CN102439031A - csRRM2基因及其在棉花性状改良上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。本发明公开了一种作物产量或品质性状相关蛋白，是(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；(b)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、添加或替换组成的、且与作物产量或品质性状相关的蛋白质。本发明还公开了该蛋白的编码基因。以棉花为例，本发明可使转基因棉花的子叶、叶片、花、苞叶、叶柄、株高、棉铃等增大；单铃重、结铃性增加；纤维长度、断裂比强度增加；花粉增大、细胞增大；而且转基因棉花表现抗早衰。

Description

csRRM2基因及其在棉花性状改良上的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说涉及一种油菜FCA基因的RNA结构域基因，以及该结构域基因在作物经济性状改良上的应用。

背景技术

目前，利用转基因改良作物的方法主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。所用的基因都是来自天然的具有完整结构的基因序列或具有完整编码顺序的cDNA。但是此种方法必须首先知道基因的序列和功能，因而其应用受到很大的限制。《利用FCA基因RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法》(CN200410084319.3)公开了一种利用功能基因的RNA结构域基因改良作物的方法。此方法扩大了功能基因转基因的利用范围，可以产生与常规转基因方法不同的效果。

拟南芥FCA(Flowering Control Activator，FCA)基因(Macknight，R.等.Cell，1997.89(5)：737-745.)含有20个内含子。其中，第3个和第13个内含子的可变剪接使其产生四种不同的成熟转录本，分别命名为FCA-α，FCA-β，FCA-γ和FCA-δ；其中只有FCA-γ编码的蛋白(747aa)具有促进开花的作用，它含有2个RRM(RNA recognition motif)结构域和一个WW结构域；FCA-δ编码的蛋白只有2个RRM结构域而不含有WW结构域。水稻FCA(Du，X等.DNA Sequence 2006.17(1)：31-40)基因存在四种可变剪接，分别命名为OsFCA-1，OsFCA-2，OsFCA-3和OsFCA-4。OsFCA-1(738aa)与拟南芥的FCA-γ同源，也含有2个RRM结构域和1个WW结构域；OsFCA-2比OsFCA-1少102个bp，OsFCA-2缺失了WW结构域。

FCA蛋白通过选择性使用FCA pre-mRNA中的不同的加尾位点来调节自身可变剪接的表达量。FCA的WW结构域与FY蛋白的结合促进了近启动子端的加尾信号的使用，从而促使产生无用的FCA可变剪接转录本。水稻FCA蛋白的RRM结构域在植物中高度保守，在小麦(90％)，大麦(90％)，黑麦草(82％)，玉米(81％)，蓖麻(76％)，杨树(70％)，葡萄(68％)，拟南芥(68％)，油菜(64％)等植物中都有极高的一致性。

在油菜中，与拟南芥FCA基因同源的基因为油菜FCA-γ基因(GenBank：AF414188.1)，油菜的转录本FCA-γ编码的蛋白(GenBank：AAL61622.1，715aa)和拟南芥FCA-γ编码的蛋白结构相同，也含有2个RRM结构域和一个WW结构域，其中第103到166个氨基酸为第一个RRM结构域，第194到270个氨基酸为第二个RRM结构域，第570到600个氨基酸为WW结构域。

经检索，没有发现油菜FCA-γ基因的结构域基因在改良棉花产量或品质性状方面应用的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种与作物产量或品质性状相关的蛋白。该蛋白质来源于油菜FCA-γ基因中的一种RRM2的蛋白。

本发明另一目的在于提供上述蛋白的编码基因，该基因可用于转基因改良作物的经济性状，提高双子叶植物的产量并改善品质。

本发明第三目的在于提供利用上述基因改良作物产量或品质性状的方法。

本发明第四目的在于提供利用带有上述基因的转基因植物培育品种的方法。

实现本发明的技术方案如下：

一种作物产量或品质性状相关蛋白，该蛋白命名为Bn-csRRM2(cell-sizeRNA recognition motif)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；

(b)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、添加或替换组成的、且与作物产量或品质性状相关的蛋白质。

上述蛋白中所述的作物可以是棉花(Gossypium hirusute L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivumL.)、大麦(Hordeum L.)或油菜(Brassica napus L.)等。

上述蛋白中所述的作物产量或品质性状可以是棉花的单铃重、单株结铃数或纤维品质等性状。所述的棉花纤维品质性状是指纤维长度、纤维强度或纤维细度等。

上述作物产量或品质性状相关蛋白的编码基因，为如下1)或2)或3)的基因：

1)由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；

2)由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的突变、替换或者缺失产生的、并且编码作物产量或品质性状相关蛋白的核苷酸序列；

3)在严谨条件下，可与SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交且编码作物产量或品质性状相关的蛋白的核苷酸序列。

含有上述编码基因的表达载体。

含有上述编码基因的转基因植物细胞系。

含有上述编码基因的转基因植物组织。

含有上述编码基因的转基因植物。

上述表达载体中所述的载体为pBI121或pBin438；优选为pBin438。

一种改良植物产量或品质性状的方法，是将上述的作物产量或品质性状相关基因转入宿主植物中，得到产量或品质改良的植物。

所选宿主植物是指棉花、玉米、水稻、小麦、油菜或大麦等作物。

以下以棉花为例，说明利用上述作物产量或品质性状相关基因转基因育种的方法，包括如下步骤：

(1)Bn-csRRM2基因克隆：提取油菜的总RNA，然后以RNA为模板反转录获得cDNA；再以cDNA为模板，以Bn-csRRM2-S和Bn-csRRM2-A为引物进行PCR扩增，将扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收扩增片段，获得Bn-csRRM2基因片段；所述的引物为：

Bn-csRRM2-S：5’-GAGGATCCATGGGTGCGGTAGAGTT-3’(SEQ ID No：3)

Bn-csRRM2-A：5’-CGTAGATCTTGTGCCACTTCCCTTG-3’(SEQ ID No：4)

(2)表达载体的构建：将(1)获得的Bn-csRRM2基因片段连接至载体pGEM-T上，得中间载体pGEM-T-csRRM2；中间载体pGEM-T-csRRM2和pBIN438经XbaI和BamHI双酶切，回收酶切片段，获得Bn-csRRM2目的片段和pBIN438载体骨架；用T4DNA连接酶将将Bn-csRRM2连接到载体骨架pBIN438上，得到表达载体pBIN438-csRRM2，并将其转入根癌农杆菌(如LBA4404)中，得含有Bn-csRRM2基因的菌株；

(3)转化：将棉花种子去壳，接种于MS培养基(常规的)上，在光照条件下培养48～72h，子叶微张开时进行茎尖的剥离，将幼苗去掉子叶，留0.4～1.0cm的下胚轴，在解剖镜下剥离出茎尖，保留两个叶原基；利用基因枪轰击法将表达载体pBIN438-csRRM2轰击到茎尖中；

(4)筛选及再生苗的获得：将被轰击材料培养3～7d，至幼叶发绿可见；依次采用卡那霉素浓度梯度为65mg/L、80mg/L、90mg/L至100mg/L进行梯度筛选，每次间隔7～15d，选择卡那霉素抗性植株，获得再生苗；所用的筛选培养基分别为：MS培养基，无激素；G1培养基：MS培养基+2.0mg/L KT+2.0mg/L IAA；G2培养基：MS培养基+0.1mg/L IAA+0.1mg/L2，4-D；

(5)嫁接及移栽：以生长于营养钵的出苗3～4天的棉花幼苗茎为砧木，将步骤(4)所得再生苗在温室中嫁接，栽培，同时对嫁接成功的植株进行PCR扩增鉴定和southern印记检测，选择鉴定含有Bn-csRRM2基因的植株，严格自交，得转Bn-csRRM2基因棉花。

利用带有上述编码基因的转基因植物培育植物品种的方法，以带有上述编码基因的转基因植物为亲本之一，通过回交或者杂交方法，培育出产量或品质性状获得改良的植物品种。

所述的植物是指棉花、玉米、小麦、大麦、油菜、水稻等。

一种杂交种的育种方法，利用上述转基因植物为亲本之一组配成杂交种。

一种用于检测上述编码基因的PCR试剂盒，其PCR扩增所用的引物为：

5’AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3’，(SEQ ID No：7)

5’GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3’(SEQ ID No：8)。

与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：以棉花为例，与非转基因的对照相比，本发明转csRRM2基因棉花(1)子叶、叶片、花、苞叶、叶柄、株高、棉铃等都增大。(2)单铃重从受体的4.8-5.2克增加到6.4～7.8克；结铃性增加，单株结铃数由13.5个增加到17.7个；单株产量增加15～50％。(3)转基因材料的纤维品质得以改良，与转基因受体相比，纤维长度增加约12％，断裂比强度增加。(4)花粉增大。(5)细胞增大。(6)转基因棉花抗早衰。

附图说明

图1.PCR扩增csRRM2基因产物电泳图谱；其中1为Marker：2.PCR产物：约300bp；100bp左右的为引物二聚体。

图2.表达载体pBIN438-csRRM2结构图谱。

图3.表达载体检测电泳图谱；其中1.Marker；2.pBIN438质粒。

图4.棉花子叶对比照片，其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图5.棉花苞叶对比照片，其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图6.棉花叶片对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图7.棉花花朵对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图8.棉铃对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图9.棉花子房对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图10.棉瓣对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图11.铃壳对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图12.棉花纤维对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图13.棉花植株对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

图14.棉花田间生长对比照片；其中1为中棉所12，2为转基因的中棉所12。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但对本发明的保护范围不构成任何限制。以下实施例中，如无特别说明，均为常规方法。所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1：油菜Bn-csRRM2基因的克隆

1.油菜cDNA的获取和纯化

(1)油菜总RNA的提取和纯化：

(a)将超低温冻存的油菜叶片样品0.5克在液氮中研磨成粉末状；加入RNAiso Plus(TaKaRa Code：D9108A)，将样品完全覆盖，然后室温静置至样品完全融化，再继续研磨至裂解液呈透明状，得匀浆液。

(b)将匀浆液室温静置5分钟；然后在4℃、12000g下离心5分钟，取上清液；加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化，再室温静置5分钟；于4℃、12000g下离心15分钟，吸取上清液，弃中间的白色蛋白层及有颜色的下层有机相；向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，在15～30℃下静置10分钟，再在4℃、12000g离心10分钟，弃上清液；加入75％的乙醇1ml，4℃、12000g离心5分钟，弃上清液；所得沉淀即为油菜总RNA，室温干燥沉淀2～5分钟，加入RNaseFree ddH₂O溶解沉淀，使RNA沉淀完全溶解。

(c)按下列组份配制反应液：来自(b)的总RNA 20～50μg，10×DNaseI Buffer 5μl，RNA酶抑制剂20U，DNase I(RNase-free)2μl(10U)，RNase Free ddH₂O至总体积为50μl。37℃20min，用RNase Free ddH₂O50μl定容至100μl；加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀。室温、13500rpm离心5min，取上清；加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，室温、13500rpm离心5min，取上清；加入3M醋酸钠10μl，冷乙醇250μl，冰上放置10min，在4℃、13500rpm离心15min，弃上清；加入70％冷乙醇500μl洗净，4℃、13500rpm离心5min，弃上清。沉淀干燥；加入RNase Free ddH₂O 50μl溶解，于-80℃保存。

用分光光度计测定样品在260nm和280nm的吸光度。结果样品的A260/A280值为2.05。说明所得RNA没有降解，纯度符合要求。

(2)油菜cDNA的获取

按下列组份配制RT反应液(反应液配制按照产品说明书进行)。

RT reagent Kit(TaKaRa Code：DRR037A)

RT反应液：5×PrimeScript

Buffer 2μl，

RT Enzyme MixI 0.5μl，Oligo dT Primer(50μM)0.5μl，Random 6mers(100μM)0.5μl，总RNA 500ng，RNase Free dH₂O至总体积10μl。

反转录反应条件：37℃15min，85℃5sec。获得cDNA。

(3)Bn-csRRM2的PCR扩增

根据油菜(Brassica napus L.)FCA-γ基因(GenBank：AF414188.1)的全长cDNA序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶BamHI和XbalI识别位点及保护碱基，引物序列如下：

Bn-csRRM2-S：5’-GAGGATCCATGGGTGCGGTAGAGTT-3’(SEQ ID No：3)

Bn-csRRM2-A：5’-CGTAGATCTTGTGCCACTTCCCTTG-3’(SEQ ID No：4)

以(2)所得cDNA为模板，以Bn-csRRM2-S和Bn-csRRM2-A为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：TaKaRa LA Taq  (5U/μl)0.5μl，10×LA PCRBuffer II(Mg2+Free)5.0μl，MgCl₂(25mM)5.0μl，dNTP Mixture(每种2.5mM)8.0μl，正向引物Bn-RRM2-S(10mM)1.0μl，反向引物Bn-RRM2-A(10mM)1.0μl，cDNA模板0.5μl，灭菌蒸馏水29μl。PCR反应条件为：95℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将所得PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果(见图1)扩增得到约300bp的特异性条带，另一条为引物二聚体，将所得特异性条带回收，送上海英骏生物技术有限公司进行测序，其序列见SEQ ID No：2。将其命名为Bn-csRRM2。

实施例2：csRRM2基因表达载体的构建

(1)PCR扩增产物的回收用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit(CatNo.AP-GX-250)胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收实施例1中PCR扩增产物中大小约为300bp的电泳条带，回收方法按照产品说明书进行。

(2)将目的片段连接至pGEM-T载体(Promega)

利用

-T Easy Vector System I(Cat.#A1360)(Promega，Madison，WI，USA)进行(具体操作按照产品说明书进行)

将pGEM-T载体瞬时离心到管底。蜗旋振荡2×Rapid Ligation buffer，以0.2ml离心管配制连接反应体系：2×Rapid Ligation buffer 5μl，pGEM-TEasy Vevtor(50ng)1μl，T4DNA连接酶(3u/ml)1μl，PCR产物(Bn-csRRM2)(25ug/ml)3μl，用枪上下吹打混匀，4℃过夜，得质粒pGEM-T-csRRM2。

(3)质粒pGEM-T-csRRM2的转化

取冻存的大肠杆菌DH5α感受态细胞(按照常规方法制备)50μl于4℃离心管中溶解；每个离心管加入步骤(2)中所得的pGEM-T-csRRM2 10μl，轻轻混匀，于冰上放置30min；然后将离心管置于42℃的恒温水浴中90s，不要摇动管；迅速将离心管转至冰浴中冷却2min。每个离心管加入液体LB(无抗生素)200μl，再于37℃、180rpm水浴中50min；在每块LB氨苄平板上涂抹X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚糖苷)16μl和IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)4μl，并放置30min备用。将离心管中的液体全部涂抹在LB氨苄平板上，静止30min。倒置平板，于37℃过夜培养12～16h，将平板于4℃放置1小时使蓝色充分显色。挑选10个白斑分别接种于有LB液体(含氨苄青霉素，100mg/L)600μl的离心管中，过夜摇菌。以T7和SP6引物测序验证阳性克隆(pGEM-T-csRRM2)。同时做无目的DNA连接产物转化对照。测序结果显示克隆的Bn-csRRM2基因片段正确，没有突变。

(4)质粒DNA的制备及纯化

取(3)中在LB培养液中培养过夜的菌液1-4ml，12000g离心1min，弃上清。用已加入RNase A的Buffer S1 250μl(试剂盒：AxyPrep^TM PlasmidMiniprep Kit(Cat.AP-MN-P-250)，下同)悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。加入250μl Buffer S2，上下翻转混合4-6次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。加入350μl Buffer S3，上下翻转混合6-8次，12000g离心10min，取上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，12000g离心1min；将制备管置回离心管，加500μl Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加700μl Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；将制备管置回2ml离心管中，12000×g离心1min。将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加水60μl，室温静置1min。12,000g离心1min。取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果(见图2)pBIN438空载体提取的质粒大小为13Kb左右，pGEM-T-csRRM2提取的质粒大小约为3.4kb左右。

(5)质粒DNA目的片段的酶切

用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切(NEW ENGLAND Biolabs)，酶切反应体系：DNA 1μg，10×酶切缓冲液2μl，XbaI 0.5μl，BamHI 0.5μl，ddH₂O补充至20μl。于37℃反应4小时，然后在1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果pBIN438空载体经XbaI和BamHI双酶切后电泳显示为一条13kb左右条带。pGEM-T-csRRM2经XbaI和BamHI双酶切后电泳显示为一条3kb左右的片段和一条300bp左右的片段。

(6)目的片段的回收与连接

采用AxyPrep TM DNA Gel Extraction Kit(Cat No.AP-GX-250)进行片段回收。片段回收按照产品说明书进行。使用T4DNA连接酶(NEW ENGLANDBiolabs)将目的片段Bn-csRRM2连接到表达载体pBIN438上。连接反应体系：载体DNA 50ng，外源片段200ng，10×连接缓冲液2μl，ddH2O补充至20μl，T4DNA连接酶1μl。所得质粒命名为pBIN438-csRRM2。

将连接产物用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆后使用特异性引物Bn-RRM2-S和Bn-RRM2-A进行PCR和双向测序验证含有重组质粒的阳性克隆。

结果：双向测序结果经拼接后的序列中的开放阅读框(Bn-csRRM2基因在构建好的载体pBIN438-csRRM2中的开放阅读框)见SEQ ID No：5。其编码的氨基酸序列为：(SEQ ID No：6)

所得表达载体pBIN438-csRRM2结构见图2。

实施例3：转Bn-csRRM2基因棉花的获得

(一)MS培养基的母液的配制

母液1：将KNO₃ 19000mg/L，NH₄NO₃ 16500mg/L，MgSO₄.7H₂O 370mg/L，KH₂PO₄ 1700mg/L，CaCL₂.2H₂O 4400mg/L溶于1000mL蒸馏水中，混合均匀。

母液2：将MnSO₄.H₂O，1690mg/L，ZnSO₄.7H₂O，860mg/L，H₃BO₃ 620mg/L，KI 83mg/L，Na₂MO0.5H₂O  25mg/L，CuSO₄.5H₂O 2.5mg/L，CoCl₂.6H₂O 2.5mg/L溶于1000ml蒸馏水中，混合均匀即可。

母液3：将甘氨酸200mg/L，盐酸硫胺素40mg/L，盐酸吡哆锌50mg/L，烟酸50mg/L，肌醇10000mg/L，溶于1000ml蒸馏水中，混合均匀即可。

母液4：将Na₂-EDTA 7.45g/L，FeSO₄.7H₂O 5.57g/L，溶于1000ml蒸馏水中，混合均匀即可。

MS培养基配制：将100ml母液1，10ml母液2，10ml母液3，5ml母液4，蔗糖30g溶于少量的蒸馏水中，加水至990ml，调pH值至5.8，加GEL RITEgellan gum 0.2g混匀后定容至1L。

(二)按照如下方法进行：

(1)以中棉所12为转基因受体。将其种子去壳，接种于MS培养基(组成成份见上)上，28℃，光照条件下培养48～72h。

(2)子叶微张开时进行茎尖的剥离：将幼苗去掉子叶，留0.4～1.0cm的下胚轴，在解剖镜下剥离出茎尖，保留两个叶原基。将以提取的基因质粒DNA利用基因枪轰击茎尖。并以未轰击材料为对照。

(3)将轰击材料先恢复培养至幼叶发绿可见，一般为3～7d；

(4)恢复培养后，开始筛选培养：采用卡那霉素(Sigma)为筛选剂。采用65，80，90，100mg·L-1以上，每次间隔7～15d，逐步筛选出转基因再生植株。所用的筛选培养基分别为：MS培养基，无激素；G1培养基：MS培养基+2.0mg·L-1KT+2.0mg·L-1 IAA；G2培养基：MS培养基+0.1mg·L-1IAA+0.1mg·L-12，4-D。

(5)抗性再生植株的移栽：抗性植株采用嫁接方式移植到温室中。嫁接操作如下：将棉花种子种在营养钵里，浇水从盘子底下往上慢慢阴湿，温度28-30℃，出苗时间大概3-4天左右。生长好的棉花砧木苗，从生长点用刀片轻轻劈开，再生苗下胚轴两边削成V字形，夹在砧木苗里，用尼龙草劈成细绳，把苗缠好，套上塑料袋，封好口，放在光照和温度适宜情况下培养，一般培养在10天左右，伤口就能愈合好。

(6)炼苗，把塑料袋口打开，放置7-10天，待嫁接苗已长出新叶，就可以移栽。

(7)开花后，严格自交。

(8)将能够收取种子的植株进行分子检测：首先，卡那霉素1500mg/L涂抹抗性植株真叶，以非转化植株为对照。以棉花总DNA为模板，利用PCR方法进行分子检测，引物为：

5’AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3’，(SEQ ID No：7)

5’GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3’(SEQ ID No：8)

反应程序：95℃，5min；95℃40s，58℃40s，72℃45s，32个循环；72℃10min；4℃，电泳检测，结果产生500bp左右PCR扩增产物的为阳性。

9.将PCR阳性植株自交，收获自交铃种子。将自交种子种植到中国农业科学院棉花研究所转基因中间试验基地内(以受体材料为对照)。

结果共获得转基因再生植株31株，嫁接成活31株。PCR检测共获得阳性植株18株。18株材料都获得了50粒以上的成熟种子。

实施例4：转csRRM2基因棉花材料的Southern印记检测

按照如下方法进行：

(1)按照常规方法提取实施例3中所得的T0代转基因棉花总DNA。

(2)酶切：分别用限制性内切酶HindIII和EcoR I(购自takara公司)单酶切，在37℃酶切6小时。酶切体系如下：DNA 30μg，10×酶切buffer 5.0μl，限制性内切酶5μl，无菌去离子水补齐至50μl。将酶切后的样品在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，电压：一般用恒压：1～2V/cm，电泳缓冲液使用0.5×TBE，电泳到溴酚蓝指示剂接近胶的另一端时停止电泳(约1厘米)。

(3)标记探针将1ug模板DNA(由带有Bn-csRRM2基因的质粒pBIN438-csRRM2为模板PCR扩增得到，引物如下：

5’AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3’(SEQ ID NO：7)

5’GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA 3’(SEQ ID NO：8)

用无菌水稀释到16ul沸水中变性10min，迅速至于冰水混合物中混合DNA引物(选用试剂盒DIG High Primer DNA Labeling and Detection StarterKit I购自clone tech公司)，取4ul加入到变性DNA中，混匀，点动离心。37℃温育过夜(20h)；加2ul 0.2M EDTA终止反应，或者65℃加热10min。

(4)DNA转膜与固定、杂交、洗膜。

(5)酶联检测杂交和严谨冲洗后，在washing buffer中冲洗1-5min，在100ml blocking solution中温育30min，在20ml antibody solution中温育30min，在100ml washing buffer中洗两次，每次15min；在20mldetectiong buffer中平衡2-5min，黑暗中将膜在10ml新配制的colorsubstrate solution中温育，在16h之后才能完全结束。

(6)观察显色结束后取出杂交膜，倒掉显色液。将膜平放于TE缓冲液中，在自然光下使用数码相机(FUJIFILM FinePix S8100fd焦距：10mm)拍照保存结果。

Southern印记检测结果显示，实施例3所得的18个阳性植株中的12个植株材料含有至少一条杂交带，说明获得了12个转化体。将12个转化体按照顺序分别编号：L001、L002…L012。

实施例5：转Bn-csRRM2基因材料的田间试验及农艺性状观测试验

按照如下方法进行：

(1)将实施例3获得的18个阳性单株(T0代)进行田间试验，以非转基因受体材料中棉所12为对照。

(2)在T1代材料(T₀代的自交后代)的蕾期、花铃期、盛铃期、吐絮期调查所有材料的农艺性状，主要为株高、叶片大小、叶色、结铃性、抗病性、吐絮情况等。

(3)对所有材料进行Southern Blotting检测，检测方法同实施例4。

(4)对检测结果为阳性的材料进行编号，编号分别为L001至L012(这个编号和前面相同，每棵材料的后代均为这个编号材料的株系，统一以这个编号命名)。开花后进行自交，成熟收获得T2代种子。

(5)在吐絮期，每个株系收取50铃，考察其单铃重、子指、衣分、衣指等，采用HVI900纤维测试仪对纤维品质进行检测。

表1转Bn-csRRM2基因T1代棉花纤维品质检测结果(2008年)

结果(见表1)在T1代中，所有转基因材料的纤维长度平均比对照提高3.24mm，断裂比强度也提高了3.8cN/tex。其他指标同对照差别不大。说明Bn-csRRM2基因可用于改良棉花纤维品质。

实施例6T2-T5代转Bn-csRRM2基因棉花材料田间和室内检测试验

(1)材料来源：T2代由实施例5中的T1代阳性植株并且性状优良的植株自交而来。T3代转基因材料来由T2代阳性植株并且性状优良的植株自交而来；T4代转基因材料由T3代阳性植株且性状优良的植株自交而来；T5代转基因材料由T4代阳性植株且性状优良的植株自交而来；对照都为非转基因的受体材料中棉所12。

(2)种植方法：从2008年～2010年分别对T2～T5代转csRRM2基因棉花材料在中国农业科学院棉花研究所转基因中间试验基地内进行田间试验，每种T2代材料种植3～5个单株，田间种植采用随机株行排列，以非转基因受体材料中棉所12为对照。

(3)对T3代材料进行小区随机试验，2-3次重复。小区设置如下：行长6米，行距0.8米，3行；T4代和T5代材料种植方式同T3代材料；以非转基因受体材料中棉所12为对照。

(4)田间观察和测试：对棉花子叶、苞叶、叶片、叶柄、花朵、棉铃、子房、棉瓣、铃壳、棉纤维等性状进行田间观测和室内考种，对于检测为阳性的且表现优良的植株进行自交，进入下一代。

结果：(a)在所有世代(见图5～12)，转基因材料的子叶、苞叶、叶片、叶柄、花朵、棉铃、子房、棉瓣、铃壳、棉纤维等都增大明显。转基因再生株茎杆变粗，植株变大(见图13)。转基因材料的棉铃(见图8)显著大于受体材料。

(b)、单铃重及结铃性：2009年对田间种植的T2、T3代材料的考察数据见表2和表3(T3代以后的数据基本相同，在此省略)。其中转基因材料

表2转Bn-csRRM2基因T2代棉花材料的检测试验结果

表3转BN-csRRM2基因T3代棉花材料的性状检测试验结果

的单铃重、单株结铃数、籽指都显著高于对照；如T2代中，转基因材料L008的单铃重6.80克，比对照材料高30％，在T3代中，L010、L011的单铃重分别为7.64克、7.84克，比对照分别增加46％、50％。在结铃性上，除L001、L006的结铃性稍差外，其他材料的结铃性显著强于对照，其中L012的单株结铃超过对照36％。

以上结果说明Bn-csRRM2基因可用于棉花产量和品质性状的改良。

(c)、生育期(见图14)：所有转基因材料的生育时期延长，特别到后期，对照材料的叶片基本脱落，而转基因材料仍然枝叶繁茂，生育期的延长有助于提高产量及改良纤维品质。

(d)、纤维品质：表4为T4、T5代检测结果的平均值。(因T2、T3等世代的结果与之基本相同，在此省略)。在T4/T5代，来自于四个转化体的不同株系(9304-1等编号代表不同株系)的纤维品质在纤维长度、纤维强度上也比对照大幅度提高。同时，转基因材料的单铃重也同时比对照提高明显，L010的两个株系的单铃重仍然在7.5克左右。所有株系的单铃重比对照的提高幅度都在27％以上。表明纤维品质的改良同单铃重的改良可以同步进行。

以上结果说明转Bn-csRRM2基因棉花材料的单铃重显著增加、结铃性增强；转基因材料的纤维品质显著改良；转基因材料在器官水平显著增大；单铃重的提高与纤维品质的改良可以同步进行。

经过5代的田间试验，共选出单铃重显著增加、纤维品质改良的转基因株系9个。分别为来自于L011的9317-1、9317-2及9316-2；来自于L010的9304-1、9304-3；来自于L003的9311-3、9311-5；来自于L004的9319-1、9319-4。

表4转Bn-csRRM2基因棉花的T4/T5代株系试验结果(2010年)

实施例6：以转Bn-csRRM2基因棉花为亲本组配的杂交种的对比试验

按照如下方法进行：

(1)、杂交组合配制：选取2个转基因株系9422(来源于L010的T3代)及8350(来源L003的T3代)，小区(5米行长，0.9米行距，2行)种植于大田。以9422或8350为母本，分别同中287(大铃材料，来源于中国农业科学院棉花研究所)和中3316(小铃材料，来源于中国农业科学院棉花研究所)进行杂交。所配制组合见表6。

(2)种植(1)中所配制的杂交组合材料，以其父母本为对照，以中棉所12为阴性对照。随机区组设计，小区设计为3行区，行长7米，行距0.8米。

(3)生育期、单铃重、纤维品质等性状考察同实施例5。

结果：(a)杂交材料外观性状同其母本基本一致，器官变大的特征得以保持。

(b)杂交材料的单铃重(见表5)同母本相比差异不明显，但显著大于父本。杂交材料的结铃性同亲本相比，有2个组合(8350×中3316、9422×中287)的结铃性显著高于亲本，另外两个组合同亲本差异不显著。

(c)杂交材料的纤维品质(见表5)接近或强于于母本，同父本比较则显著改良，如9422×中287的纤维长度为30.69mm、断裂比强度为33.1cN/tex，与母本(纤维长度为30.73mm、断裂比强度为32.3cN/tex)基本相当。9422×中3316”的纤维强度则显著强于亲本。

以上结果说明Bn-csRRM2基因可以提高棉花的产量与改良纤维品质。

表5转Bn-csRRM2基因棉花杂交种对比试验结果

Claims (10)

1.一种作物产量或品质性状相关蛋白，其特征在于是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；

(b)由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、添加或替换组成、且与作物产量或品质相关的蛋白质。

2.按照权利要求1所述的蛋白，其特征在于所述的作物是棉花(Gossypium hirusute L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativaL.)、小麦(Triticum aestivum L.)、大麦(Hordeum L.)或油菜(Brassicanapus L.)。

3.权利要求1所述蛋白的编码基因，为如下1)或2)或3)的基因：

1)由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；

2)由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的突变、替换或者缺失产生的、并且编码作物产量或品质性状相关蛋白的核苷酸序列；

3)在严谨条件下，可与SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交且编码作物产量或品质性状相关的蛋白的核苷酸序列。

4.含有权利要求3所述编码基因的表达载体。

5.含有权利要求3所述编码基因的转基因植物细胞系。

6.含有权利要求3所述编码基因的转基因植物组织。

7.含有权利要求3所述编码基因的转基因植物。

8.一种培育植物品种的方法，其特征在于以权利要求7所述的转基因植物为亲本之一，通过回交或者杂交方法，培育出产量或品质性状获得改良的转基因植物品种。

9.一种杂交种的育种方法，其特征在于利用权利要求7或8所述的转基因植物至少作为亲本之一，组配成杂交种植物。

10.一种用于检测权利要求3所述的编码基因的PCR试剂盒，其特征在于PCR扩增的引物为：

5’AGTCGTGGATGCGGGTTTGTTA 3’，

5’GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA3’。

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