标记KASP20对课题组100份自然群体材料进行分子标记分析。结果表明：在100份高代自交系中，标记KASP20检测到阳性单株67个，编号分别是1、2、3、4、6、7、9、11、12、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、36、37、38、39、43、46、51、52、53、56、58、59、60、61、62、67、68、71、72、73、74、75、76、79、80、82、84、85、86、87、89、90、91、92、93、98、99号自交系；检测为阳性的单株，田间表型鉴定结果为暗脉。证明了本实验发明的分子标记与暗脉基因obv的紧密连锁(表3)。

表3 100份自然群体的叶脉表型分析及obv基因分子标记分析

Note:0＝obscurevein,1＝clearvein,2＝unsure、

以上对本发明所提供的一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

<110> 中国农业科学院 蔬菜花卉研究所

<120> 一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点、KASP分子标记及应用

<130> CNP210011

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6254

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgctaacta gcaactcttt cttgtttggt gctccttcta attattctga tccattttct 60

tccccagaaa atggttttat tatcaaaaga aaaagaagac ctgctggtac tccaggtata 120

tatatatatt tttaattaat taattagtat atttttaaaa aaaaattaat ttacataaat 180

atatgaagaa aatggtactt tttttgataa ttatgtgaaa aaacacttga gttttagctc 240

ttgtgtgtct attatatttc taaattgatc aacatgttca gtcagtgacg aaaacagaat 300

tttcatcaga ggattcatga ggatgtaacg aaaagaattc agatgaacct ccttttggct 360

ttttctatct ccgaccttgt gtttttgaat tcagaattta aacgttatag atgagaaagt 420

tgaattatga tttaacctta tctttatagt caagggcgga gctataggta acaaagattg 480

tttggttgat acaacccctt tcgtcagaaa attatatttt tatatattta ttttttaaaa 540

aaaattctta acctaataga tttaattttt taaaattttc ttaacctaat aaatttagat 600

gtgaaaatta tatttgaatt actggctccg ctactattgc taacacacat atgtttaggg 660

ttattcgact ggtaagaatg ctattgaatt ctgttgaact cgtaataatt aaatttacga 720

atttgcacag atcccgatgc acaagttgta tatcttacag ctgagatgtt aatggaatct 780

gatcgttacg tttgtgaaat ctgcaacctt agctttcaaa gagagcaaaa tctacaaatg 840

catcgtcgtc gccataaggt tccatggaag ttgaagaaga aggtagttta atttatgtat 900

aattacgtca tcaatatatc gtctcatcta aaatcttaaa ctgttcgata gaacacaagt 960

tcttcattcg ttcaataggg agtgagtctt cccctttttg aaaaatgagt taatatcatg 1020

tgtagacgga gaattcatat atctgataag aacagatgtt acacttgatc ttagccacaa 1080

gaccgagaaa gatattgatg agaactatac aatttttatt tactaaatta tactttatat 1140

ttcaacacat ctcctcacgt gcaagtcatg aagttcttct tcttcttttt tattacgaga 1200

acgatacatt ttaatattta gaatttctct gtttattctt actgaaatga tttataataa 1260

tcacacaaat tgctaaggct tagttttcga caataatttt caaaagtctt tcaattctag 1320

acgtcactcc ccagttaaat atagtcacat aaattgtaac tgacatatta gattatatga 1380

ttagatatgt taattttttt aattaaatat aaatataatt tcatttactt gattatattt 1440

tcaacgtgat catcaggaag aagagaaaaa tgagatggat caagttatta agaagagagt 1500

atatgtgtgt ccagagccaa gttgtgtgca ccatgatcca tgtcatgcat taggtgatct 1560

tgttggaatc aaaaaacatt ttagaagaaa acgtagcaat tacaaacaat ggatttgtca 1620

aaaatgcaac aaaggttatg ctgttcaatc agattataaa gctcacatca aaacttgtgg 1680

tactagaggc cattcttgtg attgtggaag agttttctct aggtaaattc atcttcttaa 1740

ttatatatct gtgttctgtt ttacttgagt cgagaatcta taagaaaaaa tagaatctat 1800

ttatcctcat aggagtaagg ttacaacgtc ctattcagat tccactaaat atgttattgt 1860

tatagtaatt tttatcatca gcgtatcttt attatctagg ttatattaaa tatactacta 1920

aaaaacgtta aagaattagc tatgaaattc gtagctggtt aatttataac taaatagtct 1980

atatctacta agattgtctc attataaaat gtcatttcta tgtagtcaaa tagaattagg 2040

tttaattcat tgtttagtga tataaattaa atttataaaa atcttttaag tgacttaata 2100

gcgtaaaaag taaatttaca ctatcttata tataaaaatt atacacatat atcaagatga 2160

gattaccaca tgttacttga attggtaaca tcctttaggt ctaaaaccta atgtatatat 2220

atgtcttgta aatgtacaaa catattttgt gtgctcacat ttgaaaattt cttccttatc 2280

tatatgatta taaaaatcac tatcttttta gttaaaaaca tgaatattat tatcagaaaa 2340

tcactaattt tcgacgatat tatatgagtc aaattctgat agatttgttg gaaatatttt 2400

taattaaaaa ttagcgattt tctgatagta aatttgagtt atatatagta tgtttcttct 2460

aattaatcta cttttttttt cctcccattt ttattgtgtt ttttttttca gagttgaaac 2520

atttattgag catcaagatt catgcaaacc acaaagtaca actactaaag aatgtcatga 2580

tatgcaaata ccaaaaccaa ttttcttgcc tactactaca actcatatcc caccacatga 2640

tcaatattca aaaatattgc ctaatcttga tcttgagctt ttcacttctc caaattattt 2700

caaccaaaac acacacaatt tttcatcatt tgttgatcaa agtgatcatc atcatcataa 2760

taataattac atagtccaaa acaatgatat tgaagtcaaa gaaattattg aagaggcaac 2820

aacacaagta acaagattga aaagtgaagc aaatgaaata ctcaaaatag caatggaaga 2880

aaaggcaatg gctatagaga agagacaaga agcaaagtgt ttgattgaat tagccaacct 2940

tgaaatggca aaagcaatgg aaattagaca aagtgtttgt gcttcatcat catcatcatc 3000

acatgtcatg aagataataa aatgtagttc ttgtaataat aaacaatttc aaagtgtgtc 3060

atcatcaaaa gatgctactt tgactaataa ttattatttg tcatcttatg ctaactagca 3120

actctttctt gtttggtgct ccttctaatt attctgatcc attttcttcc ccagaaaatg 3180

gttttattat caaaagaaaa agaagacctg ctggtactcc aggtatatat atatattttt 3240

aattaattaa ttagtatatt tttaaaaaaa aattaattta cataaatata tgaagaaaat 3300

ggtacttttt ttgataatta tgtgaaaaaa cacttgagtt ttagctcttg tgtgtctatt 3360

atatttctaa attgatcaac atgttcagtc agtgacgaaa acagaatttt catcagagga 3420

ttcatgagga tgtaacgaaa agaattcaga tgaacctcct tttggctttt tctatctccg 3480

accttgtgtt tttgaattca gaatttaaac gttatagatg agaaagttga attatgattt 3540

aaccttatct ttatagtcaa gggcggagct ataggtaaca aagattgttt ggttgataca 3600

acccctttcg tcagaaaatt atatttttat atatttattt tttaaaaaaa attcttaacc 3660

taatagattt aattttttaa aattttctta acctaataaa tttagatgtg aaaattatat 3720

ttgaattact ggctccgcta ctattgctaa cacacatatg tttagggtta ttcgactggt 3780

aagaatgcta ttgaattctg ttgaactcgt aataattaaa tttacgaatt tgcacagatc 3840

ccgatgcaca agttgtatat cttacagctg agatgttaat ggaatctgat cgttacgttt 3900

gtgaaatctg caaccttagc tttcaaagag agcaaaatct acaaatgcat cgtcgtcgcc 3960

ataaggttcc atggaagttg aagaagaagg tagtttaatt tatgtataat tacgtcatca 4020

atatatcgtc tcatctaaaa tcttaaactg ttcgatagaa cacaagttct tcattcgttc 4080

aatagggagt gagtcttccc ctttttgaaa aatgagttaa tatcatgtgt agacggagaa 4140

ttcatatatc tgataagaac agatgttaca cttgatctta gccacaagac cgagaaagat 4200

attgatgaga actatacaat ttttatttac taaattatac tttatatttc aacacatctc 4260

ctcacgtgca agtcatgaag ttcttcttct tcttttttat tacgagaacg atacatttta 4320

atatttagaa tttctctgtt tattcttact gaaatgattt ataataatca cacaaattgc 4380

taaggcttag ttttcgacaa taattttcaa aagtctttca attctagacg tcactcccca 4440

gttaaatata gtcacataaa ttgtaactga catattagat tatatgatta gatatgttaa 4500

tttttttaat taaatataaa tataatttca tttacttgat tatattttca acgtgatcat 4560

caggaagaag agaaaaatga gatggatcaa gttattaaga agagagtata tgtgtgtcca 4620

gagccaagtt gtgtgcacca tgatccatgt catgcattag gtgatcttgt tggaatcaaa 4680

aaacatttta gaagaaaacg tagcaattac aaacaatgga tttgtcaaaa atgcaacaaa 4740

ggttatgctg ttcaatcaga ttataaagct cacatcaaaa cttgtggtac tagaggccat 4800

tcttgtgatt gtggaagagt tttctctagg taaattcatc ttcttaatta tatatctgtg 4860

ttctgtttta cttgagtcga gaatctataa gaaaaaatag aatctattta tcctcatagg 4920

agtaaggtta caacgtccta ttcagattcc actaaatatg ttattgttat agtaattttt 4980

atcatcagcg tatctttatt atctaggtta tattaaatat actactaaaa aacgttaaag 5040

aattagctat gaaattcgta gctggttaat ttataactaa atagtctata tctactaaga 5100

ttgtctcatt ataaaatgtc atttctatgt agtcaaatag aattaggttt aattcattgt 5160

ttagtgatat aaattaaatt tataaaaatc ttttaagtga cttaatagcg taaaaagtaa 5220

atttacacta tcttatatat aaaaattata cacatatatc aagatgagat taccacatgt 5280

tacttgaatt ggtaacatcc tttaggtcta aaacctaatg tatatatatg tcttgtaaat 5340

gtacaaacat attttgtgtg ctcacatttg aaaatttctt ccttatctat atgattataa 5400

aaatcactat ctttttagtt aaaaacatga atattattat cagaaaatca ctaattttcg 5460

acgatattat atgagtcaaa ttctgataga tttgttggaa atatttttaa ttaaaaatta 5520

gcgattttct gatagtaaat ttgagttata tatagtatgt ttcttctaat taatctactt 5580

tttttttcct cccattttta ttgtgttttt tttttcagag ttgaaacatt tattgagcat 5640

caagattcat gcaaaccaca aagtacaact actaaagaat gtcatgatat gcaaatacca 5700

aaaccaattt tcttgcctac tactacaact catatcccac cacatgatca atattcaaaa 5760

atattgccta atcttgatct tgagcttttc acttctccaa attatttcaa ccaaaacaca 5820

cacaattttt catcatttgt tgatcaaagt gatcatcatc atcataataa taattacata 5880

gtccaaaaca atgatattga agtcaaagaa attattgaag aggcaacaac acaagtaaca 5940

agattgaaaa gtgaagcaaa tgaaatactc aaaatagcaa tggaagaaaa ggcaatggct 6000

atagagaaga gacaagaagc aaagtgtttg attgaattag ccaaccttga aatggcaaaa 6060

gcaatggaaa ttagacaaag tgtttgtgct tcatcatcat catcatcaca tgtcatgaag 6120

ataataaaat gtagttcttg taataataaa caatttcaaa gtgtgtcatc atcaaaagat 6180

gctactttga ctaataatta ttatttgtca tcttctattt atagaagatg atgactattt 6240

atagaagatg atga 6254

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgctaacta gcaactcttt cttgtttggt gctccttcta attattctga tccattttct 60

tccccagaaa atggttttat tatcaaaaga aaaagaagac ctgctggtac tccagatccc 120

gatgcacaag ttgtatatct tacagctgag atgttaatgg aatctgatcg ttacgtttgt 180

gaaatctgca accttagctt tcaaagagag caaaatctac aaatgcatcg tcgtcgccat 240

aaggttccat ggaagttgaa gaagaaggaa gaagagaaaa atgagatgga tcaagttatt 300

aagaagagag tatatgtgtg tccagagcca agttgtgtgc accatgatcc atgtcatgca 360

ttaggtgatc ttgttggaat caaaaaacat tttagaagaa aacgtagcaa ttacaaacaa 420

tggatttgtc aaaaatgcaa caaaggttat gctgttcaat cagattataa agctcacatc 480

aaaacttgtg gtactagagg ccattcttgt gattgtggaa gagttttctc tagagttgaa 540

acatttattg agcatcaaga ttcatgcaaa ccacaaagta caactactaa agaatgtcat 600

gatatgcaaa taccaaaacc aattttcttg cctactacta caactcatat cccaccacat 660

gatcaatatt caaaaatatt gcctaatctt gatcttgagc ttttcacttc tccaaattat 720

ttcaaccaaa acacacacaa tttttcatca tttgttgatc aaagtgatca tcatcatcat 780

aataataatt acatagtcca aaacaatgat attgaagtca aagaaattat tgaagaggca 840

acaacacaag taacaagatt gaaaagtgaa gcaaatgaaa tactcaaaat agcaatggaa 900

gaaaaggcaa tggctataga gaagagacaa gaagcaaagt gtttgattga attagccaac 960

cttgaaatgg caaaagcaat ggaaattaga caaagtgttt gtgcttcatc atcatcatca 1020

tcacatgtca tgaagataat aaaatgtagt tcttgtaata ataaacaatt tcaaagtgtg 1080

tcatcatcaa aagatgctac tttgactaat aattattatt tgtcatcttc tatttataga 1140

agatga 1146

<210> 3

<211> 381

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Leu Thr Ser Asn Ser Phe Leu Phe Gly Ala Pro Ser Asn Tyr Ser

1 5 10 15

Asp Pro Phe Ser Ser Pro Glu Asn Gly Phe Ile Ile Lys Arg Lys Arg

20 25 30

Arg Pro Ala Gly Thr Pro Asp Pro Asp Ala Gln Val Val Tyr Leu Thr

35 40 45

Ala Glu Met Leu Met Glu Ser Asp Arg Tyr Val Cys Glu Ile Cys Asn

50 55 60

Leu Ser Phe Gln Arg Glu Gln Asn Leu Gln Met His Arg Arg Arg His

65 70 75 80

Lys Val Pro Trp Lys Leu Lys Lys Lys Glu Glu Glu Lys Asn Glu Met

85 90 95

Asp Gln Val Ile Lys Lys Arg Val Tyr Val Cys Pro Glu Pro Ser Cys

100 105 110

Val His His Asp Pro Cys His Ala Leu Gly Asp Leu Val Gly Ile Lys

115 120 125

Lys His Phe Arg Arg Lys Arg Ser Asn Tyr Lys Gln Trp Ile Cys Gln

130 135 140

Lys Cys Asn Lys Gly Tyr Ala Val Gln Ser Asp Tyr Lys Ala His Ile

145 150 155 160

Lys Thr Cys Gly Thr Arg Gly His Ser Cys Asp Cys Gly Arg Val Phe

165 170 175

Ser Arg Val Glu Thr Phe Ile Glu His Gln Asp Ser Cys Lys Pro Gln

180 185 190

Ser Thr Thr Thr Lys Glu Cys His Asp Met Gln Ile Pro Lys Pro Ile

195 200 205

Phe Leu Pro Thr Thr Thr Thr His Ile Pro Pro His Asp Gln Tyr Ser

210 215 220

Lys Ile Leu Pro Asn Leu Asp Leu Glu Leu Phe Thr Ser Pro Asn Tyr

225 230 235 240

Phe Asn Gln Asn Thr His Asn Phe Ser Ser Phe Val Asp Gln Ser Asp

245 250 255

His His His His Asn Asn Asn Tyr Ile Val Gln Asn Asn Asp Ile Glu

260 265 270

Val Lys Glu Ile Ile Glu Glu Ala Thr Thr Gln Val Thr Arg Leu Lys

275 280 285

Ser Glu Ala Asn Glu Ile Leu Lys Ile Ala Met Glu Glu Lys Ala Met

290 295 300

Ala Ile Glu Lys Arg Gln Glu Ala Lys Cys Leu Ile Glu Leu Ala Asn

305 310 315 320

Leu Glu Met Ala Lys Ala Met Glu Ile Arg Gln Ser Val Cys Ala Ser

325 330 335

Ser Ser Ser Ser Ser His Val Met Lys Ile Ile Lys Cys Ser Ser Cys

340 345 350

Asn Asn Lys Gln Phe Gln Ser Val Ser Ser Ser Lys Asp Ala Thr Leu

355 360 365

Thr Asn Asn Tyr Tyr Leu Ser Ser Ser Ile Tyr Arg Arg

370 375 380

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tctacgtaca atcagagaaa ttacttcc 48

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tcctacgtac aatcagagaa attacttct 49

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

agcacggtat aaaaactgtt ataattaata tagaa 35

Claims (7)

1.一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点，其特征在于：所述SNP位点位于SEQ ID No：1第404处，多态性为A/G，该碱基为A时，该番茄叶脉性状为暗脉；该碱基为G时，该番茄叶脉性状为明脉。

2.权利要求1所述一种鉴别番茄叶脉性状的SNP位点在番茄叶脉性状的分子标记辅助选择育种中的应用。

3.针对权利要求1所述鉴别番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记，其特征在于，该KASP分子标记的引物序列包括如SEQ ID No：4-6所示的引物。

4.权利要求3所述针对鉴别番茄叶脉性状的SNP位点的KASP分子标记的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：是指该KASP分子标记在番茄叶脉性状的分子标记辅助选择育种中的应用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述应用的方法包括以下步骤：

(1)番茄基因组DNA的提取；

(2)采用SEQ ID No：4-6所示的引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物：

(3)对扩增产物进行KASP基因分型检测，根据分型检测结果鉴别番茄叶脉性状。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述步骤(3)中，当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定番茄叶脉性状为暗脉纯合子；当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定番茄叶脉性状为明脉纯合子；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定番茄叶脉性状为明脉杂合子。

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