CN112322636A

CN112322636A - 一种促进植物开花的AsFUL基因、蛋白质及其应用

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Publication number: CN112322636A
Application number: CN202011301856.4A
Authority: CN
Inventors: 徐启江; 黄云彤; 刘长莉; 杨琳琳; 贺洪军; 付泽元
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明公开了一种促进植物开花的AsFUL基因、蛋白质及其应用，属于植物基因工程领域。所述AsFUL基因具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；所述AsFUL蛋白质具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。本发明还公开了AsFUL基因、包含基因的载体及蛋白质在用于促进植物开花中的应用以及利用其促进植物开花的方法。利用本发明的AsFUL基因及其蛋白质，可以显著促进植物开花，在改善植物尤其是大蒜的有性繁殖上具有明显的理论研究与经济应用价值。

Description

一种促进植物开花的AsFUL基因、蛋白质及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地，涉及一种促进植物开花的AsFUL基因、蛋白质及其应用。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)为葱科(Alliaceae)葱属(Allium)草本蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培，具很高的食用价值和经济价值。但由于花败育，现有栽培品种只能进行无性繁殖，这一现状使得大蒜育种研究往往局限于自然突变或诱导突变、以及体细胞无性系选育等方面，成为开展大蒜遗传学研究及通过常规育种改良经济学性状的瓶颈。因此，恢复大蒜的有性生殖能力将便于其遗传性状的交流，从而通过传统的杂交育种方法来改良大蒜品种。此外，通过种子繁殖大蒜能够减少病虫害及病毒病的传播，并且大大降低了通过组织培养脱毒苗带来的人力、物力的消耗。

近年来，有关大蒜育性恢复的研究取得了显著的进展，通过对环境条件的控制已经实现了大蒜开花诱导和种子繁殖。不同基因型种质内自交及种质间杂交成为现实，推动了大蒜的遗传学研究和有性杂交育种。然而，关于大蒜成花诱导的分子机制还不甚了解。已知在拟南芥中，A功能基因具有促进植物开花的作用，若利用转基因技术将A功能基因转入大蒜植株，便能够强化大蒜花发育，使之在鳞茎膨大前完成生殖发育，避免因养分不足而造成的花败育。因此，针对大蒜A功能基因的研究对大蒜育性的恢复有着重要的意义。然而，目前相关研究的开展严重不足。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人意外地克隆到了大蒜的AsFUL基因(A功能基因)，并进一步对AsFUL这个基因的时空特异表达模式进行了分析。通过构建了AsFUL过表达载体，对拟南芥进行遗传转化，通过相应的分子鉴定及表型揭示了AsFUL基因在大蒜花发育中的功能，为诱导大蒜发育功能花、实现有性繁殖提供分子研究基础，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种促进植物开花的AsFUL基因，其具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。AsFUL基因属于单子叶A功能基因中的FUL-like进化系。

本发明第二方面提供一种促进植物开花的AsFUL蛋白，其由本发明第一方面所述AsFUL基因编成，其具有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。AsFUL蛋白质同其他MADS-box蛋白质一样，具有典型的MIKC型结构，包括MADS区、I区、K区和C区；蛋白质一级结构和二级结构表明，AsFUL蛋白质等电点大于7.0，为碱性蛋白质；其二级结构大多数由α螺旋和不规则卷曲组成，还含有少量的β转角；该蛋白质均为疏水性蛋白质，有利于维持蛋白质的三级结构。AsFUL蛋白质为FUL-like同源蛋白质组。

本发明的第三方面提供一种载体，其包括本发明第一方面所述的AsFUL基因。

在一些实施方案中，所述载体为植物表达载体。在一些优选的实施方案中，所述载体为改良的植物表达载体。

本发明第四方面提供本发明第一方面所述的AsFUL基因或本发明第三方面所述的载体在制备用于促进植物开花的试剂中的应用。

在一些实施方案中，将所述AsFUL基因或所述载体转入到植物体内以促进植物开花。

本发明第五方面提供一种促进植物开花的方法，在所述植物中提高AsFUL基因基因的表达量，以促进植物开花。

在一些实施方案中，在所述植物中提高AsFUL基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源AsFUL基因的表达，或在植物中过表达外源AsFUL基因。

在一些优选实施方案中，所述过表达外源AsFUL基因基因是指将所述AsFUL基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。

在一些优选实施方案中，所述AsFUL基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

在一些实施方案中，利用蘸花法侵染将所述AsFUL基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述AsFUL基因的表达。

再进一步地，所述组成型启动子是35S启动子。

在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。

在本发明中，所述植物是大蒜或拟南芥。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明通过在拟南芥中过表达AsFUL基因，可以促进拟南芥提前开花，表明该基因具有促进开花的作用，其在促进大蒜开花方面具有广阔的应用。

本发明的AsFUL基因为促进大蒜的有性繁殖提供了有利的基因资源。

利用本发明的AsFUL基因及其蛋白质，可以显著促进植物开花，在改善植物尤其是大蒜的有性繁殖上具有明显的理论研究与经济应用价值。。

附图说明

图1示出了大蒜试验材料(A：大蒜植株地上部器官；B：大蒜鳞茎；C-E：不同发育阶段的花蕾；L：叶；Ps：假茎；Sc：花茎；Bu：鳞茎；R：根；F1：第一发育期花蕾；F2：第二发育期花蕾；F3：第三发育期花蕾)。

图2示出了大蒜AsFUL蛋白质的氨基酸组成柱形图。

图3示出了使用SOPMA对大蒜AsFUL蛋白质质二级结构的预测结果。

图4示出了部分A功能MADS-box蛋白质的同源性结构分析。

图5示出了以邻位相连法构建的部分A功能MADS-box蛋白质系统进化树(注：用1000个重复进行bootstrap检验，置信度超过50％的在接点部位标出，比例尺表明树枝长度，AsFUL蛋白质用

标注。

图6示出了大蒜AsFUL基因半定量PCR结果。

图7示出了AsFUL在大蒜不同器官的表达量。

图8示出了BP(上)、LR(下)反应原理示意图。

图9示出了pH7WG2D质粒图谱。

图10示出了pDONR221质粒图谱。

图11示出了AsFUL基因农杆菌菌液PCR结果。

图12示出了转基因植株的抗生素筛选结果。

图13示出了转基因株系的PCR检测结果(F1：1号AsFUL基因过表达株系；F2：2号AsFUL基因过表达株系)。

图14示出了转基因株系的RT-PCR检测结果。

图15示出了野生型(左)与AsFUL过表达(右)植株生长状态。

图16示出了野生型与AsFUL过表达植株的花器官表型(WT：野生型拟南芥；OEAsFUL：AsFUL过表达植株；深灰色箭头表示花瓣转变为萼片部位；白色箭头表示生成的新一轮花蕾；Bar＝2mm)

图17示出了半定量RT-PCR检测野生型与转AsFUL过表达植株中AG基因的表达差异。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1大蒜AsFUL基因的克隆

1实验选材

本实施例以‘阿城紫皮’大蒜为材料，由哈尔滨长日圆葱研究所提供。鉴于种植前低温贮藏可以调控开花和育性恢复，将种用蒜瓣于4℃冷库中贮藏，四个月后，种植于东北林业大学花卉生物工程研究所的日光温室内。大蒜长至三叶期时用无菌刀片分别采集根、假茎(根以上、叶片以下部位)、幼叶；植株长出6～7片叶、鳞茎形成期采集保护叶、第一时期花蕾、两周后采集第二期花蕾、假茎包裹的花茎基部、大蒜完全抽薹后的第三期花蕾如图1所示，采集后迅速置于液氮中冷冻，–80℃冰箱保存，作为提取总RNA的材料。

2大蒜花蕾总RNA的提取及AsFUL基因的克隆

大蒜的AsFUL基因采用RACE方法进行克隆。

以TransZol Plant(TransGen公司)RNA提取试剂盒提取大蒜不同生长时期的花蕾总RNA，具体步骤按照试剂盒所提供的说明书进行。

RACE反应引物的设计：根据GenBank已登录的多种被子植物MADS-box基因的保守区核苷酸序列设计3′-RACE引物，将获得的3′-cDNA序列用Genedoc软件进行序列比对，选取其保守区域设计5'-RACE特异性引物AsFULGSP1、AsFULGSP2。通用5'-RACE锚定引物Anchor与接头引物Adaptor序列已知。由华大基因科技股份有限公司合成引物，引物表1如下所示：

表1 RACE反应引物

(注：R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G)

大蒜AsFUL基因3′-RACE片段的扩增：选取质量好的大蒜总RNA，按照

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转试剂盒说明书进行反转录反应。反转录过程中加上P19E接头，用于后续的3′-RACE。反转录生成的cDNA为模板，与AsFUL3′-RACE引物AD和通用引物P18E进行PCR扩增，反应结束后，将PCR产物用0.8％变性琼脂糖凝胶在120V恒定电压下电泳，将扩增产物进行分离，经凝胶成像系统成像和观察后，确定目的条带。

大蒜AsFUL基因5′-RACE片段的扩增：选取质量好的大蒜总RNA，用Super ScriptTMⅢReverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA第一链，使用High Pure PCRProduct Purification Kit(罗氏公司)对5′-RACE反转录产物进行纯化，操作步骤按照试剂盒所带说明书进行。之后使用Terminal Deoxynucletidy1 Transferase(TdT)Kit(TaKaRa公司)对纯化后的cDNA进行5′端加尾反应。再进行5′-RACE巢式PCR反应，包括5′Outer PCR反应和5′Inner PCR反应，将扩增产物用0.8％变性琼脂糖凝胶以120V的恒定电压进行电泳分离，经凝胶成像系统成像与观察，鉴定目的条带的扩增。使用E.Z.N.A.TMGelExtraction Kit(OMEGA公司)试剂盒对PCR产物进行回收纯化，具体操作步骤按照试剂盒中说明书进行。将纯化后的目的DNA片段与pEASY-T5载体进行连接反应，最后进行阳性克隆的筛选及鉴定，菌液送于华大基因公司测序。

实验结果：将测序结果中的序列使用NCBI的GenBank数据库BLAST同源序列，并使用GenDoc比对分析差异。AsFUL基因全长如下所示：

该基因序列全长为993bp，起始密码子和终止密码子均用方框内粗体字母表示。

实施例2大蒜AsFUL基因的序列特征与系统进化分析

1大蒜AsFUL基因的序列特征分析

应用生物信息学软件对大蒜AsFUL基因进行序列特征分析和蛋白质功能预测，为后续构建基因功能突变体及遗传转化实验来验证基因功能提供理论依据。

2 AsFUL基因的序列分析与结构预测

将大蒜AsFUL基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列分别在NCBI(NationalCenter for Biological Information)网站的核苷酸数据库和蛋白数据库中进行blastn(nucleotide query vs.nucleotide database)和blastp(protein query vs.proteindatabase)分析；使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线分析软件分析基因的开放阅读框并推导其氨基酸序列，将推导得到的氨基酸序列提交到NCBI的保守结构域(CDD)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进行保守结构域的预测。

使用Bioedit软件和ExPASy网站提供的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析软件分析预测AsFUL蛋白质的一级结构；使用ProtParam tool(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)在线分析软件预测蛋白质的分子量、等电点及每种氨基酸所占的比例；使用ExPASy网站提供的SOPMA在线分析软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)对AsFUL蛋白质的二级结构进行预测；使用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)在线分析软件对蛋白质进行亚细胞定位预测；使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析软件进行蛋白质的信号肽分析；使用TMPRED在线分析软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测蛋白质的跨膜结构域。

AsFUL基因的序列分析与结构预测结果：AsFUL基因的cDNA序列全长为993bp，其中编码区(CDS)序列长726bp，5'端非翻译区(5'UTR)长36bp，3'端非翻译区(3'UTR)长231bp，3'末端PolyA尾长17个腺苷酸。根据其编码区推测出多肽链由241个氨基酸组成，编码的蛋白质含有58个氨基酸的MADS结构域、32个氨基酸的I结构域、85个氨基酸的K结构域、66个氨基酸的C结构域。具体下述序列

MGRGRVQLKRIENKINRQVTFSKRRNGLMKKAHEISVLCDAEVALIVFSSKGKLYEYSTDSSMEKILERYERYCFAKKSFTMSDTDCQGDWSLEYHKLNAKVESLNKSQRHLMGEQLESLSLREIGQLEQQLESSLKNVRSRKSQELLSSISELQEKEKTLRDENKALENELMEKSREKAILQQQAQWKHQERQDKLRNPNISIGNYQTRNNEEEAEPATNVQVRVVKNLLPPWTIRNFNG(SEQ ID NO.9)。

序列分析结果显示，AsFUL基因的开放阅读框(ORF)编码241个氨基酸；AsFUL蛋白质同其他MADS-box蛋白质一样，具有典型的MIKC型结构，包括MADS区、I区、K区和C区；蛋白质一级结构和二级结构的预测分析表明，AsFUL蛋白质等电点大于7.0，为碱性蛋白；其二级结构大多数由α螺旋和不规则卷曲组成，还含有少量的β转角；该蛋白质均为疏水性蛋白质，有利于维持蛋白质的三级结构，其蛋白质一级预测、二级预测结果如图2、图3所示。系统进化分析结果显示，AsFUL蛋白质被归为FUL-like同源蛋白质组，AsFUL基因属于A功能基因中的FUL-like进化系，其氨基酸序列同源性分析图及系统进化分析图如图4、图5所示。

实施例3大蒜AsFUL基因的表达分析

为了分析大蒜AsFUL基因在大蒜不同器官中的空间表达特异性，发明人以大蒜根、假茎、嫩叶、初期花蕾(F1)、中期花蕾(F2)、后期花蕾(F3)、鳞茎、花茎的总RNA为模板，进行基因特异性的半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测。

1实验材料

以东北林业大学生命科学学院花卉生物工程研究所温室栽培大蒜为实验材料，用无RNase的镊子和刀片分别采集大蒜各组织器官，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。

2实验试剂和仪器

TransZol Plant试剂盒购自全式金(TiansGen)公司；氯仿；异丙醇；RNase-freeddH2O；75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)；RNA上样缓冲液。Ex Taq和实时定量所用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司；半定量RT-PCR所用反转录试剂盒购自TOYOBO东洋纺(上海)生物科技有限公司；实时定量PCR所用

Green PCR Master Mix、

Optical96-Well Reaction Plate with Barcode及Optical Adhesive Films均购自ABI公司；实时定量反应使用ABI7500荧光定量PCR仪进行。

3半定量RT-PCR分析基因表达特性

半定量RT-PCR引物的设计：根据获得的大蒜AsFUL基因的3'端非翻译区，利用在线引物设计软件IDT(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index)设计半定量RT-PCR和实时定量PCR用引物，引物见表2。

表2大蒜半定量RT-PCR和实时定量PCR所用引物

大蒜不同器官RNA的提取和浓度的调整：使用TransZol Plant试剂盒分别提取大蒜的根、假茎、嫩叶、F1、F2、F3、鳞茎和花茎的RNA(操作方法同1.2)，变性琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的质量，使用Nano drop分光光度计测量各RNA样品的浓度，然后以所有样本中最小浓度的样品为标准，将各个样品的浓度调为一致，并使用变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。本实施例中所用RNA终浓度为0.35μg/μL。

半定量模板cDNA的合成：选取大蒜不同器官0.35μg的RNA为模板，使用oligodT作为随机引物，反转录合成半定量RT-PCR所用cDNA模板。

大蒜AsFUL基因的半定量PCR检测：以18SrRNA基因为内参，以大蒜不同器官cDNA为模板，使用半定量引物进行PCR扩增来探究大蒜不同器官中AsFUL、基因表达模式的差异，之后进行PCR扩增。

4实时定量PCR分析基因表达特性

实时定量PCR引物的设计：实时定量PCR的引物设计同RT-PCR引物设计，如表2中所示。

大蒜不同器官RNA的提取和浓度的调整：分别提取大蒜各器官的RNA，具体操作方法与实施例1相同。变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量，使用Nano drop分光光度计测量RNA浓度，记录数值，以0.5μg/μL作为标准，将所有器官RNA浓度调成一致，调整一致后用变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。

实时定量PCR模板cDNA的合成：选取大蒜不同器官0.5μg的RNA作为模板，以RTPrimer Mix作为随机引物，反转录合成实时定量PCR所用cDNA模板，体系见表3、表4。

A.基因组DNA的去除。

表3基因组DNA去除体系

反应条件：42℃，2min。

B.反转录反应

表4 qRT-PCR反转录体系

按照以下程序进行反转录反应：37℃，15min；85℃，5s；10℃，∞。

大蒜AsFUL基因的实时定量PCR检测：分别取大蒜不同器官反转录产物cDNA，各加200μL无RNase的ddH₂O，吹弹混匀后各取8.4μL稀释后的cDNA作为模板，使用实时定量PCR引物和ABI 7500PCR仪进行PCR扩增，体系见表5。本实验采用SYBR GREEN染料法，分别设置3组生物学重复和3组实验重复以减小误差。

表5实时定量PCR扩增体系

按照以下反应程序进行PCR扩增：

第一阶段：50℃2min；

第二阶段：95℃10min；

第三阶段：95℃15s，60℃1min，40个循环；

第四阶段：95℃15s，60℃1min，95℃15s。

在第三阶段，第二步(60℃，1min)处收集荧光信号。

5大蒜AsFUL基因的表达分析结果

大蒜AsFUL基因半定量PCR结果与分析：结果如图6所示：AsFUL主要集中在花器官中表达，在F1、F2、F3三个时期的花蕾中均能检测到较强的信号。此外，在嫩叶中也有一定程度的表达，但在其他的营养器官，如根、假茎、鳞茎以及花茎中不表达或表达量极低。

大蒜AsFUL基因实时定量PCR结果与分析：为进一步分析探究这AsFUL基因在大蒜不同器官生长发育过程中的时空表达特异性，本实施例对大蒜不同器官采用SYBR GREEN染料法进行了实时定量PCR(Real-time PCR)检测，应用三次生物学重复、三次实验重复来减小误差，实验数据的分析采用2^-△△ct法。并且在实时定量PCR基因扩增完成后，从溶解曲线图中可以看到18SrRNA、AsFUL基因仅有一个单一的峰，其余地方基本没有杂峰，也就是说基因的扩增是相对特异的，并且在半定量实验中几乎未检测到污染或引物二聚体及假阳性等现象，实时定量PCR结果可以说明大蒜AsFUL基因在大蒜不同器官的时空表达特异性。

实时定量PCR结果如图7所示：AsFUL基因在大蒜花器官中高丰度表达，尤其在后期花蕾F3中表达量最高，同时，在嫩叶和假茎中也有低水平的表达，而在根、鳞茎、花茎等其它营养器官中则几乎不表达。

实施例4 AsFUL基因过表达载体的构建

通过对AsFUL基因进行序列结构分析和系统进化分析，推测AsFUL基因对植物开花具有促进作用。因此，为进一步验证AsFUL基因的功能，本实施例构建了AsFUL基因的过表达载体，分别转染拟南芥和大蒜，通过对转基因植株进行相应的分子鉴定及表型观察，以确定AsFUL基因的功能。

利用Gateway技术构建载体，以λ噬菌体位点特异性重组系统attB×attP→attL×attR为基础，两端具有重组位点的DNA片段或目的基因可以非常容易地被重组到含同源重组位点的载体上，仅需要BP和LR两个反应就可以完成相应表达载体的构建。

BP反应通过attB目的基因DNA片段与attP供体载体之间的重组反应，创建目的基因入门载体(entry vector)；LR反应通过attL入门载体与目的载体之间的置换，将目的基因连接到表达载体，如图8所示

1实验材料

农杆菌介导法转染拟南芥的受体为野生型拟南芥(Columbia)。

2实验试剂

BP反应试剂盒、LR反应试剂盒购自Thermo公司；纤维素酯微孔滤膜购自北京全式金(TransGene)公司；配制LB培养基的各种试剂均购自Oxoid公司；卡那霉素(Kanamycin)、利福霉素(Rifamycin)、潮霉素(Hygromycin)购自Sigma公司；壮观霉素(Spectinomycin)购自上海生工；质粒小提取试剂盒购自大连宝生物工程公司；2％的CTAB提取液(2％w/vCTAB，10mmol/L Tris-HCl，25nm/L EDTA，2.0mmol/L NaCl)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚等均为国产分析纯；其余试剂同实施例2。农杆菌LBA4404、pRK2013(helper)大肠杆菌植物以及表达载体pH7WG2D,1和pDONR221载体的质粒图谱分别如图9、图10所示；实验中所用引物及序列测定均由哈尔滨博士生物公司完成。

3 Getway技术构建AsFUL的过表达载体

利用attB-Gene-F/R进行目的基因PCR：以全长菌液作为模板，取10μL菌液加90μLddH₂O稀释，混匀后100℃变性5min，冰上放置2.5min。分别以attB-AsFUL-F/R引物进行AsFUL基因的PCR反应，引物序列见表6，进行PCR反应。

表6载体构建所用引物

利用attB-adapter-F/R进行目二次PCR加载接头：以第一次PCR产物为模板，根据条带的亮度，以无菌水稀释50倍后作为模板进行第二次PCR反应，将产物进行电泳检测并回收，于-40℃冰箱中保存备用。

BP反应：将以下成分加入到

无菌EP管中轻弹混匀，体系如表7所示。。

表7 BP反应体系

将混合液酒精浴25℃，4h；加入1μL蛋白激酶K，37℃温浴10min，终止反应。

加入50μL刚刚解冻的感受态细胞(top10)，冰浴30min。酒精浴42℃热激1min，冰上放置2.5min。于灭菌后的无菌操作台内加入500μL的LB液体培养基，置于振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养1h。4000rpm，离心1min，用移液枪吸除300μL上清液，将剩余液体吸打混匀后涂布于含有Kana抗性的LB固体培养基上，恒温培养箱内37℃倒置培养16h。无菌条件下，用10μL无菌枪头挑取过夜培养的单个菌落至含有4mL LB液体培养基和4μL Kana(50mg/mL)抗生素的10mL的无菌管中，于振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养16h。进行菌液PCR，阴性对照组只加上游引物。挑取3个菌液进行测序。

将测序后基因序列准确无误的菌液用天根质粒小提试剂盒进行质粒提取，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

LR反应(体系如表8所示)：将以下成分加入到无菌EP管中并轻弹混匀。

表8 LR反应体系

将混合液酒精浴25℃，2h。加入1μL蛋白激酶K，37温浴10min，终止反应。放置冰上加入50μL刚刚解冻的TOP10感受态细胞，冰浴30min。酒精浴42℃，1min，冰上放置2.5min。于无菌操作台内加入500μL LB液体培养基，振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养1h。4000rpm，离心1min，吸取200μL上清液弃掉，将剩余菌液混匀后涂布于含有壮观霉素(Spe)抗性的LB固体培养基上，置于恒温培养箱内37℃倒置培养16h。无菌条件下，用10μL无菌枪头挑取过夜培养的单个菌落放入含有4mL LB液体培养基和4μL Spe抗生素的10mL无菌管中，振荡培养箱内37℃、200rpm振荡培养16h。进行菌液PCR，阴性对照组只加上游引物。挑取3个菌液进行测序。

4重组质粒三亲杂交法转入农杆菌

(1)将3种菌液：LBA4404，含有目的质粒的大肠杆菌菌液，pRK2013(helper菌各自用LB活化，具体体系见表9。

表9菌液与LB对应体系

(2)无菌条件下，将3种活化好的菌液各吸取50μL至5mL EP管中，用移液枪吸打混匀，用镊子将灭菌后的纤维素酯微孔滤膜滤膜平铺在无抗性LB固体培养基上，吸取50μL混合菌液滴在滤膜上，用封口膜密封后置于28℃恒温培养箱中培养24h。(3)无菌条件下将滤膜用镊子夹取放入含有Rif和Spe的双抗LB中，28℃，180rpm摇菌至橙黄色，OD600≈0.8。(4)将上述菌液使用三级划线法，用接菌环划线于含有Rif和Spe的LB固体培养基上，28℃精静止培养24h。(5)挑取单克隆，置于含有Rif和Spe双抗的LB液体培养基中，28℃，180rpm培养至菌液橙黄色，OD600≈0.8。(6)菌液PCR，筛选将目的质粒成功转入农杆菌的菌液进行测序，保存菌液。

通过以上步骤，本发明运用Gateway技术成功地构建了大蒜AsFUL基因的过表达载体，然后利用三亲杂交法将PH7WG2D,1-AsFUL质粒转入农杆菌LBA4404中。菌液PCR结果如图11，有呈阳性的条带。

5农杆菌介导的拟南芥遗传转化

拟南芥的培养及移栽：

(1)实验准备：将配置好的MS固体培养基平板、无菌水、75％的酒精溶液、3％的次氯酸钠溶液、移液枪、枪头以及5mL EP管等，放入超净工作台中紫外灭菌30min。

(2)拟南芥种子的消毒与萌发：将拟南芥种子装入EP管中，用无菌水清洗3次，每次1min，期间不断颠倒EP管。将水吸出后，加入75％的酒精洗涤5min，将酒精吸出，再次用无菌水清洗3次。加入3％的次氯酸钠洗涤3min，之后用无菌水冲洗5次，将残留的次氯酸钠溶液冲洗干净。然后用1mL移液枪吸取种子悬浮液打在MS固体培养基上，用枪头将种子均匀铺开，用封口膜进行密封。放到4℃冰箱中春化3-5天后，置于光照培养箱(16h光照/8h黑暗，22℃)中培养7-10天，待长至2-3片叶时进行移苗。

(3)移栽拟南芥：种植拟南芥的土和蛭石需进行121℃高压灭菌20min，防止生虫。将土与蛭石按照1:2的比例混合，用水浸湿后方可进行移苗。移苗时去掉培养皿的封口膜，用镊子小心地夹住幼苗的子叶或下胚轴，将根放到土中并轻轻按压。移苗结束后，在幼苗上面覆盖一层保鲜膜，待移栽小苗成活后，长出4片真叶时，即可去掉保鲜膜增强光照。

(4)拟南芥长出初生花序时，可以剪掉，以促进侧生花序的生长及开花，以便于后续的转化。

蘸花法转染拟南芥：

(1)侵染前准备：将转化成功的农杆菌菌液在含有Rif和Spe双抗性的LB固体培养基中进行划线活化24h，然后挑取单克隆，用同样添加了Rif和Spe双抗的LB液体在28℃、180rpm条件下摇菌，菌液浓度达到OD600为0.6时停止摇菌。

(2)配制侵染缓冲液：在100mL水中加入5g蔗糖，100μL 50μM/mL的乙酰丁香酮，20μL SWILTT 777，涡旋振荡。

(3)收集菌体：将摇好的菌液于4000rmp离心15分钟，去掉上清液。将菌体用配好的缓冲液稀释到OD600为0.8，此为侵染液。

(4)侵染：侵染前需剪掉拟南芥植株中已长成的角果，然后将侵染液倒在大塑料培养皿中，将拟南芥横放，把所有花浸没于侵染液中，1min后取出。用200微升的移液器吸取侵染液，滴在位置较低，没有侵染上的花苞上。轻轻将多余水分拍干，用保鲜膜包裹起来放于暗室中培养24h，后置于正常光照条件下培养，一般3天左右侵染一次，共侵染3次。

(5)待角果自然开裂后可以收集种子，此时种子为T0代。

转基因植株的筛选：

(1)将侵染的拟南芥植株的T0代种子收集至离心管中，并放入干燥剂使其保持干燥。

(2)种子的处理：对种子进行消毒处理，然后将种子均匀地播种到含有潮霉素(Hyg)的选择培养基上(筛选浓度为20mg/L)，步骤同“拟南芥的培养及移栽”。能够正常生长并呈现绿色的即可能为转基因植株，生长出的幼苗即为T1代植株。

(3)将T1代植株和野生型植株同时移到土中培养，并注意观察表型的变化。

(4)将T1代种子播种于含有20mg/L潮霉素的MS培养基中培养，出苗后转入土中培养，收获T2代种子。将T2代种子继续播种于20mg/L潮霉素的MS培养基中培养，选择近3:1分离群体的抗性植株，种植收获T3代。若T3代种子在选择培养基中全部具有抗性，则对应的T3代种子全部为纯合体。

转基因植株的抗生素筛选结果：

将消毒后的转基因拟南芥T0代种子播种于含有潮霉素(Hyg 20mg/L)的MS培养基中培养12d后观察生长情况，发现转基因植株的根长明显短于野生型植株(图12)，其生长活力较弱，可能与潮霉素的抑制作用有关。将转基因幼苗从筛选培养基中挑出，移入土壤中生长。继续收集T1代种子，用同样的条件筛选，得到T2代种子，将T2代种子继续筛选后种植，得到T3代纯合体植株。

转基因植株的分子鉴定：本发明用CTAB法提取拟南芥基因组DNA并利用PCR及RT-PCR技术对T1代转基因植株进行检测，以此判断外源基因是否整合到其染色体上。PCR检测结果和RT-PCR检测结果显示阳性，PCR结果显示，所检测的2个株系中外源基因均得到表达。RT-PCR检测结果表明外源基因确实已经转入到拟南芥基因组DNA中，并且在转录水平得到表达，如图13、图14所示。

转基因拟南芥相关下游开花基因的表达：分别提取野生型植株和过表达植株花的RNA，利用半定量RT-PCR以野生型植株为对照，分别检测AsFUL基因过表达植株中相关下游开花基因(FT、SOC1、LFY、AG)的表达差异，解析AsFUL基因对开花时间的调控。下游基因引物序列如表10所示。

表10下游开花基因的半定量RT-PCR引物序列

转基因植株表型变化的观察结果：经PCR及RT-PCR检测，能够确定外源基因已整合到拟南芥中，与此同时，转基因植株在花器官形态、开花时间等方面均出现了不同程度的变化。

转AsFUL拟南芥的表型变化：

(1)开花时间显著提前，如图15所示，转AsFUL拟南芥的开花时间早于野生型植株约7d，其开花时仅具有5～6片莲座叶，而此时的野生型植株则正处于旺盛的营养生长期。因此，AsFUL基因能够缩短植物的营养生长期，促进生殖生长，进而促进植物提早开花。

(2)花器官形态的变化：野生型拟南芥的花器官由四轮基本的花器官组成，由外向内分别为花萼、4枚对生的花瓣、6枚雄蕊以及1枚雌蕊(图16-A)，而转AsFUL拟南芥的花器官则表现出严重的“畸形”。由图16-B中可以看到，转AsFUL拟南芥的花瓣部分缺失转换为了花萼，并且在花器官中央产生了新一轮的花蕾，出现了“花中花”现象。

除此之外，还有少量的花出现了含有5枚花瓣的花器官形态(图16-C)。有研究表明，在植物中突变掉C类基因AG时，会使植物花器官出现花瓣增多的现象，而根据花发育“ABC模型”，A类基因与C类基因相互抑制，因此，有可能当A类基因AsFUL过表达时而抑制了C类基因AG的表达从而引起花瓣数目增多。为验证这一猜测，本实施例利用半定量RT-PCR分别检测了野生型和转AsFUL植株中AG基因的表达含量，检测结果图17所示：转基因植株中AG基因的表达量要明显低于野生型植株，由此表明，拟南芥“五瓣花”的出现与AsFUL基因过表达削弱了拟南芥AG基因的表达有关。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种促进植物开花的AsFUL基因、蛋白质及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactcgagtg cacatcgttt tttttttttt tttt 34

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactcgagtg cacatcg 17

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

arctcacygt sctytgygay gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccataagat gcctttgact 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tattcaaggc tccagtctcc 20

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 8

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttttttttt tttttttttg aaaaaataaa ataaaaatgg gaagaggaag agtacaactg 60

aaaagaatag agaacaagat taataggcaa gtgaccttct ctaagagaag aaacggtttg 120

atgaaaaaag ctcacgagat ttctgttctt tgtgatgccg aagttgccct cattgttttc 180

tcttctaaag ggaagctcta tgaatattcc actgattcaa gtatggagaa aattctggag 240

aggtatgaac gttattgctt cgcaaaaaaa tcattcacaa tgagtgacac cgactgtcag 300

ggagactgga gccttgaata tcataaactg aacgctaagg ttgagagttt aaataaaagt 360

caaaggcatc ttatgggaga acagcttgaa tccttgagtc tcagagaaat tggacagctt 420

gaacaacaac ttgaaagttc cctcaaaaat gttcgttcac gcaagagcca agaattgtta 480

agctcaattt cagagcttca ggaaaaggag aaaaccttgc gagacgagaa caaagctcta 540

gaaaacgagc ttatggagaa gtccagggag aaagctattc tgcaacaaca agcacaatgg 600

aagcatcagg aacgacaaga taagcttcgt aatccaaata tcagcattgg aaattatcaa 660

acaaggaaca atgaggaaga agctgaacca gcaacaaatg ttcaagttcg tgttgtcaag 720

aatttgttgc ctccatggac gattcgcaat ttcaatggtt aggtatgcac ttattataca 780

tggaaagctt tgatgatcag taaaaatatg tgagtcaaaa atcatagcaa ttatagtgtt 840

atgtaaataa aacttgctac gttcccatgc aaaagtttat tgggaatgac tttctaatgt 900

aatttgtaag gtataaatgg acttctggct tggtgtattt ttcaataatt gtttatctca 960

aggaaatgtt cttcgtaaaa aaaaaaaaaa aaa 993

<210> 9

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Met Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Met Glu

50 55 60

Lys Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Cys Phe Ala Lys Lys Ser Phe

65 70 75 80

Thr Met Ser Asp Thr Asp Cys Gln Gly Asp Trp Ser Leu Glu Tyr His

85 90 95

Lys Leu Asn Ala Lys Val Glu Ser Leu Asn Lys Ser Gln Arg His Leu

100 105 110

Met Gly Glu Gln Leu Glu Ser Leu Ser Leu Arg Glu Ile Gly Gln Leu

115 120 125

Glu Gln Gln Leu Glu Ser Ser Leu Lys Asn Val Arg Ser Arg Lys Ser

130 135 140

Gln Glu Leu Leu Ser Ser Ile Ser Glu Leu Gln Glu Lys Glu Lys Thr

145 150 155 160

Leu Arg Asp Glu Asn Lys Ala Leu Glu Asn Glu Leu Met Glu Lys Ser

165 170 175

Arg Glu Lys Ala Ile Leu Gln Gln Gln Ala Gln Trp Lys His Gln Glu

180 185 190

Arg Gln Asp Lys Leu Arg Asn Pro Asn Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Gln

195 200 205

Thr Arg Asn Asn Glu Glu Glu Ala Glu Pro Ala Thr Asn Val Gln Val

210 215 220

Arg Val Val Lys Asn Leu Leu Pro Pro Trp Thr Ile Arg Asn Phe Asn

225 230 235 240

Gly

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gactcaaatc atgttagaga cattcaa 27

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtacggccac tggcataga 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcaaaggca tcttatggga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttctcgtct cgcaaggttt 20

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaaagcagg ctaaaatggg aagaggaaga gt 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agaaagctgg gtaccaagcc agaagtccat tt 32

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcagagttg ttggagacgt tc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggcatcatc accgttcgtt ac 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgcaacaagc agacaagtga ct 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgggctactc tcttcatcac ctc 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaagatagc ggagttaggt tttac 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cgctcctgat ttcttcgcgt acctg 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctgaaaatg agaggaacaa tccga 25

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgccgcgac ttggaaataa 20

Claims

1.一种促进植物开花的AsFUL基因，其特征在于，其具有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。

2.一种促进植物开花的AsFUL蛋白质，其特征在于，其具有SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列。

3.一种载体，其特征在于，包括权利要求1所述的AsFUL基因。

4.权利要求1所述的AsFUL基因或权利要求3所述的载体在制备用于促进植物开花的试剂中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述AsFUL基因或所述载体转入到植物体内以促进植物开花。

6.一种促进植物开花的方法，其特征在于，在所述植物中提高AsFUL基因基因的表达量，以促进植物开花。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在所述植物中提高AsFUL基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源AsFUL基因的表达，或在植物中过表达外源AsFUL基因。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述过表达外源AsFUL基因基因是指将所述AsFUL基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述AsFUL基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述AsFUL基因的表达。