CN112063631A - 毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

毛果杨PtrLBD4‑3基因及其编码蛋白和应用，它涉及生物技术领域，本发明提供毛果杨PtrLBD4‑3基因及其编码蛋白和应用，本发明中毛果杨PtrLBD4‑3基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明中毛果杨PtrLBD4‑3基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。它用于调控应拉木的形成。本发明公开了毛果杨中的PtrLBD4‑3转录因子的应用，本发明利用毛果杨这一基因组注释信息比较完善的木本模式植物诱导应拉木的形成，利用激光显微切割收集了应拉木木质部细胞进行了转录组测序分析，鉴定出了特异性响应应拉木形成的转录因子。本发明研究内容对培育具有应拉木优良特性的新品种具有重要的理论指导意义。本发明应用于毛果杨领域。

Description

毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
我国是世界人工林面积最大的国家，也是世界木制品加工生产和消费大国。随着经济社会的发展和人们生活水平的提高，木材的市场需求呈现多样化，尤其对木材品质提出了更高要求。木材主要是由次生细胞壁组成。次生细胞壁主要的成份是由纤维素，半纤维素，和木质素。然而，在重力胁迫下，次生细胞壁中的木质素对于木质部中细胞的分化以及不同细胞比例的形成起重要作用。在被子植物中，对其施加外力形成了弯曲树干，在受拉的一侧产生应拉木，与正常木比较形成在解剖和物理性质明显不同的木材。应拉木中的纤维细胞会含有凝胶纤维层(G-layer)，G-layer会取代次生细胞壁中的S3-layer，导致应拉木与正常木比较具有更多的纤维素、较少的木质素。因此，应拉木是一个有价值的研究模式系统，用于研究木质素与纤维素的生物合成。同时，应拉木也非常适合于生物燃料、制浆造纸的研究。
关于应拉木形成的研究主要集中在植物激素方面，比如生长激素、赤霉素、乙烯、油菜素类固醇都参与诱导、调控树木应拉木的形成。转录因子是植物体内参与植物生长发育、信号传导、胁迫应答等各种生物进程的一类重要的调控因子。已经有少量的研究表明，转录因子在应拉木的形成过程中发挥关键的调控作用。
发明内容
本发明提供毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用。
本发明中毛果杨PtrLBD4-3基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
获取该基因的方式为：
1)提取毛果杨植株总RNA，并反转录获得cDNA；
2)以cDNA为模板，以PtrLBD4-3-F和PtrLBD4-3-R为引物，进行PCR扩增；
3)对PCR扩增进行电泳分析，并回收441bp处的目标片段，经测序成功后，即得毛果杨PtrLBD4-3基因片段；
其中以PtrLBD4-3-F和PtrLBD4-3-R引物序列为：
PtrLBD4-3-F 5’-CACCATGAAGGAGAGCGGTCGA-3’
PtrLBD4-3-R 5’-GCATGACCACAAAGACTCC-3’。
进一步地，所述的PCR扩增的PCR体系如下：
Figure BDA0002687246280000021
PCR扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸30min，16℃保存。
本发明中毛果杨PtrLBD4-3基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明中毛果杨Ptr LBD4-3基因的应用是用于调控应拉木的形成。
通过PtrLBD4-3基因的过量表达使毛果杨在弯曲胁迫下促进应拉木形成。
本发明公开了毛果杨中的PtrLBD4-3转录因子的应用，本发明利用毛果杨这一基因组注释信息比较完善的木本模式植物诱导应拉木的形成，利用激光显微切割收集了应拉木木质部细胞进行了转录组测序分析，鉴定出了特异性响应应拉木形成的转录因子。其中，LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN(LBD)转录因子被弯曲胁迫高度诱导。通过农杆菌介导的毛果杨遗传转化系统，我们获得了PtrLBD4-3的过量表达转基因植株。利用分子生物学的技术手段分析发现，PtrLBD4-3转录因子的过量表达导致植株茎干木质部出现应拉木的特性，即纤维细胞较多、导管细胞较少、木质素含量降低、纤维素增多。这些结果表明，毛果杨PtrLBD4-3转录因子可以促进应拉木的形成，在次生细胞壁的木质素沉积及应拉木形成过程中具有重要作用。本发明研究内容对培育具有应拉木优良特性的新品种具有重要的理论指导意义。
附图说明
图1为本发明毛果杨弯曲胁迫处理图；圆圈代表受力最大部位；
图2为本发明毛果杨不同弯曲处理时间点应拉木形成情况图；B0d代表弯曲胁迫处理0天、B3d代表弯曲胁迫处理3天、B5d代表弯曲胁迫处理5天、B7d代表弯曲胁迫处理7天、B14d代表弯曲胁迫处理14天、B21d代表弯曲胁迫处理21天，双向箭头代表应拉木形成区域；
图3为本发明激光显微切割收集应拉木木质部细胞示意图；Bending 0d代表弯曲胁迫处理0天、Bending 3d代表弯曲胁迫处理3天、Bending 5d代表弯曲胁迫处理5天、Bending 7d代表弯曲胁迫处理7天、Bending 14d代表弯曲胁迫处理14天、Bending 21d代表弯曲胁迫处理21天，方框表示激光显微切割收集区域；
图4为本发明毛果杨PtrLBD4-3基因在不同弯曲处理时间RNA-Seq数据中读值，误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；
图5为本发明毛果杨PtrLBD4-3基因克隆电泳图；
图6为本发明构建毛果杨PtrLBD4-3基因植物表达载体电泳图；
图7为本发明获得的毛果杨PtrLBD4-3过量表达植株组培苗植株图；
图8为本发明温室中培养的毛果杨PtrLBD4-3过量表达植株及野生型植株图；L1、L2、L3、L6、L7、L14、L21分别为7个独立的株系，比例尺代表10cm；
图9为本发明在转录水平鉴定PtrLBD4-3过量表达植株图；L1、L2、L3、L6、L7、L14、L21分别为7个独立的株系；
图10为本发明温室生长60天和120天的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株图；L1、L2、L21分别为3个独立的株系，比例尺代表10cm；
图11为本发明温室生长60天的的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株的株高、茎节数量、地径图；L1、L2、L21分别为3个独立的株系，误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；
图12为本发明为本发明中温室生长120天的的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株的株高、茎节数量、地径图；L1、L2、L21分别为3个独立的株系，误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；
图13为本发明温室生长4个月的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株不同茎节的石蜡切片图；IN4代表第4茎节、IN6代表第6茎节、IN8代表第8茎节、IN10代表第10茎节，比例尺代表200μm；
图14为本发明温室生长4个月的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株20茎节的石蜡切片图；IN20代表第20茎节，比例尺代表200μm；
图15为本发明温室生长4个月的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株20茎节的扫描电镜图片，比例尺代表20μm；
图16为本发明温室生长4个月的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株20茎节弯曲处理7天的石蜡切片图；比例尺代表200μm；
图17为本发明温室生长4个月的毛果杨野生型及PtrLBD4-3过量表达植株20茎节弯曲处理21天的石蜡切片图；比例尺代表200μm。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下实施例中如无特别说明均为常规方法。所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞何质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.毛果杨应拉木形成不同时期木质部细胞的转录组分析
1.1实验方法
1.1.1弯曲胁迫处理
取生长状态一致18株4个月大的毛果杨温室苗，平均分成6组，分别为Bending 0d(弯曲处理0天)、Bending 3d(弯曲处理3天)、Bending 5d(弯曲处理5天)、Bending 7d(弯曲处理7天)、Bending 14d(弯曲处理14天)、Bending 21d(弯曲处理21天)。将除Bending 0d外的其他组植株土面以上50cm至90cm处的茎干进行人为弯曲处理(图1)。
1.1.2不同弯曲处理时间点应拉木形成的形态观察
分别在弯曲处理的第0天、3天、5天、7天、14天、21天收集茎干弯曲受力最大部位茎干进行石蜡切片，具体流程如下：
(1)将茎段切成2mm长的小段，浸于固定液中，4℃，固定12h；
(2)固定后用1×PBS进行清洗；
(3)分别用不同比例的酒精和二甲苯进行脱水，酒精、二甲苯比例分别为：75:25、50:50、25:75、0:100；
(4)然后进行浸蜡，二甲苯、石蜡体积比为75:25，60℃，6h；
(5)用纯石蜡进行过夜浸蜡2天；
(6)进行包埋处理，并用切片机进行切片，厚度为16μm；
(7)漂片并烘片；
(8)用二甲苯进行脱蜡；
(9)分别用番红和固绿进行染色；
(10)利用光学显微镜观察应拉木的形成并进行图片采集。
1.1.3激光显微切割收集不同时期应拉木木质部组织
将收集的不同弯曲处理天数的受力最大茎段，用冷冻切片机获得茎干横切面，经过酒精处理后利用激光显微切割技术(LCM)分别收集应拉木区域组织于RNeasy LysisBuffer(Qiagen)中。
1.1.4不同时期应拉木木质部组织的RNA-Seq分析
用Qiagen植物总RNA提取试剂盒对LCM收集的组织进行RNA提取，利用RNA 6000Pico Assay Chips及Agilent 2100Bioanalyzer平台对RNA品质及浓度进行检测。取质量良好的RNA利用Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit(Life Technologies)进行扩增，扩增后按照TruSeq RNA Sample Prep v2 LS Protocol方法构建文库，委托华大公司进行测序分析，获得不同弯曲胁迫天数的响应基因。
1.2结果与分析
1.2.1不同弯曲处理时间点应拉木形成的形态观察
通过对毛果杨茎干进行弯曲胁迫处理我们发现，弯曲胁迫处理会使树木木质部受拉力面产生应拉木(图2)。相比于正常木，应拉木中以纤维细胞为主，仅有少量的导管细胞。由于番红和固绿可以分别对木质素和纤维素进行着色，对比弯曲胁迫0天和其他胁迫天数的植株发现，应拉木区域固绿着色更加明显，番红着色较弱，说明应拉木区域纤维素较高、木质素含量较低。不同的弯曲处理时间毛果杨木质部产生的应拉木的宽度有所差异。随着弯曲处理时间的增长，应拉木的宽度有所增宽，并且应拉木区域木质化程度降低。
1.2.2激光显微切割收集不同时期应拉木木质部组织
利用激光显微切割的方式精确收集弯曲胁迫处理受力最大部位的应拉木木质部细胞(图3)，用于RNA-Seq分析，鉴定应拉木形成相关基因。
1.2.3不同时期应拉木木质部组织的RNA-Seq分析及PtrLBD4-3的鉴定
通过对不同弯曲处理时间的应拉木木质部细胞RNA-Seq分析发现，毛果杨PtrLBD4-3转录因子在正常植株木质部细胞中基本不表达，而在受弯曲胁迫处理的应拉木木质部细胞中的表达急剧增加，表明PtrLBD4-3响应应拉木的形成，可能调控木质部形成相关基因，影响应拉木形成(图4)。
2.毛果杨PtrLBD4-3转录因子的获得
2.1实验方法
2.1.1目的基因序列的获得
参照phytozome网站提供的毛果杨基因组序列信息，在目的基因序列两端设计引物如表1。
表1本实施例用于目的基因克隆的引物序列
Figure BDA0002687246280000061
利用Qiagen公司植物RNA提取试剂盒提取毛果杨(Populus trichocarpa)Nisqually-1基因型野生型植株总RNA，利用Taqman反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PtrLBD4-3基因的克隆，具体PCR扩增体系及运行程序下：
PCR扩增体系：
Figure BDA0002687246280000062
PCR运行程序：
Figure BDA0002687246280000063
2.1.2.目的基因连接pENTR载体并测序
对PCR获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳分离目的条带如图5。利用Qiagen公司的胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收，利用Invitrogen公司的pENTR/D-TOPE Cloning Kit将回收产物连接到pENTR载体中。取出TOP10感受态细胞于冰上解冻，将连接产物全部加入到感受态细胞中，混合均匀。42℃热激1分钟，置于冰上冰浴3分钟，加入无抗性的LB培养基，37℃、200rpm活化一个小时。低转速收集菌体，并将菌体涂布在固体LB培养基(含卡那霉素50mg/L)上，37℃过夜培养。
用载体测序引物进行单克隆的PCR检测，鉴定阳性克隆，具体引物序列见表2。
表2本发明用于阳性克隆PCR鉴定的引物序列
Figure BDA0002687246280000071
参照以下扩增体系及PCR运行程序进行阳性克隆鉴定：
扩增体系：
Figure BDA0002687246280000072
PCR运行程序：
Figure BDA0002687246280000073
电泳，确定阳性克隆，挑取阳性单克隆于5ml LB培养基中(卡那霉素，50mg/L)，220rpm，37℃，过夜培养。次日，保存菌种并离心收集菌体，进行质粒的提取，具体过程参照Qiagen质粒提取试剂盒说明书。测序，测序引物为M13-F，并根据测序实际情况进行加测。
2.2结果与分析
参照phytozome网站提供的毛果杨基因组序列信息利用PCR的方式我们在400bp-500bp之间获得了明显的目的条带(图5)。连接pENTR载体后进行测序，测序结果比对分析发现，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将该基因片段命名为PtrLBD4-3，由441bp个碱基组成。其编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质，共146个氨基酸。
3.毛果杨PtrLBD4-3过量表达及突变体植株的获得
3.1实验方法
3.1.1过量表达植物表达载体的构建
(1)克隆PtrLBD4-3完整CDS序列，结合植物表达载体pBI121多克隆位点，将基因两端添加合适的酶切位点，引物序列见表3。
表3本发明用于构建植物表达载体的引物序列
Figure BDA0002687246280000081
注：红色字体代表保护碱基序列；蓝色字体代表酶切位点序列；黑色字体基因序列。
(2)PCR扩增目的片段。
PCR扩增体系：
Figure BDA0002687246280000082
PCR运行程序：
Figure BDA0002687246280000083
Figure BDA0002687246280000091
(3)电泳分离目的条带，并胶回收目的条带。
(4)对回收的目的片段及载体pBI121进行双酶切。
酶切体系：
Figure BDA0002687246280000092
酶切条件：
37℃ 1小时
(5)酶切后进行电泳分离目的条带，并用Qiagen胶回收试剂盒回收目的条带；
先将目的基因装入植物表达载体pBI121中。
T4连接体系：
Figure BDA0002687246280000093
连接条件：
4℃过夜
(6)遗传转化大肠杆菌。
取出感受态细胞于冰上解冻，将连接产物全部加入到感受态细胞中，混合均匀。42℃热激1分钟，置于冰上冰浴3分钟，加入无抗性的LB培养基，37℃、200rpm活化一个小时。低转速收集菌体，并将菌体涂布在固体LB培养基(含卡那霉素50mg/L)上，37℃过夜培养。
(7)PCR鉴定单克隆。
用载体测序引物进行单克隆的PCR检测，引物序列见表4：
表4本发明用于植物表达载体构建单克隆检测引物序列
Figure BDA0002687246280000101
扩增体系：
Figure BDA0002687246280000102
沾取单克隆菌体
PCR运行程序：
Figure BDA0002687246280000103
(8)电泳，确定阳性克隆。
(9)挑取阳性单克隆于5ml LB培养基中(卡那霉素，50mg/L)，220rpm，37℃，过夜培养。
(10)次日，保存菌种并离心收集菌体，进行质粒的提取，具体过程参照Qiagen质粒提取试剂盒说明书。
(11)测序，测序引物为35SP1。
(12)测序结果比对分析。
3.1.2农杆菌介导的毛果杨遗传转化
(1)取含有植物表达载体的农杆菌菌种10μl，加入到5ml抗性LB(卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L)培养基中，28℃，220rpm，过夜培养。
(2)次日，取培养好的菌液100μl加入到50ml抗性LB液体培养基中(卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L)，28℃，220rpm，培养至OD600＝0.4，备用。
(3)取3-6个月大毛果杨温室苗幼嫩的茎段，在10％次氯酸钠中消毒20min。
(4)用无菌水充分清洗消毒后的外植体茎段。
(5)将茎段切成5mm左右的小段，放入到培养好的菌液中，侵染5分钟。
(6)捞出茎段，放在CIM1培养基上，黑暗培养2天。
(7)两天后，用无菌水充分清洗外植体茎段，并摆放在CIM2培养基上，黑暗培养，每2周更换培养基。
(8)CIM2培养基上黑暗培养2个月后，转至SIM1培养基上置于光下培养，一个月后转至SIM2培养基上，光下培养。
(9)长出抗性芽后，将抗性芽插入到生根培养基中诱导生根。
3.1.3过量表达及突变体植株的鉴定
(1)将抗性植株连同状态一致的野生型植株种入土中，培养至5个月大，收集抗性植株和野生型对照的次生木质部。
(2)进行RNA提取，具体步骤参照植物RNA提取试剂盒(Qiagen)说明书。
(3)获得的RNA用NanoDrop进行浓度、品质的测定。
(4)参考说明书用OligdT引物对已获得的RNA进行反转录，获得cDNA。
(5)将已获得的cDNA稀释10倍，进行RT-qPCR，内参为PtrActin 7，具体引物序列见表5。
表5本发明用于转基因植株鉴定的引物序列
Figure BDA0002687246280000111
定量PCR反应体系15μl：
Figure BDA0002687246280000112
Figure BDA0002687246280000121
(6)用2△△Ct法对定量结果进行计算。
3.2结果与分析
利用双酶切的方式，我们获得了含有PtrLBD4-3的植物表达载体，如图6。通过农杆菌介导的遗传转化的方式我们获得了几十个独立抗性株系，如图7。经过转录水平鉴定后，共获得了7个OE-PtrLBD4-3过量表达株系中PtrLBD4-3的转录水平相比于野生型植株都极显著上升，分别命名为L1、L2、L3、L6、L7、L14、L21(图8和图9)。
4.毛果杨PtrLBD4-3功能分析
4.1实验方法
4.1.1转基因植株生长指标观测
树高测量：分别在生长60天及120天时对野生型及过量表达PtrLBD4-3的转基因温室植株测量土面以上至顶芽的高度，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。
茎节数：分别在生长60天及120天时对野生型及过量表达PtrLBD4-3的转基因温室植株统计茎节数量，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。
地径测量：分别在生长60天及120天时对野生型植株及过量表达PtrLBD4-3的转基因温室植株用游标卡尺测量土面以上5cm处的直径，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。
4.1.2转基因植株木质部表型观察
收集4个月大毛果杨野生型及PtrLBD4-3的转基因温室植株第4、6、8、10、20茎节参照1.1.2进行石蜡切片在细胞水平观察表型。
同时，取4个月大的转基因植株及对应的同龄野生型对照植株的第20茎节，用徒手切片的方式将其切成薄片，通过导电胶黏贴在扫描电子显微镜的载物架上，用10mA电流强度喷金60s，放入到扫描电子显微镜中，在高真空条件下进行不同放大倍数的图片采集。
4.1.3转基因植株木材组分分析
(1)取6个月大小毛果杨温室植株野生型及PtrLBD4-3过表达植株茎干，去树皮，剪成6cm大小的茎段，使用丙酮浸泡萃取后置于通风橱中风干茎段。
(2)用粉碎机打碎茎段成粉状，过40目的筛网。
(3)用NaOH和硝基苯在175℃条件下水解木粉2.5h。
(4)待样品冷却使至室温用HCl中和NaOH。
(5)1000g，1min离心收集上清液。
(6)上清液经2μm滤膜过滤后用高效液相色仪对S、G、H型木质素进行分析定量。
4.1.4PtrLBD4-3的过量表达对植株应拉木形成的影响分析
参照1.1.1和1.1.2对温室培养4个月大野生型及PtrLBD4-3过表达植株的第20茎节进行弯曲胁迫处理，分为弯曲7天及弯曲21天两组，胁迫后进行石蜡切片观察应拉木的形成情况。
4.2结果分析
4.2.1转基因植株生长指标观测
通过对比观察温室培养的毛果杨野生型植株和PtrLBD4-3过表达植株发现，过量表达PtrLBD4-3后植株出现了明显的生长表型变化，如图10。相比野生型植株，转基因植株的生长明显迟缓，叶片较小，统计分析数据显示(图11和图12)，转基因植株的高度极显著降低、茎节数量明显增多、地径降低。说明PtrLBD4-3的过量表达造成了毛果杨植株生长发育的改变，PtrLBD4-3基因的过量表达改变了毛果杨生长发育模式。
4.2.2转基因植株木质部表型观察
鉴于初步的表型观察及生长指标的检测，PtrLBD4-3基因的过量表达改变了植株的正常生长。为了检测PtrLBD4-3基因是否在细胞水平上影响细胞形态结构我们对野生型及过量表达的转基因植株进行了石蜡切片并对切片进行番红固绿染色，其中番红和固绿可以分别对木质素和纤维素进行着色。结果如图13和图14，正常生长状态的转基因植株茎干木质部细胞表现出明显的应拉木特性，具有较多的纤维细胞、较少的导管细胞，并且转基因茎干番红着色程度较低，固绿着色程度较高，说明转基因植株木质素含量明显降低、纤维素含量较高。扫描电镜观察结果显示(图15)，转基因植株的细胞壁明显变薄，并且伴随明显的细胞壁塌陷现象。这一结果表明，PtrLBD4-3基因的过量表达改变了植物细胞壁木质素的沉积，影响细胞壁的结构。
4.2.3转基因植株木材组分分析
为了进一步检测PtrLBD4-3基因的过量表达对木质素沉积的影响，我们对6个月大的温室植株进行了木质素组分分析，结果见表6。相比于野生型植株，PtrLBD4-3过量表达转基因植株中S型和H型木质素含量明显降低、G型木质素含量明显升高，S/G比例也发生明显降低。这一结果进一步证明PtrLBD4-3基因对木质素的沉积具有一定的调控作用。
表6本发明中毛果杨野生型及PtrLBD4-3的过量表达植株木材组分分析
Figure BDA0002687246280000131
Figure BDA0002687246280000141
误差由至少三个生物学重复计算，星号代表t检验结果，*P<0.05，**P<0.01。
4.2.4PtrLBD4-3的过量表达对植株应拉木形成的影响分析
为了检测基因对PtrLBD4-3应拉木形成的影响，本实施例对温室生长的野生型及PtrLBD4-3过量表达植株进行弯曲胁迫处理(图16和图17)。结果表明，不论在弯曲胁迫处理第7天还是第21天，野生型植株茎干木质部受拉力面均产生了纤维细胞较多、导管细胞较少、木质素沉积减弱的应拉木组织，而PtrLBD4-3基因的过量表达植株在弯曲胁迫下依然保持正常生长状态下的细胞形态。产生这种现象的原因是正常状态下的野生型植株中PtrLBD4-3基因几乎不表达，弯曲胁迫的诱导PtrLBD4-3基因在木质部受拉力面的表达量增加，促进了受拉力面应拉木形成；而在PtrLBD4-3过量表达植株中，该基因一直处于高度表达状态，即使在正常直立生长状态下无需弯曲胁迫诱导也可以使应拉木形成，所以导致转基因植株在弯曲胁迫前后茎干木质部细胞水平无明显差异。这一结果更进一步说明PtrLBD4-3基因的上调促进应拉木形成，PtrLBD4-3基因在应拉木形成过程中具有一定功能。
以上实验中所用药品皆为市售产品。从上述实验中可知，PtrLBD4-3基因的表达受到人为弯曲胁迫高度诱导，在树木茎干应拉木木质部细胞中高度表达。为了进一步验证PtrLBD4-3基因在弯曲胁迫应拉木形成过程中的功能，通过农杆菌介导的遗传转化获了PtrLBD4-3过量表达转基因植株。通过一系列生长指标检测、细胞形态学观测、木质素组分检测、弯曲胁迫等实验证明了PtrLBD4-3基因影响植物的生长发育，通过改变木质素的沉积方式影响应拉木的形成。说明了毛果杨PtrLBD4-3基因在木本植物响应应拉木形成方面具有一定功能。
序列表
<110> 东北林业大学
<120>毛果杨PtrLBD4-3基因及其编码蛋白和应用
<160>2
<210>1
<211> 441
<212> DNA
<213> 毛果杨（Populus trichocarpa）。
<400> 1
atgaaggaga gcggtcgaaa acatggtgca ctttcgccat gcgcagcatg caagcttcta 60
agaagaagat gtgctcaaga ctgtgtgttt gctccttatt ttccagctga tgagcctcag 120
aagtttgcca gtgtgcacaa ggtctttggg gctagcaatg tcaacaaaat gttacaggaa 180
ttacctgagc accaacgaag agatgcagta agttccatgg tttatgaagc aaatgcaagg 240
gttcgtgacc cagtttatgg ttgtgttgga gccatatcat ctttgcagca acaaattaat 300
tctttacaaa cccaattagc agttgcacaa gctgaggtag tgcacatgag aatgcgggag 360
ttcacttctt cctctaatac aggagccatg gacatggcgg ttaatcagga caatatgggg 420
gagtctttgt ggtcatgcta g 441
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213>毛果杨（Populus trichocarpa）。
Met Lys Glu Ser Gly Arg Lys His Gly Ala Leu Ser Pro Cys Ala
5 10 15
Ala Cys Lys Leu Leu Arg Arg Arg Cys Ala Gln Asp Cys Val Phe
20 25 30
Ala Pro Tyr Phe Pro Ala Asp Glu Pro Gln Lys Phe Ala Ser Val
35 40 45
His Lys Val Phe Gly Ala Ser Asn Val Asn Lys Met Leu Gln Glu
50 55 60
Leu Pro Glu His Gln Arg Arg Asp Ala Val Ser Ser Met Val Tyr
65 70 75
Glu Ala Asn Ala Arg Val Arg Asp Pro Val Tyr Gly Cys Val Gly
80 85 90
Ala Ile Ser Ser Leu Gln Gln Gln Ile Asn Ser Leu Gln Thr Gln
95 100 105
Leu Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Val His Met Arg Met Arg Glu
110 105 110
Phe Thr Ser Ser Ser Asn Thr Gly Ala Met Asp Met Ala Val Asn
115 120 125
Gln Asp Asn Met Gly Glu Ser Leu Trp Ser Cys
130 135
<210>3
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> PtrLBD4-3-F。
<400> 3
CACCATGAAGGAGAGCGGTCGA 22
<210>4
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> PtrLBD4-3-R。
<400> 4
GCATGACCACAAAGACTCC 19
<210>5
<211>16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> M13-F。
<400> 5
GTAAAACGACGGCCAG 16
<210>6
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> M13-R。
<400> 6
CAGGAAACAGCTATGAC 17
<210>7
<211>28
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> PtrLBD4-3-F植物表达载体构建引物。
<400>7
CTAGTCTAGAATGAAGGAGAGCGGTCGA 28
<210>8
<211>28
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> PtrLBD4-3-R植物表达载体构建引物。
<400>8
CTAGGAGCTCCTAGCATGACCACAAAGA 28
<210>9
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 35SP1。
<400>9
CCCACTATCCTTCGCAAGAC 20
<210>10
<211>25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> NosT2。
<400>10
GCGGGACTCTAATCATAAAAACCCA 25
<210>11
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> RT-PtrActin 7-F。
<400>11
TGTTGCCCTTGACTATGAGCAGGA 24
<210>12
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> RT-PtrActin 7-R。
<400>12
ACGGAATCTCTCAGCTCCAATGGT 24
<210>13
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> RT-PtrLBD4-3-F。
<400>13
AGAGATGCAGTAAGTTCCATGGTT 24
<210>14
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> RT-PtrLBD4-3-F。
<400>14
TCCTGTATTAGAGGAAGAAGTGA 23

Claims (6)

1.毛果杨PtrLBD4-3基因，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.获取权利要求1所述的毛果杨PtrLBD4-3基因方法，其特征在于获取该基因的方式为：
1)提取毛果杨植株总RNA，并反转录获得cDNA；
2)以cDNA为模板，以PtrLBD4-3-F和PtrLBD4-3-R为引物，进行PCR扩增；
3)对PCR扩增进行电泳分析，并回收441bp处的目标片段，经测序成功后，即得毛果杨PtrLBD4-3基因片段；
其中PtrLBD4-3-F和PtrLBD4-3-R引物序列为：
PtrLBD4-3-F 5’-CACCATGAAGGAGAGCGGTCGA-3’
PtrLBD4-3-R 5’-GCATGACCACAAAGACTCC-3’。
3.根据权利要求2所述的毛果杨PtrLBD4-3基因获取方法，其特征在于PCR扩增的PCR体系如下：
Figure FDA0002687246270000011
PCR扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性45s，55℃退火30s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸30min，16℃保存。
4.如权利要求1所述的毛果杨PtrLBD4-3基因编码的蛋白，其特征在于编码该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
5.如权利要求1所述的毛果杨PtrLBD4-3基因应用，其特征在于它用于调控应拉木的形成。
6.根据权利要求5所述的毛果杨PtrLBD4-3基因应用，其特征在于它是通过PtrLBD4-3基因的过量表达使毛果杨在弯曲胁迫下促进应拉木形成。
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