CN113293158A - 一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，通过RACE技术进行AsSVP基因的克隆，并对该基因进行生物信息学分析以及该基因在不同器官中RT‑PCR和RT‑qPCR的分析，并用所获得的基因构建过表达载体进行异源拟南芥遗传转化来验证其基因功能。svp突变体显示性状为开花时间延后，说明AsSVP基因具有抑制开花的功能。由于AsSVP具有抑制开花的功能，后续实验可以通过构建RNAi干涉载体或Cas9载体去除抑制开花效果，促进大蒜开花，培育新品种，在创新大蒜新种质上具有明显的经济价值。

Description

一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，即一种在大蒜中鉴定的AsSVP基因，该基因为开花抑制因子，并参与调控花器官的形态建成。
背景技术
大蒜(Allium sativumL.)为葱科(Alliaceae)葱属(Allium)草本蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培，具很高的食用价值和经济价值。但由于花败育，现有栽培品种只能进行无性繁殖，这一现状使得大蒜育种研究往往局限于自然突变或诱导突变、以及体细胞无性系选育等方面(Dhooghe et al 2010,Shemesh Mayer et al 2013)，成为开展大蒜遗传学研究及通过常规育种改良经济学性状的瓶颈。因此，恢复大蒜的有性生殖能力将便于其遗传性状的交流，从而通过传统的杂交育种方法来改良大蒜品种。此外，通过种子繁殖大蒜能够减少病虫害及病毒病的传播，并且大大降低了通过组织培养脱毒苗带来的人力、物力的消耗。
近年来，有关大蒜育性恢复的研究取得了显著的进展，通过对环境条件的控制已经实现了大蒜开花诱导和种子繁殖(Kamenetsky et al 2005)。不同基因型种质内自交及种质间杂交成为现实，推动了大蒜的遗传学研究和有性杂交育种。然而，关于大蒜成花诱导的分子机制还不甚了解(Neta et al 2011,Shemesh et al 2008)。
发明内容
本发明是针对上述大蒜繁殖过程中的问题，通过在模式植物拟南芥中过表达AsSVP基因，并发现svp突变体显示性状为开花时间延后，说明AsSVP基因具有抑制开花的功能。并参与调控花器官的形态建成，从而为实现大蒜的有性繁殖提供新的分子生物学研究基础和新思路。
本发明实现如下：
应用RACE方法获得了包含完整开放阅读框的AsSVP基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明，其cDNA序列、氨基酸序列如序列表1(SEQ ID NO:1)、序列表2所示(SEQ ID NO:2)。
应用RACE技术获得大蒜AsSVP基因的全长cDNA序列，包含完整的开放阅读框，长度为657bp，生物信息学分析结果显示AsSVP基因的开放阅读框编码218个氨基酸，其氨基酸序列具有典型的MIKC型结构，包括MADS区、I区、K区和C区，AsSVP属于SVP/StMADS11-like进化系。
本发明克隆的大蒜基因命名为AsSVP，包括该基因的cDNA序列,与该序列具有90％以上的同源性的序列及编码相同功能蛋白质的DNA序列，均属本发明的保护范围。
RT-PCR和RT-qPCR分析结果表明，AsSVP在花器官中表达量较低，在营养器官根、假茎、嫩叶中却高丰度表达，在蒜皮和蒜薹中中度表达。
本发明通过构建AsSVP基因的过表达载体，并采用蘸花法侵染野生型拟南芥，经PCR、RT-PCR等分子检测显示，外源基因已成功导入拟南芥基因组DNA中，并在转录水平得到表达。本发明通过对转基因株系的鉴定，获得的纯合转基因拟南芥植株均属本发明的保护范围。
本发明通过在拟南芥中过表达AsSVP基因，发现svp突变体显示性状为开花时间延后，说明AsSVP基因具有抑制开花的功能。其在大蒜开花方面的应用均属本发明的保护范围。
有益效果
通过RACE技术进行AsSVP基因的克隆，并对该基因进行生物信息学分析以及该基因在不同器官中RT-PCR和RT-qPCR的分析，并用所获得的基因构建过表达载体进行异源拟南芥遗传转化来验证其基因功能。svp突变体显示性状为开花时间延后，说明AsSVP基因具有抑制开花的功能。由于AsSVP具有抑制开花的功能，后续实验可以通过构建RNAi干涉载体或Cas9载体去除抑制开花效果，促进大蒜开花，培育新品种，在创新大蒜新种质上具有明显的经济价值。
SVP作为开花途径的抑制因子具有抑制开花的作用，若干涉掉植株中的SVP基因，便能够强化大蒜花发育，使之在鳞茎膨大前完成生殖发育，避免因养分不足而造成的花败育。因此，针对SVP基因的研究对大蒜育性的恢复有着重要的意义。本发明克隆了大蒜的AsSVP基因，并对AsSVP基因的时空特异表达模式进行了分析。构建AsSVP过表达载体，遗传转化拟南芥，通过相应的分子鉴定及表型观察来揭示AsSVP基因在大蒜花发育中的功能，为诱导大蒜发育功能花、实现有性繁殖提供分子研究基础。
附图说明
SEQ ID NO:1：克隆的AsSVP全长基因测序结果
SEQ ID NO:2：大蒜AsSVP cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列(注：起始和终止密码子用红色加粗字体表示，M、I、K、C结构域分别用单、双、波浪和虚线标记。左右两侧的数字分别标注核苷酸及氨基酸位置。)
图1：大蒜试验材料(A：大蒜植株地上部器官；B：大蒜鳞茎；C-E：不同发育阶段的花蕾；L：叶；Ps：假茎；Sc：花茎；Bu：鳞茎；R：根；F1：第一发育期花蕾；F2：第二发育期花蕾；F3：第三发育期花蕾)
图2：大蒜AsSVP氨基酸组成柱形图
图3：使用SOPMA对大蒜AsSVP蛋白质二级结构的预测结果
图4：部分SVP同源基因的氨基酸序列同源性分析结果。MADS、K结构域以及SVP基序、AGL24基序、StMADS11基序用方框标出。用于序列比对的AsSVP基因氨基酸序列用红色星号标示
图5：以NJ法构建的部分被子植物SVP蛋白系统进化树(注：用1000个重复进行bootstrap检验，置信度超过50％的在接点部位标出，比例尺表明树枝长，度，AsSVP蛋白用“▲”标注。
图6：大蒜AsSVP基因RT-PCR结果
图7：大蒜AsSVP基因RT-qPCR结果
图8：BP(上)、LR(下)反应原理示意图
图9：pH7WG2D质粒图谱
图10：pDONR221质粒图
图11：AsSVP基因BP反应菌液PCR结果
图12：AsSVP基因LR反应菌液PCR结果
图13：AsSVP基因农杆菌菌液PCR结果
图14：转基因植株的抗生素筛选结果
图15：野生型与AsSVP过表达植株的生长状态，A、B、C、D分别表示野生型(左)与AsSVP过表达(右)植株在34天、40天、46天、60天时的生长状态。
图16：野生型与AsSVP过表达植株的莲座叶、茎生叶及分枝数；WT：野生型植株；OE：AsSVP过表达植株。
图17：野生型与AsSVP过表达植株的花器官形态；WT：野生型拟南芥；OEAsSVP：AsSVP过表达植株；Bar＝2mm。
图18：野生型与AsSVP过表达植株中下游开花基因的表达差异。
本实验发明的具体实施方式
以下描述为具体实施方式，包括整个试验过程，通过详细的试验过程介绍，本领域的相关研究人员可以明确本发明的基本特征，并且可以在不改变本发明的精神和原则上，适当对本发明进行修改，从而适应和提高在大蒜有性繁殖相关的用途。
1.大蒜AsSVP基因的克隆
1.1实验选材
本研究以‘阿城紫皮’大蒜为试材，由哈尔滨长日圆葱研究所提供。鉴于种植前低温贮藏可以调控开花和育性恢复，将种用蒜瓣于4℃冷库中贮藏，四个月后，种植于东北林业大学花卉生物工程研究所的日光温室内。大蒜长至三叶期时用无菌刀片分别采集根、假茎(根以上、叶片以下部位)、幼叶；植株长出6～7片叶、鳞茎形成期采集保护叶、第一时期花蕾、两周后采集第二期花蕾、假茎包裹的花茎基部、大蒜完全抽薹后的第三期花蕾如图1所示，采集后迅速置于液氮中冷冻，–80℃冰箱保存，作为提取总RNA的材料。
1.2大蒜花蕾总RNA的提取及AsSVP基因的克隆
本发明大蒜的AsSVP基因采用RACE方法进行克隆。
以TransZol Plant(TransGen公司)RNA提取试剂盒提取大蒜不同生长时期的花蕾总RNA，具体步骤按照试剂盒所提供的说明书进行。
RACE反应引物的设计：根据GenBank已登录的多种被子植物MADS-box基因的保守区核苷酸序列设计3′-RACE引物，将获得的3′-cDNA序列用Genedoc软件进行序列比对，选取其保守区域设计5'-RACE特异性引物AsSVP GSP1、AsSVP GSP2。通用5'-RACE锚定引物Anchor与接头引物Adaptor序列已知。由华大基因科技股份有限公司合成引物，引物表1如下所示：
表1 RACE反应引物
Figure BDA0002754851000000041
(注：R＝A/G，Y＝C/T，S＝C/G)
大蒜AsSVP基因3′-RACE片段的扩增：选取质量好的大蒜总RNA，按照
Figure BDA0002754851000000043
Figure BDA0002754851000000042
One-Step gDNARemoval and cDNASynthesis SuperMix反转试剂盒说明书进行反转录反应。反转录过程中加上P19E接头，用于后续的3′-RACE。反转录生成的cDNA为模板，与3′-RACE引物AD和通用引物P18E进行PCR扩增，反应结束后，将PCR产物用0.8％变性琼脂糖凝胶在120V恒定电压下电泳，将扩增产物进行分离，经凝胶成像系统成像和观察后，确定目的条带。
大蒜AsSVP基因5′-RACE片段的扩增：选取质量好的大蒜总RNA，用Super ScriptTMⅢReverse Transcriptase试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA第一链，使用High Pure PCRProductPurification Kit(罗氏公司)对5′-RACE反转录产物进行纯化，操作步骤按照试剂盒所带说明书进行。之后使用Terminal Deoxynucletidy1 Transferase(TdT)Kit(TaKaRa公司)对纯化后的cDNA进行5′端加尾反应。再进行5′-RACE巢式PCR反应，包括5′Outer PCR反应和5′InnerPCR反应，将扩增产物用0.8％变性琼脂糖凝胶以120V的恒定电压进行电泳分离，经凝胶成像系统成像与观察，鉴定目的条带的扩增。使用E.Z.N.A.TMGel ExtractionKit(OMEGA公司)试剂盒对PCR产物进行回收纯化，具体操作步骤按照试剂盒中说明书进行。将纯化后的目的DNA片段与pEASY-T5载体进行连接反应，最后进行阳性克隆的筛选及鉴定，菌液送于华大基因公司测序。
实验结果：将测序结果中的序列使用NCBI的GeneBank数据库BLAST同源序列，并使用GeneDoc比对分析差异。AsSVP基因全长如序列表1((SEQ ID NO:1)所示，该基因序列全长为720bp，起始密码子和终止密码子均用粗体表示。
2大蒜AsSVP基因的序列特征与系统进化分析
2.1大蒜AsSVP基因的序列特征分析
应用生物信息学软件对大蒜AsSVP基因进行序列特征分析和蛋白质功能预测，为后续构建基因功能突变体及遗传转化试验来验证基因功能提供理论依据。
2.2AsSVP基因的序列分析与结构预测
将大蒜AsSVP基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列分别在NCBI(NationalCenter for Biological Information)网站的核苷酸数据库和蛋白数据库中进行blastn(nucleotide query vs.nucleotide database)和blastp(protein query vs.proteindatabase)分析；使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线分析软件分析基因的开放阅读框并推导其氨基酸序列，将推导得到的氨基酸序列提交到NCBI的保守结构域(CDD)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进行保守结构域的预测。
使用Bioedit软件和ExPASy网站提供的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析软件分析预测AsSVP蛋白质的一级结构；使用ProtParam tool(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)在线分析软件预测蛋白质的分子量、等电点及每种氨基酸所占的比例；使用ExPASy网站提供的SOPMA在线分析软件(https:// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)对AsSVP蛋白质的二级结构进行预测；使用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)在线分析软件对蛋白质进行亚细胞定位预测；使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析软件进行蛋白质的信号肽分析；使用TMPRED在线分析软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测蛋白质的跨膜结构域。
AsSVP基因的序列分析与结构预测结果：AsSVP基因cDNA全长1022bp，开放阅读框长657bp，5’-端非翻译区为84bp，3’-端非翻译区为281bp，poly(A)尾长19个腺苷酸。依据cDNA序列推测的多肽由218个氨基酸组成，编码的蛋白质含有57个氨基酸的MADS结构域、34个氨基酸的I结构域、65个氨基酸的K结构域、62个氨基酸的C结构域。使用Bioedit和ExPASy网站提供的ProtParam预测AsSVP基因编码的蛋白质一级结构的结果为：AsSVP蛋白质的分子式可能为C1069H1783N303O344S10，分子量24.71KDa。对AsSVP氨基酸组成(表2)的分析(图2)结果显示，大蒜AsSVP肽链的正电荷残基总数(Arg+Lys)为33，负电荷残基总数(Asp+Glu)为35，理论等电点(pI)为5.9(>7)，推测AsSVP为酸性蛋白质。
结合DNASTAR软件和在线软件SOPMA预测AsSVP蛋白的二级结构，得到如下的结果(图3)，预测大概有53.21％的蛋白质二级结构为α螺旋，6.88％为β转角，26.15％为不规则卷曲，余下13.76％为延伸链。使用在线分析软件PSORT对其AsSVP蛋白质亚细胞定位进行预测，其结果为65.2％定位于细胞核，21.7％定位于线粒体，13％定位于细胞质。
表2 AsSVP氨基酸的组成分析
Figure BDA0002754851000000061
3大蒜AsSVP基因的表达分析
为了分析大蒜AsSVP基因在大蒜不同器官中的空间表达特异性，以大蒜根、假茎、嫩叶、初期花蕾(F1)、中期花蕾(F2)、后期花蕾(F3)、鳞茎、花茎的总RNA为模板，进行基因特异性的RT-PCR和RT-qPCR检测。
3.1试验材料
以东北林业大学生命科学学院花卉生物工程研究所温室栽培大蒜为实验材料，用无RNase的镊子和刀片分别采集大蒜各组织器官，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用。
3.2试验试剂和仪器
TransZol Plant试剂盒购自全式金(TiansGen)公司；氯仿；异丙醇；RNase-freeddH2O；75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)；RNA上样缓冲液。Ex Taq和实时定量所用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司；半定量RT-PCR所用反转录试剂盒购自TOYOBO东洋纺(上海)生物科技有限公司；实时定量PCR所用
Figure BDA0002754851000000072
Green PCR Master Mix、
Figure BDA0002754851000000073
Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode及OpticalAdhesive Films均购自ABI公司；实时定量反应使用ABI7500荧光定量PCR仪进行。
3.3半定量RT-PCR分析基因表达特性
半定量RT-PCR引物的设计：根据获得的大蒜AsSVP基因的3'端非翻译区，利用在线引物设计软件IDT(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index)设计半定量RT-PCR和实时定量PCR用引物，引物见表3。
表3大蒜半定量RT-PCR和实时定量PCR所用引物
Figure BDA0002754851000000071
大蒜不同器官RNA的提取和浓度的调整：使用TransZol Plant试剂盒分别提取大蒜的根、假茎、嫩叶、F1、F2、F3、鳞茎和花茎的RNA(操作方法同1.2)，变性琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的质量，使用Nano drop分光光度计测量各RNA样品的浓度，然后以所有样本中最小浓度的样品为标准，将各个样品的浓度调为一致，并使用变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。本研究中所用RNA终浓度为0.35μg/μL。
半定量模板cDNA的合成：选取大蒜不同器官0.35μg的RNA为模板，使用oligodT作为随机引物，反转录合成半定量RT-PCR所用cDNA模板。
大蒜AsSVP基因的半定量PCR检测：以18SrRNA基因为内参，以大蒜不同器官cDNA为模板，使用半定量引物进行PCR扩增来探究大蒜不同器官中AsSVP基因表达模式的差异，之后进行PCR扩增。
3.4实时定量PCR分析基因表达特性
实时定量PCR引物的设计：实时定量PCR的引物设计同RT-PCR引物设计相同如表2中所示。
大蒜不同器官RNA的提取和浓度的调整：分别提取大蒜各器官的RNA，具体操作方法与1.2相同。变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量，使用Nano drop分光光度计测量RNA浓度，记录数值，以0.5μg/μl作为标准，将所有器官RNA浓度调成一致，调整一致后用变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。
实时定量PCR模板cDNA的合成：选取大蒜不同器官0.5μg的RNA作为模板，以RTPrimer Mix作为随机引物，反转录合成实时定量PCR所用cDNA模板。基因组DNA的去除体系见表4；qRT-PCR反转录体系见表5。
表4基因组DNA去除体系
Figure BDA0002754851000000081
反应条件：42℃，2min。
表5 qRT-PCR反转录体系
Figure BDA0002754851000000082
按照以下程序进行反转录反应：37℃，15min；85℃，5s；10℃，∞。
大蒜AsSVP基因的实时定量PCR检测：分别取大蒜不同器官反转录产物cDNA，各加200μL无RNase的ddH2O，吹弹混匀后各取8.4μl稀释后的cDNA作为模板，使用实时定量PCR引物和ABI7500PCR仪进行PCR扩增，体系见表6。本实验采用SYBR GREEN染料法，分别设置3组生物学重复和3组试验重复以减小误差。
表6实时定量PCR扩增体系
Figure BDA0002754851000000083
Figure BDA0002754851000000091
按照以下反应程序进行PCR扩增：
Figure BDA0002754851000000092
在Stage3，Step2(60℃，1min)处收集荧光信号。
3.5大蒜AsSVP基因的表达分析结果
大蒜AsSVP基因半定量PCR结果与分析：结果如图6所示：AsSVP主要在营养器官中表达，在根、假茎、嫩叶中均能检测到较强的信号，其中在假茎中的表达量最高，在鳞茎和花茎未检测到信号，在生殖器官花中，仅在早期花蕾F1中具有较高的表达量，而中期花蕾F2和后期花蕾F3中表达信号较弱。
为进一步探究这AsSVP基因在大蒜不同器官生长发育过程中的时空表达特异性，本研究对大蒜不同器官采用SYBR GREEN染料法进行了实时定量PCR(Real-time PCR)检测，应用三次生物学重复、三次实验重复来减小误差，试验数据的分析采用2一△△ct法。并且在实时定量PCR基因扩增完成后，从溶解曲线图中可以看到18SrRNA、AsSVP基因仅有一个单一的峰，其余地方基本没有杂峰，也就是说基因的扩增是相对特异的，并且在半定量实验中几乎未检测到污染或引物二聚体及假阳性等现象，综上所述本实验实时定量PCR结果可以说明大蒜AsSVP基因在大蒜不同器官的时空表达特异性。
实时定量PCR结果如图7所示：AsSVP基因主要在营养器官根、茎、叶中表达，其余器官AsSVP基因表达量的递增顺序为鳞茎<F2<F3<花茎<F1。
4 AsSVP基因过表达载体的构建
通过对AsSVP基因进行序列结构分析和系统进化分析，推测AsSVP基因对植物开花具有抑制作用。因此，为进一步验证AsSVP基因的功能，本研究构建了AsSVP基因的过表达载体，分别转染拟南芥和大蒜，通过对转基因植株进行相应的分子鉴定及表型观察，以确定AsSVP基因的功能。
利用Gateway技术构建载体，以λ噬菌体位点特异性重组系统attB×attP→attL×attR为基础，两端具有重组位点的DNA片段或目的基因可以非常容易地被重组到含同源重组位点的载体上，仅需要BP和LR两个反应就可以完成相应表达载体的构建。
BP反应通过attB目的基因DNA片段与attP供体载体之间的重组反应，创建目的基因入门载体(entryvector)；LR反应通过attL入门载体与目的载体之间的置换，将目的基因连接到表达载体，如图8所示。
4.1试验材料
农杆菌介导法转染拟南芥的受体为野生型拟南芥(Columbia)，由本实验室保存。
4.2试验试剂
BP反应试剂盒、LR反应试剂盒购自Thermo公司；纤维素酯微孔滤膜购自北京全式金(TransGene)公司；配制LB培养基的各种试剂均购自Oxoid公司；卡那霉素(Kanamycin)、利福霉素(Rifamycin)、潮霉素(Hygromycin)购自Sigma公司；壮观霉素(Spectinomycin)购自上海生工；质粒小提取试剂盒购自大连宝生物工程公司；2％的CTAB提取液(2％w/vCTAB，10mmol/L Tris-HCl，25nm/LEDTA，2.0mmol/LNaCl)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、β-巯基乙醇、Tris-饱和酚等均为国产分析纯。农杆菌LBA4404、pRK2013(helper)大肠杆菌植物以及表达载体pH7WG2D(图9)和pDONR221(图10)载体均由课题组提供；试验中所用引物及序列测定均由哈尔滨博士生物公司完成。
4.3 Getway技术构建AsSVP的过表达载体
利用attB-Gene-F/R进行目的基因PCR：以全长菌液作为模板，取10μL菌液加90μLddH2O稀释，混匀后100℃变性5min，冰上放置2.5min。分别以attB-AsSVP-F/R引物进行AsSVP基因的PCR反应，引物序列见表7，进行PCR反应。
表7载体构建所用引物
Figure BDA0002754851000000101
利用attB-adapter-F/R进行目二次PCR加载接头：以第一次PCR产物为模板，根据条带的亮度，以无菌水稀释50倍后作为模板进行第二次PCR反应，将产物进行电泳检测并回收，于-40℃冰箱中保存备用。
BP反应(表8)：将以下成分加入到无菌EP管中轻弹混匀。
表8 BP反应体系
Figure BDA0002754851000000111
将混合液酒精浴25℃，4h；加入1μL蛋白激酶K，37℃温浴10min，终止反应。
加入50μL刚刚解冻的感受态细胞(top10)，冰浴30min。酒精浴42℃热激1min，冰上放置2.5min。于灭菌后的无菌操作台内加入500μL的LB液体培养基，置于振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养1h。4000rpm，离心1min，用移液枪吸除300μL上清液，将剩余液体吸打混匀后涂布于含有Kana抗性的LB固体培养基上，恒温培养箱内37℃倒置培养16h。无菌条件下，用10μL无菌枪头挑取过夜培养的单个菌落至含有4mL LB液体培养基和4μL Kana(50mg/mL)抗生素的10mL的无菌管中，于振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养16h。进行菌液PCR。PCR体系同表5-2，阴性对照组只加上游引物。挑取3个菌液进行测序。
将测序后基因序列准确无误的菌液用天根质粒小提试剂盒进行质粒提取，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
LR反应(表9)：将以下成分加入到无菌EP管中并轻弹混匀。
表9 LR反应体系
Figure BDA0002754851000000112
将混合液酒精浴25℃，2h。加入1μL蛋白激酶K，37温浴10min，终止反应。放置冰上加入50μL刚刚解冻的TOP10感受态细胞，冰浴30min。酒精浴42℃，1min，冰上放置2.5min。于无菌操作台内加入500μL LB液体培养基，振荡培养箱内200rpm、37℃振荡培养1h。4000rpm，离心1min，吸取200μL上清液弃掉，将剩余菌液混匀后涂布于含有壮观霉素(Spe)抗性的LB固体培养基上，置于恒温培养箱内37℃倒置培养16h。无菌条件下，用10μL无菌枪头挑取过夜培养的单个菌落放入含有4mL LB液体培养基和4μL Spe抗生素的10mL无菌管中，振荡培养箱内37℃、200rpm振荡培养16h。进行菌液PCR。PCR体系同表6，阴性对照组只加上游引物。挑取3个菌液进行测序。
4.4重组质粒三亲杂交法转入农杆菌
(1)将3种菌液：LBA4404，含有目的质粒的大肠杆菌菌液，pRK2013(helper菌各自用LB活化，具体体系见表10。
表10菌液与LB对应体系
Figure BDA0002754851000000121
(2)无菌条件下，将3种活化好的菌液各吸取50μL至5mL EP管中，用移液枪吸打混匀，用镊子将灭菌后的纤维素酯微孔滤膜滤膜平铺在无抗性LB固体培养基上，吸取50μL混合菌液滴在滤膜上，用封口膜密封后置于28℃恒温培养箱中培养24h。
(3)无菌条件下将滤膜用镊子夹取放入含有Rif和Spe的双抗LB中，28℃，180rpm摇菌至橙黄色，OD600≈0.8。
(4)将上述菌液使用三级划线法，用接菌环划线于含有Rif和Spe的LB固体培养基上，28℃精静止培养24h。
(5)挑取单克隆，置于含有Rif和Spe双抗的LB液体培养基中，28℃，180rpm培养至菌液橙黄色，OD600≈0.8。
(6)菌液PCR，筛选将目的质粒成功转入农杆菌的菌液进行测序，保存菌液。
通过以上步骤，本发明运用Gateway技术成功地构建了大蒜AsSVP基因的过表达载体，然后利用三亲杂交法将PH7WG2D,1-AsSVP质粒转入农杆菌LBA4404中。菌液PCR结果如图11，有呈阳性的条带。
4.5农杆菌介导的拟南芥遗传转化
拟南芥的培养及移栽：(1)实验准备：将配置好的MS固体培养基平板、无菌水、75％的酒精溶液、3％的次氯酸钠溶液、移液枪、枪头以及5mL EP管等，放入超净工作台中紫外灭菌30min。(2)拟南芥种子的消毒与萌发：将拟南芥种子装入EP管中，用无菌水清洗3次，每次1min，期间不断颠倒EP管。将水吸出后，加入75％的酒精洗涤5min，将酒精吸出，再次用无菌水清洗3次。加入3％的次氯酸钠洗涤3min，之后用无菌水冲洗5次，将残留的次氯酸钠溶液冲洗干净。然后用1mL移液枪吸取种子悬浮液打在MS固体培养基上，用枪头将种子均匀铺开，用封口膜进行密封。放到4℃冰箱中春化3-5天后，置于光照培养箱(16h光照/8h黑暗，22℃)中培养7～10天，待长至2～3片叶时进行移苗。(3)移栽拟南芥：种植拟南芥的土和蛭石需进行121℃高压灭菌20min，防止生虫。将土与蛭石按照1:2的比例混合，用水浸湿后方可进行移苗。移苗时去掉培养皿的封口膜，用镊子小心地夹住幼苗的子叶或下胚轴，将根放到土中并轻轻按压。移苗结束后，在幼苗上面覆盖一层保鲜膜，待移栽小苗成活后，长出4片真叶时，即可去掉保鲜膜增强光照。(4)拟南芥长出初生花序时，可以剪掉，以促进侧生花序的生长及开花，以便于后续的转化。
蘸花法转染拟南芥：(1)侵染前准备：将转化成功的农杆菌菌液在含有Rif和Spe双抗性的LB固体培养基中进行划线活化24h，然后挑取单克隆，用同样添加了Rif和Spe双抗的LB液体在28℃、180rpm条件下摇菌，菌液浓度达到OD600为0.6时停止摇菌。(2)配制侵染缓冲液：在100mL水中加入5g蔗糖，100μL 50μM/mL的乙酰丁香酮，20μL SWILTT 777，涡旋振荡。(3)收集菌体：将摇好的菌液于4000rmp离心15分钟，去掉上清液。将菌体用配好的缓冲液稀释到OD600为0.8，此为侵染液。(4)侵染：侵染前需剪掉拟南芥植株中已长成的角果，然后将侵染液倒在大塑料培养皿中，将拟南芥横放，把所有花浸没于侵染液中，1min后取出。用200微升的移液器吸取侵染液，滴在位置较低，没有侵染上的花苞上。轻轻将多余水分拍干，用保鲜膜包裹起来放于暗室中培养24h，后置于正常光照条件下培养，一般3天左右侵染一次，共侵染3次。(5)待角果自然开裂后可以收集种子，此时种子为T0代。
转基因植株的筛选：(1)将侵染的拟南芥植株的T0代种子收集至离心管中，并放入干燥剂使其保持干燥。(2)种子的处理：对种子进行消毒处理，然后将种子均匀地播种到含有潮霉素(Hyg)的选择培养基上(筛选浓度为20mg/L)，步骤同“拟南芥的培养及移栽”。能够正常生长并呈现绿色的即可能为转基因植株，生长出的幼苗即为T1代植株。(3)将T1代植株和野生型植株同时移到土中培养，并注意观察表型的变化。(4)将T1代种子播种于含有20mg/L潮霉素的MS培养基中培养，出苗后转入土中培养，收获T2代种子。将T2代种子继续播种于20mg/L潮霉素的MS培养基中培养，选择近3:1分离群体的抗性植株，种植收获T3代。若T3代种子在选择培养基中全部具有抗性，则对应的T3代种子全部为纯合体。
转基因植株的抗生素筛选结果：将消毒后的转基因拟南芥T0代种子播种于含有潮霉素(Hyg 20mg/L)的MS培养基中培养12d后观察生长情况，发现转基因植株的根长明显短于野生型植株(图12)，其生长活力较弱，可能与潮霉素的抑制作用有关。将转基因幼苗从筛选培养基中挑出，移入土壤中生长。继续收集T1代种子，用同样的条件筛选，得到T2代种子，将T2代种子继续筛选后种植，得到T3代纯合体植株。
转基因植株的分子鉴定：本发明用CTAB法提取拟南芥基因组DNA并利用PCR及RT-PCR技术对T1代转基因植株进行检测，以此判断外源基因是否整合到其染色体上。PCR检测结果和RT-PCR检测结果显示阳性，PCR结果显示，所检测的2个株系中外源基因均得到表达。RT-PCR检测结果表明外源基因确实已经转入到拟南芥基因组DNA中，并且在转录水平得到表达，如图14、15所示。
转基因拟南芥相关下游开花基因的表达：分别提取野生型植株和过表达植株花的RNA，利用半定量RT-PCR以野生型植株为对照，分别检测AsSVP基因过表达植株中相关下游开花基因(FT、SOC1、LFY)的表达差异，解析AsSVP基因对开花时间的调控。下游基因引物序列如表11所示。
表11下游开花基因的半定量RT-PCR引物序列
Figure BDA0002754851000000141
转基因植株表型变化的观察结果：经PCR及RT-PCR检测，能够确定外源基因已整合到拟南芥中，与此同时，转基因植株在花器官形态、开花时间等方面均出现了不同程度的变化。
开花时间显著延迟。如图15所示，同等条件下生长的野生型和转AsSVP拟南芥在开花时间上表现出了明显的差异。在生长至34d时，野生型植株的第一朵花完全开放，而此时的转基因植株中仍处于营养生长期，未现花蕾(图15-A)；生长至40d时，野生型植株形成部分侧枝，部分花朵凋败结实，而转基因植株则刚刚出现花蕾(图15-B)；生长至46d时，野生型植株部分种子成熟脱落，侧枝生长旺盛，形成较多的次生花序，而此时的转基因植株的第一朵花完全开放(图15-C)；生长至60d时，野生型植株的绝大部分种子已成熟，并表现出叶片泛黄等衰老症状，而转基因植株此时进入生长的旺盛期，形成较多的花序分枝(图15-D)。转基因植株的开花时间晚于野生型约12d。由此可见，AsSVP能够延长植物的营养生长期，从而延迟植物开花时间。
为进一步解析AsSVP基因的功能，本研究比较了野生型和转AsSVP植株的叶片数目及分枝数目，如图16所示，转基因植株的莲座叶、茎生叶及分枝数均比野生型拟南芥多，表明AsSVP基因除了能够抑制开花还具有促进植物分枝及叶片生长的功能。
野生型与AsSVP过表达植株在花器官形态上并未发现明显的不同(图17)，AsSVP基因主要的功能在于促进分枝及叶片的生长等方面，而不能改变花器官的形态。
此外，在拟南芥开花途径中，SVP受自主途径等多个开花路径调控，并可以调节开花途径整合子FLOWERING LOCUS T(FT)，SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSIONOF CONSTANS1(SOC1)、LEAFY(LFY)的表达，从而调控抽薹开花时间。因此，本研究利用半定量RT-PCR分别检测了野生型和转AsSVP拟南芥中这些下游开花基因的表达。如图18所示，转基因植株与野生型植株相比，下游开花基因FT、SOC1、LFY的表达量均为下降的，进一步表明了AsSVP基因为开花抑制因子。
SEQ ID NO:1
>AsSVP full-length cDNA Sequence
GAGAAGCAACAAATAATAATATTATTGCAGCCAATCATCGACAAAGATAAACAATCAACGATCTACTGGGGTTTGTGCCAAAAGAATGGCCAGGGAGAAGATAAAGATAAGAAAGATAGACAATGTTACTGCAAGACAAGTAACTTTTTCTAAGAGGAGGAGAGGGTTATTTAAGAAAGCCGATGAATTGTCAATACTTTGTGATGCTGAAGTTGGACTTATTATCTTTTCTGCCACTGGCAAACTCTTTGAATTTTCTAGTTCAAGAAGTTTGAAGGATATAATTGAGAAGCATGAAATGCATTCTAAGAAAATAGTGAGGTCGGAGCAGCCAATGCTTGATTTGAATCTTGAGAGTAGCAACATTACAAGATTGAACGAACAAATTGTGGAGATAAGCAAACAGTTGAGAAATATGAGAGGTGATGATCTTCAGGGTCTTACCATAGAAGAGCTTCAAAATCTAGAGAAGACGCTTGAAACCGGATTAACTCGTGTTTTGGAAAAGAAGGGTGAACAAATCATGGAACAAATCGGTGGTCTTCAGAAGAAGGGATTCGAACTAATGGAAGAAAATATAAGATTGAAACAACAGGTTTTGGAGATGACAATGTTAGGGAAGGGTGCATATGAAGAAGGTCAGTCTTCTGAATCAGTAACTAACATGTCCCAAATAAGTGCACCACCGGACTATGATGAAAGCTCAGATACATCTCTCAAATTGGGTTTGCCAGGGAATTGACTGCTGAATATGTAAGTAGAAAGCTGTCTTCAAGAAGTTTATTATACAGTATATTTTATCCAACACATGAATTTGTATGATAATATCCATGTGTCACAATATGTATTTTATGATGAGCGCAATGAATCTCATCTTGTCAATGTGACATGTATAATCAGTTAAAAATGCCCCTCCTTTTATGTTAGGAGACAAATTTCTTGTATCCCTATGTTAATTAACAGAACATTTCAAGAAATTAAACTGCTATTATTATTGTTGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:2
Figure BDA0002754851000000161

Claims (7)

1.一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，其特征在于：包括以下步骤：
A)材料准备：待大蒜初抽薹，用无菌刀片采集花芽、根、假茎、幼叶、蒜皮、蒜薹，液氮冰冻后，分别保存于-80℃冰箱，作为提取总RNA的植物材料；
B)AsSVP基因克隆：
b1)总RNA提取：利用Trizol法提取大蒜花芽总RNA；
b2)cDNA合成：以高质量RNA为模板反转录cDNA；
b3)基因引物：用18E，AD，AP3，038，041为引物进行3’RACE克隆MADS-box基因cDNA，进行序列分析；
b4)RACE扩增：根据比对出的序列设计引物进行5’RACE得到基因全长；通过设计全长引物克隆基因ORF区确保拼接正确；
C)生物信息学分析：
用MEGA6.0等软件分析AsSVP的序列结构，构建系统进化树，确定大蒜MADS-box基因的进化系地位；
使用Bioedit软件、ExPASy网站提供的ProtParam在线分析软件分析蛋白质一级结构，运用ProtParamtool在线推测预测蛋白质的分子量及每种氨基酸所占比例；结合DNASTAR软件和在线软件SOPMA预测AsSVP蛋白的二级结构；
使用在线分析软件PSORT对其AsSVP蛋白质亚细胞定位进行预测；
D)MADS-box基因的表达模式：
利用RT-PCR和RT-qPCR检测基因表达，比较分析各基因在花发育进程中的时空特异表达模式；
d1)各组织器官的RNA提取：包括根、假茎、嫩叶、鳞茎、花茎、第一发育期花蕾、第二发育期花蕾和第三发育期花蕾；
d2)半定量RT-PCR体系：
RNA(0.5ug)1ul，5×RTbuffer 4ul，Primer oligo dT(10μM)0.5ul，dNTPs(2.5mM)8ul，RNase inhibitor 0.5ul，RTAce 1ul，加ddH2O至总体积20ul；
按照以下程序进行RT反应：42℃，30min；99℃，5min；10℃，∞；
d3)半定量PCR扩增体系：
cDNA 1ul，半定量上游引物(20μM)0.4ul，半定量下游引物(20μM)0.4ul，Ex TaqPremix 10ul，加ddH2O至总体积20ul；
Action按照如下反应程序进行扩增94℃2min预变性，94℃30s，55℃30s，72℃30s，25个循环，最后72℃延伸7min；琼脂糖电泳检测；
AsSVP按照如下反应程序进行扩增：94℃2min预变性，94℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸7min；琼脂糖电泳检测；
d4)实时定量PCR扩增体系：
cDNA 8.4ul，实时定量上游引物(20μM)0.4ul，实时定量下游引物(20μM)0.4ul，
Figure FDA0002754850990000021
Green PCRMaster Mix 10ul，加ddH2O至总体积20ul；
反应程序：50℃2min，Stage2：95℃10min，Stage3：95℃15s，60℃1min；Stage4：95℃15s，60℃1min，95℃15s；在Stage3，Step2(60℃，1min)处收集荧光信号；
E)构建AsSVP过表达载体并农杆菌介导转染拟南芥：
通过Gateway置换把AsSVP的ORF区连接到pH7WG2D过表达载体上；
三亲杂交法将重组质粒导入农杆菌侵染拟南芥。
2.一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析,它的基因碱基序列如SEQ IDNO:1所示。
3.一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，它的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，其特征在于：
所述的步骤B)b3)中所述引物序列为：
P19E：GACTCGAGTGCACATCGTTTTTTTTTTTTTTTTT，
P18E：GACTCGAGTGCACATCG，
P038：GATCAAGMGSATCGAGAA，
P041：GATGAAGMGSATCGAGAA，
AD：ARCTCACYGTSCTYTGYGAYGC，
SP3：GACARGTCACKTTYTCKAAGC。
5.如权利要求1所述的一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，其特征在于：所述的步骤B)b4)中所述引物序列为：AsSVP 5’RACE特异性引物：GSP1:CTATGGTAAGACCCTGAAGA，GSP2:GCTGCTCCGACCTCACTA。
6.如权利要求1所述的一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析，其特征在于：所述的步骤D)中RT-qPCR引物包含上游引物和下游引物，所述的上游引物序列为：
AsSVPRT-F：GGCCAGGGAGAAGATAAAGATAAG,
下游引物序列为：AsSVPRT-R：GTCCAACTTCAGCATCACAAAG。
7.如权利要求1所述的一种大蒜开花抑制基因AsSVP的克隆及其功能解析在抑制开花大蒜开花方面的应用。
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