FCA-YRRM2基因及其改良经济作物性状的应用 技术领域
本发明属于植物基因工程领域, 具体地说涉及一种油菜 FCA基因的 RNA 结构域基因, 以及该结构域基因在作物经济性状改良上的应用。
背景技术 说
目前, 利用转基因改良作物的方法主要是根据已知的功能基因与表型性 状的关系, 采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标 植物, 以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。 所用的基因都是来 自天然的具有完整结构的基因序列或具有完整编书码顺序的 cDNA。 但是此种方 法必须首先知道基因的序列和功能, 因而其应用受到很大的限制。 《利用 FCA 基因 RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法》(CN200410084319. 3 )公开 了一种利用功能基因的 RNA结构域基因改良作物的方法。 此方法扩大了功能 基因转基因的利用范围, 可以产生与常规转基因方法不同的效果。
拟南芥 FCA (Flowering Control Activator , FCA ) 基因 ( Macknight, R. 等. Cell, 1997. 89(5): 737-745. ) 含有 20个内含子。 其中, 第 3个和第 13个内 含子的可变剪接使其产生四种不同的成熟转录本,分别命名为 FCA- a, FCA- β, FCA- γ和 FCA- δ; 其中只有 FCA- γ编码的蛋白 (747 aa) 具有促进开 花的作用, 它含有 2个 RRM ( RNA recognition mot if ) 结构域和一个環结 构域; FCA- δ编码的蛋白只有 2个 RRM结构域而不含有 WW结构域。水稻 FCA
( Du, X 等. DNA Sequence 2006. 17 (1): 31-40 ) 基因存在四种可变剪接, 分别命名为 OsFCA-1 , 0sFCA-2 , OsFCA- 3 和 OsFCA- 4。 OsFCA- 1 ( 738 aa ) 与拟南芥的 FCA- γ同源, 也含有 2个 RRM结构域和 1个 WW结构域; 0sFCA_2 比 OsFCA- 1少 102个 bp, OsFCA- 2缺失了 WW结构域。
FCA蛋白通过选择性使用 FCA pre-mRNA中的不同的加尾位点来调节自身 可变剪接的表达量。 FCA的 WW结构域与 FY蛋白的结合促进了近启动子端的 加尾信号的使用, 从而促使产生无用的 FCA可变剪接转录本。 水稻 FCA蛋白 的 RRM结构域在植物中高度保守, 在小麦 ( 9 0 % ) , 大麦 ( 9 0 % ), 黑麦
草 (82%), 玉米 (81%), 蓖麻 (76%), 杨树 (70%), 葡萄 (68%), 拟南 芥 (68%), 油菜 (64%) 等植物中都有极高的一致性。
在油菜中,与拟南芥 FCA基因同源的基因为油菜 FCA-γ基因(GenBank: AF414188.1), 油菜的转录本 FCA- γ编码的蛋白 (GenBank: AAL61622.1, 715 aa)和拟南芥 FCA- γ编码的蛋白结构相同, 也含有 2个 RRM结构域和一个 W W结构域, 其中第 103到 166个氨基酸为第一个 RRM结构域, 第 194到 270 个氨基酸为第二个醒结构域, 第 570到 600个氨基酸为 WW结构域。
经检索,没有发现油菜 FCA-γ基因的结构域基因在改良棉花产量或品质 性状方面应用的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种与作物产量或品质性状相关的蛋白。 该蛋白质 来源于油菜 FCA-γ基因中的一种 RRM2的蛋白。
本发明另一目的在于提供上述蛋白的编码基因, 该基因可用于转基因改 良作物的经济性状, 提高双子叶植物的产量并改善品质。
本发明第三目的在于提供利用上述基因改良作物产量或品质性状的方 法。
本发明第四目的在于提供利用带有上述基因的转基因植物培育品种的方 法。
实现本发明的技术方案如下:
一种作物产量或品质性状相关蛋白,该蛋白命名为 Bn-CSRRM2(cell-size RNA recognition motif) , 是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质:
(a) 由 SEQ ID No:l 所示的氨基酸序列组成;
(b) 由 SEQ ID No:l 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 缺失、 添加或替换组成的、 且与作物产量或品质性状相关的蛋白质。
上述蛋白中所述的作物可以是棉花 Gossypium hirusute L. ) 、 玉米 {Zea mays L. ) 、 水禾謹 ( Oryza sa ti va L. ) 、 小麦 ( Triticum aestivum L. ) 、 大麦 Horde urn L. ) 或油菜 ( Brassica napus L. ) 等。
上述蛋白中所述的作物产量或品质性状可以是棉花的单铃重、 单株结铃 数或纤维品质等性状。 所述的棉花纤维品质性状是指纤维长度、 纤维强度或 纤维细度等。
上述作物产量或品质性状相关蛋白的编码基因,为如下 1)或 2) 或 3) 的 基因:
1) 由 SEQ ID No : 2所示的核苷酸序列组成;
2) 由 SEQ ID No : 2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的突变、 替换 或者缺失产生的、并且编码作物产量或品质性状相关蛋白的核苷酸序 列;
3) 在严谨条件下, 可与 SEQ ID No : 2限定的 DNA序列杂交且编码作物产 量或品质性状相关的蛋白的核苷酸序列。
含有上述编码基因的表达载体。
含有上述编码基因的转基因植物细胞系。
含有上述编码基因的转基因植物组织。
含有上述编码基因的转基因植物。
上述表达载体中所述的载体为 PBI 121 或 pBin438; 优选为 pBin438。 一种改良植物产量或品质性状的方法, 是将上述的作物产量或品质性状 相关基因转入宿主植物中, 得到产量或品质改良的植物。
所选宿主植物是指棉花、 玉米、 水稻、 小麦、 油菜或大麦等作物。
以下以棉花为例, 说明利用上述作物产量或品质性状相关基因转基因育 种的方法, 包括如下步骤:
( 1 ) Bn-csRRM2基因克隆: 提取油菜的总 RNA, 然后以 RNA为模板反转 录获得 cDNA; 再以 cDNA 为模板, 以 Bn_csRRM2_S和 Bn_csRRM2_A为引物进 行 PCR扩增, 将扩增产物在 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 回收扩增片段, 获得 Bn-C SRRM2基因片段; 所述的引物为:
Bn-csRRM2-S : 5' - GAGGATCCATGGGTGCGGTAGAGTT —3, (SEQ ID No : 3) Bn-csRRM2-A : 5, - CGTAGATCTTGTGCCACTTCCCTTG -3, (SEQ ID No : 4)
(2 ) 表达载体的构建: 将 (1 ) 获得的 Bn-C SRRM2基因片段连接至载体 pGEM-T上,得中间载体 pGEM-T-csRRM2; 中间载体 pGEM_T_csRRM2和 pBIN438 经 Xbal和 BamHI双酶切,回收酶切片段,获得 Bn_csRRM2目的片段和 pBIN438 载体骨架; 用 T4 DNA连接酶将将 Bn-csRRM2连接到载体骨架 PBIN438上, 得 到表达载体 pBIN438_csRRM2, 并将其转入根癌农杆菌 (如 LBA4404) 中, 得 含有 Bn-csRRM2基因的菌株;
(3 ) 转化: 将棉花种子去壳, 接种于 MS培养基 (常规的) 上, 在光照 条件下培养 48〜72h, 子叶微张开时进行茎尖的剥离, 将幼苗去掉子叶, 留 0. 4〜1. 0cm的下胚轴, 在解剖镜下剥离出茎尖, 保留两个叶原基; 利用基因 枪轰击法将表达载体 pBIN438_csRRM2轰击到茎尖中;
(4)筛选及再生苗的获得: 将被轰击材料培养 3〜7d, 至幼叶发绿可见; 依次采用卡那霉素浓度梯度为 65mg/L、 80mg/L、 90 mg/L至 100 mg/L进行 梯度筛选, 每次间隔 7〜15d, 选择卡那霉素抗性植株, 获得再生苗; 所用的 筛选培养基分别为: MS培养基,无激素; G1培养基: MS培养基 +2. 0 mg/L KT + 2. 0 mg/L IAA; G2培养基: MS培养基 +0. 1 mg/L IAA+0. 1 mg/L 2 , 4- D;
(5 )嫁接及移栽: 以生长于营养钵的出苗 3〜4天的棉花幼苗茎为砧木, 将步骤 (4 ) 所得再生苗在温室中嫁接, 栽培, 同时对嫁接成功的植株进行 PCR扩增鉴定和 southern 印记检测, 选择鉴定含有 Bn_csRRM2基因的植株, 严格自交, 得转 Bn-csRRM2基因棉花。
利用带有上述编码基因的转基因植物培育植物品种的方法, 以带有上述 编码基因的转基因植物为亲本之一, 通过回交或者杂交方法, 培育出产量或 品质性状获得改良的植物品种。
所述的植物是指棉花、 玉米、 小麦、 大麦、 油菜、 水稻等。
一种杂交种的育种方法,利用上述转基因植物为亲本之一组配成杂交种。 一种用于检测上述编码基因的 PCR试剂盒, 其 PCR扩增所用的引物为:
5, AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3,, (SEQ ID No : 7 )
5, GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3, (SEQ ID No : 8)。
与现有技术相比, 本发明具有的优点和有益效果: 以棉花为例, 与非转 基因的对照相比, 本发明转 C SRRM2基因棉花 ( 1 ) 子叶、 叶片、 花、 苞叶、 叶柄、 株高、 棉铃等都增大。 (2 ) 单铃重从受体的 4. 8-5. 2克增加到 6. 4〜 7. 8克; 结铃性增加, 单株结铃数由 13. 5个增加到 17. 7个; 单株产量增加 15〜50%。 ( 3 )转基因材料的纤维品质得以改良, 与转基因受体相比,纤维长 度增加约 12%, 断裂比强度增加。 (4) 花粉增大。 (5 )细胞增大。 (6 ) 转基 因棉花抗早衰。
附图说明
图 1. PCR扩增 csRRM2基因产物电泳图谱; 其中 1为 Marker: 2. PCR
产物: 约 300 bp; 100 bp左右的为引物二聚体。
图 2. 表达载体 pBIN438_csRRM2结构图谱。
图 3. 表达载体检测电泳图谱; 其中 1. Marker; 2. pBIN438质粒。 图 4.棉花子叶对比照片, 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 5.棉花苞叶对比照片, 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 6.棉花叶片对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 7.棉花花朵对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 8.棉铃对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 9.棉花子房对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 10.棉瓣对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 11.铃壳对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 12.棉花纤维对比照片;其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 13.棉花植株对比照片;其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉所 12。 图 14.棉花田间生长对比照片; 其中 1为中棉所 12, 2为转基因的中棉 所 12。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,但对本发明的保护范围不构成任 何限制。 以下实施例中, 如无特别说明, 均为常规方法。 所用试剂均可从商 业途径获得。
实施例 1 : 油菜 Bn-csRRM2基因的克隆
1.油菜 cDNA的获取和纯化
( 1 ) 油菜总 RNA的提取和纯化:
(a)将超低温冻存的油菜叶片样品 0. 5克在液氮中研磨成粉末状; 加入 RNAi so Plus ( TaKaRa Code : D9108A), 将样品完全覆盖, 然后室温静置至 样品完全融化, 再继续研磨至裂解液呈透明状, 得匀桨液。
(b ) 将匀桨液室温静置 5分钟; 然后在 4°C、 12000g下离心 5分钟,取 上清液; 加入氯仿 (RNAiso Plus的 1/5体积量), 盖紧离心管盖, 用手剧烈 振荡 15秒, 待溶液充分乳化, 再室温静置 5分钟; 于 4°C、 12000 g下离心 15分钟, 吸取上清液, 弃中间的白色蛋白层及有颜色的下层有机相; 向上清 液中加入等体积的异丙醇,混匀,在 15〜30°C下静置 10分钟,再在 4°C、 12000
g 离心 10分钟, 弃上清液; 加入 75%的乙醇 1 ml, 4°C、 12000 g离心 5分 钟,弃上清液;所得沉淀即为油菜总 RNA,室温干燥沉淀 2〜5分钟,加入 RNase Free ddH20溶解沉淀, 使 RNA沉淀完全溶解。
(c)按下列组份配制反应液:来自 (b)的总 RNA20〜50 μ g, lOXDNase I Buffer 5μ 1, RNA 酶抑制剂 20 U, DNase I (RNase-free) 2μ 1 (10U), RNase Free dd 0 至总体积为 50μ 1。 37°C 20 min, 用 RNase Free dd¾0 50 μ ΐ定容至 ΙΟΟμ Ι; 加入等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇 (25: 24: 1)混匀。 室温、 13500 rpm离心 5 min, 取上清; 加入等体积的氯仿 /异戊醇 (24: 1) 混匀, 室温、 13500 rpm 离心 5 min, 取上清; 加入 3 M醋酸钠 ΙΟμ Ι, 冷乙 醇 250μ 1, 冰上放置 10 min, 在 4°C、 13500 rpm离心 15 min, 弃上清; 加 入 70%冷乙醇 500 μ 1洗净, 4°C、 13500 rpm离心 5min, 弃上清。 沉淀干燥; 加入 RNase Free dd 0 50μ 1溶解, 于 _80°C保存。
用分光光度计测定样品在 260nm 和 280nm 的吸光度。 结果样品的 八260 280值为2.05。 说明所得 RNA没有降解, 纯度符合要求。
(2) 油菜 cDNA的获取
按下列组份配制 RT反应液 (反应液配制按照产品说明书进行)。
PrimeScript® RT reagent Kit (TaKaRa Code: DRR037A)
RT反应液: 5XPrimeScript®Buffer 2μ 1, PrimeScript®RT Enzyme Mix I 0.5μ 1, Oligo dT Primer (50 μΜ) 0.5μ 1, Random 6 mers (100 μΜ) 0.5μ 1, 总 RNA 500 ng, RNase Free d¾0 至总体积 10μ 1。
反转录反应条件: 37°C 15 min, 85 °C 5 sec。 获得 cDNA。
(3) Bn-csRRM2的 PCR扩增
根据油菜 Brassicanapus . ) FCA- γ ¾@ (GenBank: AF414188.1) 的 全长 cDNA 序列设计引物, 并在引物两端分别引入限制性内切酶 BamHI 和 Xball识别位点及保护碱基, 引物序列如下:
Bn-csRRM2-S: 5' - GAGGATCCATGGGTGCGGTAGAGTT —3, (SEQ ID No :3) Bn-csRRM2-A: 5' - CGTAGATCTTGTGCCACTTCCCTTG _3, (SEQ ID No :4) 以 (2) 所得 cDNA为模板, 以 Bn-csRRM2-S和 Bn-csRRM2-A为引物进行 PCR扩增。 PCR反应体系为: TaKaRa LATaq (5 U/ μ 1) 0.5μ 1, 10XLAPCR Buffer II (Mg2+Free) 5.0 μ 1, MgCl2 (25 mM) 5.0 μ 1 , dNTP Mixture (每种
2.5 mM) 8. Ομ 1, 正向引物 Bn_R履 2_S (10 mM) 1.0 μ 1, 反向引物 Bn_RRM2_A (10 mM) Ι. Ομ Ι, cDNA模板 0.5μ 1, 灭菌蒸馏水 29 μ 1。 PCR反应条件为: 95 °C 2min; 94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin, 30 个循环; 72°C 10 min。 将所得 PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 结果 (见图 1) 扩增得到约 300bp 的特异性条带, 另一条为引物二聚体, 将所得特异性条带回收, 送上 海英骏生物技术有限公司进行测序, 其序列见 SEQ ID No:2o 将其命名为 Bn - cs誦 2。
实施例 2: csRRM2基因表达载体的构建
(1) PCR扩增产物的回收 用 AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit (Cat No. AP-GX-250) 胶回收试剂盒 (AXYGEN公司) 回收实施例 1中 PCR扩增产 物中大小约为 300bp的电泳条带, 回收方法按照产品说明书进行。
(2) 将目的片段连接至 pGEM-T载体 (Promega)
利用 pGEM®- T Easy Vector System I (Cat. ft A1360) (Promega, Madison, WI, USA) 进行 (具体操作按照产品说明书进行)
将 pGEM-T 载体瞬时离心到管底。 蜗旋振荡 2XRapid Ligation buffer, 以 0.2ml离心管配制连接反应体系: 2 X Rapid Ligation buffer 5 μ 1, pGEM-T Easy Vevtor (50ng) 1 μ 1, T4 DNA连接酶(3u/ml ) 1 μ 1, PCR产物(Bn_csRRM2) (25ug/ml) 3μ 1, 用枪上下吹打混匀, 4°C过夜, 得质粒 pGEM-T_csRRM2。
( 3 ) 质粒 pGEM-T-csRRM2的转化
取冻存的大肠杆菌 DH5a感受态细胞 (按照常规方法制备) 50μ 1于 4°C 离心管中溶解; 每个离心管加入步骤 (2) 中所得的 pGEM-T-csRRM2 ΙΟμ Ι, 轻轻混匀, 于冰上放置 30min; 然后将离心管置于 42°C的恒温水浴中 90s, 不要摇动管; 迅速将离心管转至冰浴中冷却 2min。 每个离心管加入液体 LB (无抗生素) 200μ 1, 再于 37°C、 180rpm水浴中 50min; 在每块 LB氨苄平 板上涂抹 X-gal (5-溴 -4-氯 -3-吲哚糖苷) 16μ 1和 IPTG (异丙基硫代 _β -D半乳糖苷) 4μ 1, 并放置 30min备用。 将离心管中的液体全部涂抹在 LB 氨苄平板上,静止 30min。倒置平板,于 37°C过夜培养 12〜16h,将平板于 4°C 放置 1小时使蓝色充分显色。 挑选 10个白斑分别接种于有 LB液体 (含氨苄 青霉素, 100mg/L) 600μ 1的离心管中, 过夜摇菌。 以 Τ7和 SP6引物测序验 证阳性克隆 (pGEM-T-csRRM2)。 同时做无目的 DNA连接产物转化对照。 测序
结果显示克隆的 Bn-CSRRM2基因片段正确, 没有突变。
(4) 质粒 DNA的制备及纯化
取 (3) 中在 LB 培养液中培养过夜的菌液 1-4 ml, 12000 g 离心 1 min, 弃上清。用已加入 RNase A 的 Buffer SI 250 μ 1 (试剂盒: AxyPrep™ Plasmid Miniprep Kit (Cat. AP- MN- P- 250) , 下同) 悬浮细菌沉淀, 悬浮需均匀, 不应留有小的菌块。 加入 250 μ 1 Buffer S2, 上下翻转混合 4_6 次均匀使菌 体充分裂解, 直至形成透亮的溶液。 加入 350μ 1 Buffer S3, 上下翻转混合 6-8 次, 12000 g 离心 10 min, 取上清并转移到 DNA制备管 (置于 2 ml 离 心管中), 12000 g 离心 1 min; 将制备管置回离心管, 加 500 μ 1 Buffer W1, 12000 g 离心 1 min, 弃滤液; 将制备管置回离心管, 加 700 μ 1 Buffer W2, 12000 g 离心 1 min, 弃滤液; 以同样的方法再用 700 μ 1 Buffer W2 洗涤 一次, 弃滤液; 将制备管置回 2 ml 离心管中, 12000Xg 离心 1 min。 将制 备管移入新的 1.5 ml 离心管中, 在 DNA制备膜正中央加水 60μ 1, 室温静 置 1 min。 12, 000 g 离心 1 min。 取 5μ 1进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
结果 (见图 2 ) ρΒΙΝ438 空载体提取的质粒大小为 13Kb 左右, pGEM-T-csRRM2提取的质粒大小约为 3.4kb左右。
(5) 质粒 DNA目的片段的酶切
用限制性内切酶对质粒 DNA进行酶切 (NEW ENGLAND Biolabs), 酶切反应 体系: DNA 1 μ g, 10 X酶切缓冲液 2μ 1, Xbal 0.5μ 1, BamHI 0.5μ 1, ddH20 补充至 20 μ 1。于 37°C反应 4小时, 然后在 1%琼脂糖凝胶电泳检测。 结果 pBIN438空载体经 Xbal和 BamHI双酶切后电泳显示为一条 13kb左右条 带。 pGEM-T-csRRM2经 Xbal和 BamHI双酶切后电泳显示为一条 3kb左右的片 段和一条 300bp左右的片段。
(6) 目的片段的回收与连接
采用 AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit (Cat No. AP-GX-250) 进行 片段回收。 片段回收按照产品说明书进行。 使用 T4DNA连接酶(NEW ENGLAND Biolabs)将目的片段 Bn-csRRM2连接到表达载体 pBIN438上。连接反应体系: 载体 DNA 50ng, 外源片段 200ng, 10X连接缓冲液 2 μΐ, ddH20 补充 至 20μ1, T4DNA连接酶 1μ1。 所得质粒命名为 pBIN438_csRRM2。
将连接产物用于转化大肠杆菌 DH5ci感受态细胞, 挑取单克隆后使用特
异性引物 Bn-RRM2-S和 Bn_RRM2_A进行 PCR和双向测序验证含有重组质粒的 阳性克隆。
结果: 双向测序结果经拼接后的序列中的开放阅读框 (Bn-csRRM2 基因 在构建好的载体 pBIN438_csRRM2中的开放阅读框) 见 SEQ ID No : 5。
其编码的氨基酸序列为: (SEQ ID No : 6)
所得表达载体 pBIN438_csRRM2结构见图 2。
实施例 3 : 转 Bn-csRRM2基因棉花的获得
(一) MS培养基的母液的配制
母液 1 : 将 KN03 19000 mg/L, NH4NO3 16500 mg/L, MgS04. 7H20 370mg/L, KH2P04 1700 mg/L, CaCL2. 2H20 4400 mg/L溶于 lOOOmL蒸馏水中, 混合均匀。
母液 2:将 MnS04. 0, 1690 mg/L, ZnS04. 7H20, 860 mg/L, ¾B03 620 mg/L, KI 83 mg/L, Na2M00. 5H20 25 mg/L, CuS04. 5H20 2. 5 mg/L, CoCl2. 6H20 2. 5 mg/L 溶于 1000ml蒸馏水中, 混合均匀即可。
母液 3 :将甘氨酸 200 mg/L,盐酸硫胺素 40 mg/L,盐酸吡哆锌 50 mg/L, 烟酸 50 mg/L, 肌醇 10000 mg/L, 溶于 1000ml蒸馏水中, 混合均匀即可。
母液 4: 将 Na2-EDTA 7. 45 g/L, FeS04. 7H20 5. 57 g/L,溶于 1000ml蒸馏 水中, 混合均匀即可。
MS培养基配制:将 100ml母液 1, 10ml母液 2, 10ml母液 3, 5ml母液 4, 蔗糖 30g溶于少量的蒸馏水中, 加水至 990ml, 调 pH值至 5. 8 , 加 GEL RITE gel lan gum 0. 2g混匀后定容至 1L。
(二) 按照如下方法进行:
( 1 ) 以中棉所 12为转基因受体。 将其种子去壳, 接种于 MS培养基(组 成成份见上) 上, 28°C, 光照条件下培养 48〜72h。
(2 ) 子叶微张开时进行茎尖的剥离: 将幼苗去掉子叶, 留 0. 4〜1. 0cm 的下胚轴, 在解剖镜下剥离出茎尖, 保留两个叶原基。 将以提取的基因质粒 DNA利用基因枪轰击茎尖。 并以未轰击材料为对照。
(3 ) 将轰击材料先恢复培养至幼叶发绿可见, 一般为 3〜7d;
(4 ) 恢复培养后, 开始筛选培养: 采用卡那霉素 (Sigma) 为筛选剂。 采用 65, 80, 90, 100 mg * L-l以上, 每次间隔 7〜15d, 逐步筛选出转基因 再生植株。 所用的筛选培养基分别为: MS培养基, 无激素; G1培养基: MS
培养基 +2. Omg · L-1KT+2.0 mg · L_l IAA; G2培养基: MS培养基 +0.1 mg · L_l IAA+0.1 mg · L-l 2, 4_D。
(5) 抗性再生植株的移栽: 抗性植株采用嫁接方式移植到温室中。 嫁 接操作如下: 将棉花种子种在营养钵里, 浇水从盘子底下往上慢慢阴湿, 温 度 28-30°C, 出苗时间大概 3-4天左右。 生长好的棉花砧木苗, 从生长点用 刀片轻轻劈开, 再生苗下胚轴两边削成 V字形, 夹在砧木苗里, 用尼龙草劈 成细绳, 把苗缠好, 套上塑料袋, 封好口, 放在光照和温度适宜情况下培养, 一般培养在 10天左右, 伤口就能愈合好。
(6) 炼苗, 把塑料袋口打开, 放置 7-10天, 待嫁接苗已长出新叶, 就 可以移栽。
(7) 开花后, 严格自交。
(8) 将能够收取种子的植株进行分子检测: 首先, 卡那霉素 1500 mg/L 涂抹抗性植株真叶, 以非转化植株为对照。 以棉花总 DNA为模板, 利用 PCR 方法进行分子检测,引物为:
5, AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3,, (SEQ ID No: 7)
5, GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3, (SEQ ID No: 8)
反应程序: 95°C, 5min; 95 °C 40s, 58 °C 40s, 72 °C 45s, 32个循环; 72 °C lOmin; 4°C, 电泳检测, 结果产生 500bp左右 PCR扩增产物的为阳性。
9.将 PCR阳性植株自交, 收获自交铃种子。 将自交种子种植到中国农业 科学院棉花研究所转基因中间试验基地内 (以受体材料为对照)。
结果共获得转基因再生植株 31株,嫁接成活 31株。 PCR检测共获得阳性 植株 18株。 18株材料都获得了 50粒以上的成熟种子。
实施例 4: 转 csRRM2基因棉花材料的 Southern 印记检测
按照如下方法进行:
( 1 ) 按照常规方法提取实施例 3中所得的 T0代转基因棉花总 DNA。
(2) 酶切: 分别用限制性内切酶 Hindlll和 EcoR l (购自 takara公司) 单酶切,在 37°C酶切 6小时。酶切体系如下: DNA30 g, 10X酶切 buffer 5.0 μ ΐ, 限制性内切酶 5μ 1, 无菌去离子水补齐至 50μ 1。 将酶切后的样品在 0.8%琼脂糖凝胶上电泳, 电压: 一般用恒压: l〜2V/cm,电泳缓冲液使用 0.5 XTBE, 电泳到溴酚蓝指示剂接近胶的另一端时停止电泳 (约 1厘米)。
( 3 ) 标记探针 将 lug 模板 DNA (由带有 Bn-csRRM2 基因的质粒 pBIN438-csRRM2为模板 PCR扩增得到, 引物如下:
5, AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3, (SEQ ID NO: 7 )
5, GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3, ( SEQ ID NO: 8)
用无菌水稀释到 16ul沸水中变性 lOmin,迅速至于冰水混合物中混合 DNA 弓 I物 (选用试齐1 J盒 DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I购自 clone tech公司), 取 4ul加入到变性 DNA中, 混匀, 点动离心。 37°C温育过夜 (20h); 加 2ul 0. 2M EDTA终止反应, 或者 65°C加热 10min。
(4) DNA转膜与固定、 杂交、 洗膜。
(5) 酶联检测 杂交和严谨冲洗后, 在 washing buffer中冲洗 l-5min, 在 100ml blocking solution中温育 30min, 在 20ml antibody solution中 温育 30min, 在 100ml washing buffer 中洗两次, 每次 15min; 在 20ml detectiong buffer 中平衡 2_5min, 黑暗中将膜在 10ml 新配制的 color substrate solution中温育, 在 16h之后才能完全结束。
(6)观察 显色结束后取出杂交膜, 倒掉显色液。 将膜平放于 TE缓冲液 中, 在自然光下使用数码相机 (FUJIFILM FinePix S8100fd 焦距: 10mm) 拍 照保存结果。
Southern印记检测结果显示, 实施例 3所得的 18个阳性植株中的 12个 植株材料含有至少一条杂交带, 说明获得了 12个转化体。 将 12个转化体按 照顺序分别编号: L001、 L002〜L012。
实施例 5: 转 Bn-csRRM2基因材料的田间试验及农艺性状观测试验 按照如下方法进行:
( 1 ) 将实施例 3获得的 18个阳性单株 (T0代) 进行田间试验, 以非转 基因受体材料中棉所 12为对照。
(2 ) 在 T1代材料 (T。代的自交后代) 的蕾期、 花铃期、 盛铃期、 吐絮 期调查所有材料的农艺性状, 主要为株高、 叶片大小、 叶色、 结铃性、 抗病 性、 吐絮情况等。
(3 ) 对所有材料进行 Southern Blotting检测, 检测方法同实施例 4。
(4) 对检测结果为阳性的材料进行编号, 编号分别为 L001至 L012 (这 个编号和前面相同, 每棵材料的后代均为这个编号材料的株系, 统一以这个
编号命名)。 开花后进行自交, 成熟收获得 T2代种子。
( 5 ) 在吐絮期, 每个株系收取 50铃, 考察其单铃重、 子指、 衣分、 衣 指等, 采用 HVI900纤维测试仪对纤维品质进行检测。
表 1 转 Bn-csRRM2基因 Π代棉花纤维品质检测结果 (2008年)
结果 (见表 1 ) 在 π代中, 所有转基因材料的纤维长度平均比对照提 高 3. 24匪, 断裂比强度也提高了 3. 8cN/tex。 其他指标同对照差别不大。 说 明 Bn-csRRM2基因可用于改良棉花纤维品质。
实施例 6 T2-T5代转 Bn-csRRM2基因棉花材料田间和室内检测试验 ( 1 ) 材料来源: T2代由实施例 5中的 Π代阳性植株并且性状优良的 植株自交而来。 T3代转基因材料来由 T2代阳性植株并且性状优良的植株自 交而来; T4代转基因材料由 T3代阳性植株且性状优良的植株自交而来; T5
代转基因材料由 T4代阳性植株且性状优良的植株自交而来;对照都为非转基 因的受体材料中棉所 12。
( 2 ) 种植方法: 从 2008年〜 2010年分别对 T2〜T5代转 csRRM2基因棉 花材料在中国农业科学院棉花研究所转基因中间试验基地内进行田间试验, 每种 Τ2代材料种植 3〜5个单株, 田间种植采用随机株行排列, 以非转基因 受体材料中棉所 12为对照。
( 3 ) 对 Τ3代材料进行小区随机试验, 2-3次重复。 小区设置如下: 行 长 6米, 行距 0. 8米, 3行; Τ4代和 Τ5代材料种植方式同 Τ3代材料; 以非 转基因受体材料中棉所 12为对照。
(4 ) 田间观察和测试: 对棉花子叶、 苞叶、 叶片、 叶柄、 花朵、 棉铃、 子房、 棉瓣、 铃壳、 棉纤维等性状进行田间观测和室内考种, 对于检测为阳 性的且表现优良的植株进行自交, 进入下一代。
结果: ( a ) 在所有世代 (见图 5〜12 ), 转基因材料的子叶、 苞叶、 叶片、 叶柄、 花朵、 棉铃、 子房、 棉瓣、 铃壳、 棉纤维等都增大明显。 转基 因再生株茎杆变粗, 植株变大(见图 13 )。 转基因材料的棉铃(见图 8 )显著 大于受体材料。
(b)、 单铃重及结铃性: 2009年对田间种植的 T2、 Τ3代材料的考察数 据见表 2和表 3 ( Τ3代以后的数据基本相同, 在此省略)。 其中转基因材料
表 3 转 BN-csRRM2基因 T3代棉花材料的性状检测试验结果
的单铃重、 单株结铃数、籽指都显著高于对照; 如 T2代中, 转基因材料 L008 的单铃重 6. 80克, 比对照材料高 30%, 在 T3代中, L010、 L011的单铃重分 别为 7. 64克、 7. 84克, 比对照分别增加 46%、 50%。 在结铃性上, 除 L001、 L006的结铃性稍差外, 其他材料的结铃性显著强于对照, 其中 L012 的单株 结铃超过对照 36%。
以上结果说明 Bn-csRRM2基因可用于棉花产量和品质性状的改良。
( c )、生育期 (见图 14 ) :所有转基因材料的生育时期延长, 特别到后期, 对照材料的叶片基本脱落, 而转基因材料仍然枝叶繁茂, 生育期的延长有助 于提高产量及改良纤维品质。
( d )、 纤维品质:表 4为 T4、 Τ5代检测结果的平均值。 (因 Τ2、 Τ3等世 代的结果与之基本相同, 在此省略)。在 Τ4/Τ5代, 来自于四个转化体的不同 株系 (9304-1等编号代表不同株系) 的纤维品质在纤维长度、 纤维强度上也 比对照大幅度提高。同时,转基因材料的单铃重也同时比对照提高明显, L010 的两个株系的单铃重仍然在 7. 5克左右。 所有株系的单铃重比对照的提高幅 度都在 27%以上。 表明纤维品质的改良同单铃重的改良可以同步进行。
以上结果说明转 Bn-C SRRM2基因棉花材料的单铃重显著增加、 结铃性增 强; 转基因材料的纤维品质显著改良; 转基因材料在器官水平显著增大; 单 铃重的提高与纤维品质的改良可以同步进行。
经过 5 代的田间试验, 共选出单铃重显著增加、 纤维品质改良的转基因 株系 9个。 分别为来自于 L011的 9317-1、 9317-2及 9316-2 ; 来自于 L010 的 9304-1、 9304-3;来自于 L003的 9311-3、 931 1-5;来自于 L004的 9319-1、
9319-4。
表 4 转 Bn-csRRM2基因棉花的 T4/T5代株系试验结果 (2010年)
实施例 6: 以转 Bn-csRRM2基因棉花为亲本组配的杂交种的对比试验 按照如下方法进行:
(1)、杂交组合配制: 选取 2个转基因株系 9422 (来源于 L010的 T3代) 及 8350 (来源 L003 的 T3代), 小区 (5米行长, 0.9米行距, 2行) 种植于 大田。 以 9422或 8350为母本, 分别同中 287 (大铃材料, 来源于中国农业 科学院棉花研究所) 和中 3316 (小铃材料, 来源于中国农业科学院棉花研究 所) 进行杂交。 所配制组合见表 6。
(2) 种植 (1) 中所配制的杂交组合材料, 以其父母本为对照, 以中棉 所 12为阴性对照。 随机区组设计, 小区设计为 3行区, 行长 7米, 行距 0.8 米。
(3) 生育期、 单铃重、 纤维品质等性状考察同实施例 5。
结果: (a) 杂交材料外观性状同其母本基本一致, 器官变大的特征得以
保持。
(b) 杂交材料的单铃重 (见表 5)同母本相比差异不明显, 但显著大于父 本。 杂交材料的结铃性同亲本相比, 有 2个组合 (8350X中 3316、 9422X中 287) 的结铃性显著高于亲本, 另外两个组合同亲本差异不显著。
(c) 杂交材料的纤维品质 (见表 5)接近或强于于母本, 同父本比较则显 著改良,如 9422X中 287的纤维长度为 30.69匪、断裂比强度为 33. lcN/tex, 与母本 (纤维长度为 30.73匪、 断裂比强度为 32.3cN/tex) 基本相当。 9422 X中 3316" 的纤维强度则显著强于亲本。
以上结果说明 Bn-CSRRM2基因可以提高棉花的产量与改良纤维品质。
转 Bn-csRRM2基因棉花杂交种对比试验结果