CN112655545A - 一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，涉及作物新品种选育技术领域。本发明利用转基因抗虫棉花品系与转基因高衣分品系杂交，再以杂交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以转基因抗虫优质品系为轮回亲本进行连续六代回交，筛选具有高衣分基因、抗虫的植株自交两代，再筛选具有高衣分基因、抗虫的株行进行自交繁殖，评价筛选纤维品质与所述轮回亲本基本一致的株行，即得所述转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。本发明将常规育种方法和现代分子生物学方法有机结合，实现了基因的精准选择，减少新品系创制过程中的盲目性，缩短了育种周期。

Description

一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法

技术领域

本发明属于作物新品种选育技术领域，具体涉及一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法。

背景技术

棉花是我国的第一大经济作物，在国民经济中占有很重要的地位，棉纤维是一种重要的纺织原料，随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，对高品质棉纤维的需求日益增加。

棉花的产量和纤维品质均属于数量性状，两者之间表现遗传上的紧密负相关，纤维品质特优的品种产量(衣分)低，传统育种同步改良棉花纤维产量和品质难度大，且周期很长。西南大学将FBP7::iaaM导入到棉花品种冀棉14中，获得了纤维产量和细度同步改良的转基因棉花材料IF1-1(FBP7::iaaM)：成熟纤维数量增加,同时其马克隆值也显著下降，被列为棉花第2代转基因新种质材料。但IF1-1除了衣分较高以外，其他经济性状如结铃性、单铃籽棉重等表现一般，大面积直接推广应用困难。

转基因生物技术与传统育种技术结合在棉花遗传改良方面已取得重大进展，我国利用自主构建的抗虫基因cry1Ab/cry1Ac并通过全国大量棉花育种家采用杂交、回交等传统技术培育出一大批转基因抗虫棉品种，由于其抗虫性及遗传稳定好，农药使用大幅度下降，显著提高了籽棉产量，经济效益和环境效益显著提高，在长江流域和黄河流域大面积推广应用了20余年，成为目前我国种植面积最大的转基因作物。转基因生物技术与传统育种技术的结合已成为目前作物育种最为有效的途径之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，在常规育种选择中辅助基因的分子检测，从而将抗虫、优质、高衣分有效聚合，缩短育种周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，包括以下步骤：(1)以转基因抗虫优质棉花品系为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫杂交组合F₁；

(2)以所述转基因抗虫杂交组合F₁为母本，以所述转基因抗虫优质品系为父本进行杂交，得回交一代BC₁F₁；

(3)以所述回交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以所述转基因抗虫优质棉花品系为轮回亲本，进行回交，连续回交五代，得回交六代BC₆F₁；

(4)对所述回交六代BC₆F₁中具有转基因高衣分基因的植株自交，单株收获，得BC₆F₂；

(5)筛选所述BC₆F₂中所有植株都抗虫的抗虫株行中具有转基因高衣分基因的植株进行自交，单株收获，得BC₆F₃；

(6)筛选所述BC₆F₃中所有植株都抗虫且具有转基因高衣分基因的株行进行自交繁殖，株行收获评价筛选，得转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。

优选的，步骤(1)中所述母本包括金陆长1号；所述父本包括IF1-1。

优选的，所述转基因高衣分材料IF1-1含有FBP7::iaaM基因。

优选的，所述高衣分基因FBP7::iaaM的PCR鉴定引物包括IF-up、IF-dn1和IF-dn2；且所述IF-up的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述IF-dn1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，IF-dn2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述PCR鉴定的体系以25μL计，包括：5×PrimeSTAR缓冲液5μL、dNTP 2μL、上游引物和下游引物各1μL、棉花gDNA 10～200ng、PrimeSTAR DNAPolymerase 0.5U和余量的水。

优选的，所述PCR鉴定的程序包括：98℃变性10sec，56℃退火5sec、72℃延伸60sec，32循环。

优选的，步骤(1)～步骤(5)中抗虫性的筛选方法，包括：在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度为0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。

本发明提供了一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，利用转基因抗虫优质棉花品系与转基因高衣分品系杂交，再以杂交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以转基因抗虫优质品系为轮回亲本进行连续六代回交，筛选具有转基因高衣分基因、抗虫的植株自交两代，再筛选具有高衣分基因、抗虫的株行进行自交繁殖，评价筛选纤维品质与所述轮回亲本基本一致的株行，即得所述转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。所述选育方法将常规育种方法和分子鉴定方法有机结合，步骤合理、操作简单，减少了新品系创制的盲目性，缩短了育种周期，实现了精准育种。

附图说明

图1为本发明转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育流程图；

图2为检测材料中是否含有转基因高衣分基因的分子标记PCR检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，其流程如图1所示，包括以下步骤：(1)以转基因抗虫优质棉花品系为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫杂交组合F₁；

(2)以所述转基因抗虫杂交组合F₁为母本，以所述转基因抗虫优质品系为父本进行杂交，得回交一代BC₁F₁；

(3)以所述回交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以所述转基因抗虫优质棉花品系为轮回亲本，进行回交，连续回交五代，得回交六代BC₆F₁；

(4)对所述回交六代BC₆F₁中具有转基因高衣分基因的植株自交，单株收获，得BC₆F₂；

(5)筛选所述BC₆F₂中所有植株都抗虫的抗虫株行中具有转基因高衣分基因的植株进行自交，单株收获，得BC₆F₃；

(6)筛选所述BC₆F₃中所有植株都抗虫且具有转基因高衣分基因的株行进行自交繁殖，株行收获评价筛选，得转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。

本发明以转基因抗虫棉花品系为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫杂交组合F₁。本发明所述母本优选包括金陆长1号(2009年四川省审定品种，审定编号为川审棉2009006，单铃籽棉重6.1g，衣分偏低：35.22％，纤维品质特优：纤维上半部平均长度35.42mm，比强度35.9cN/tex，马克隆值3.92)，父本优选包括IF1-1(从西南大学引进，其衣分高达45.7％，但铃较小，单铃籽棉重4.7g；公开于刘存敬.转iaaM高衣分棉花种质IF1-1杂种优势分析及育种应用，河北农业科学，2016，20(3)：70-74)。在本发明中，所述转基因高衣分品系中的高衣分基因优选为FBP7::iaaM，检测该基因的引物优选包括IF-up(SEQ ID NO.1，5’-atcagagccatgaataggtc-3’)、IF-dn1(SEQ ID NO.2，5’-ccttgcagaccagtaagggc-3’),和IF-dn2(SEQ ID NO.3，5’-gtgtgataccccaaattggg-3’)。本发明进行所述基因的鉴定时，其PCR的体系以25μL计，优选包括：5×PrimeSTAR缓冲液(Mg²⁺Plus)5μL、dNTP(各2.5mM)2μL、上游引物和下游引物(各10mM)各1μL、棉花gDNA 10～200ng、PrimeSTAR DNAPolymerase 0.5U和余量的水。本发明所述PCR的程序优选为98℃变性10sec，56℃退火5sec，72℃延伸60sec，运行32个循环。本发明优选在扩增后取10μL PCR产物进行电泳，如同时扩增出IF-up+IF-dn1DNA条带(690bp)和IF-up+IF-dn2DNA条带(883bp)，则所检测植株含有目的基因(图2)。在后续步骤中，由于对于所述基因的检测和筛选方法均相同，因此后续不再赘述。

在本发明中，进行所述杂交前，优选还包括对母本的抗虫性进行筛选，优选包括：在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度为0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。本发明对于抗虫性的筛选方法均相同，因此后续内容中不再赘述。本发明所述杂交可将转基因高衣分基因FBP7::iaaM和抗虫基因聚合在同一后代。

得转基因抗虫杂交组合F₁后，本发明以所述转基因抗虫杂交组合F₁为母本，以所述转基因抗虫优质品系为父本进行杂交，得回交一代BC₁F₁。本发明所述父本优选与上述步骤中的转基因抗虫优质品系相同。本发明所述一带回交可将轮回亲本的遗传成分传递一半到杂交后代BC₁F₁。

得回交一代BC₁F₁后，本发明以所述回交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以所述转基因抗虫优质棉花品系为轮回亲本连续回交五代，得回交六代BC₆F₁。本发明所述共回交六代将轮回亲本的几乎所有遗传成分都传递给BC₆F₁中，使BC₆F₁的主要遗传成分与轮回亲本基本一致。

得回交六代BC₆F₁后，本发明对所述回交六代BC₆F₁中具有转基因高衣分基因的植株自交，单株收获，得BC₆F₂。本发明所述自交可得到抗虫基因纯合且具有高衣分基因植株。

得BC₆F₂后，本发明筛选所述BC₆F₂中抗虫株行中具有转基因高衣分基因的植株进行自交，单株收获，得BC₆F₃。本发明所述自交可得到抗虫基因纯合且高衣分基因纯合植株。

得BC₆F₃后，本发明对所述BC₆F₃中具有转基因高衣分基因的株行进行自交繁殖，株行收获评价，筛选保留品质与轮回亲本基本一致的株行，得转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。本发明所述自交可将优质基因纯合并同时将抗虫、优质、高衣分基因分别纯合的基因聚合在一起的效果，同时，这些基因及其所表达的性状能稳定遗传给下一代。

在本发明中，根据孟德尔作物遗传规律，杂交可将不同个体之间的部分遗传背景聚集在同一个个体上，回交可将轮回亲本的遗传背景递增到杂种后代中，理论上每回交1次，杂种后代所含轮回亲本的遗传成分将递增一半。通过连续5～6次回交，其后代的主要性状已接近轮回亲本，即回交六代所形成的材料基本保持了需要的已有优良性状。一般情况下，所筛选的基因在BC₆F₁是杂合的，通过自交可对杂合基因纯合，连续2～3代自交选择可得到纯合基因，其所表达的性状可稳定地遗传给下一代。

下面结合实施例对本发明提供的一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

转基因抗虫优质高衣分棉花新品系RFB的选育

(1)2015年夏季，在成都种植转基因抗虫优质品种金陆长1号和转基因高衣分材料IF1-1(从西南大学引进，含有转FBP7::iaaM基因)。在金陆长1号生长到7片真叶完全展开时，以质量百分浓度为1.0％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，9天后所有植株的叶片都不变色，金陆长1号抗虫100％，抗虫基因是纯合的；IF1-1生长到6片真叶完全展开时，对每个植株PCR鉴定高衣分基因FBP7::iaaM，每个植株同时扩增出690bp DNA条带和、883bpDNA条带，说明IF1-1是纯合的。到开花期后，金陆长1号植株上的花朵去掉雄蕊，利用IF1-1的花朵给其授粉杂交，收获5个杂交铃的种子，得转基因抗虫核不育杂交种F1(材料名称RF)。

(2)2015年冬季，在海南种植杂交组合RF和转基因抗虫优质品种金陆长1号，开花后，RF去掉雄蕊，利用金陆长1号的花朵授粉杂交，收获杂交铃种子，得回交一代材料(材料名称RFBC₁F₁)。

(3)2016夏季，在成都种植回交一代材料RFBC₁F₁和金陆长1号，在7片真叶期对RFBC₁F₁(20株)进行转FBP7::iaaM基因的PCR鉴定，无FBP7::iaaM基因的植株12株，淘汰，有FBP7::iaaM基因的植株8株，保留。在开花期，利用金陆长1号给保留的8株的花朵授粉杂交，收获16个杂交铃的种子，得回交二代材料种子(材料名称RFBC₂F₁)。

采用相同方法，以金陆长1号为轮回父本，回交材料中含有FBP7::iaaM基因的植株为母本，连续回交五代得回交六代材料RFBC₆F₁。

(4)2018年冬季，在海南种植RFBC₆F₁材料，得22株，在低7片真叶时进行FBP7::iaaM鉴定，获得转基因高衣分植株10株，栓花自交，单株收获，每株收自交铃5个，得RFBC₆F₂种子；

(5)2019年夏季，在成都种植RFBC₆F₂材料，10个株行，每个株行种植15株，6片真叶时用1％的硫酸卡拉霉素鉴定抗虫性，4个株行出现有不抗虫植株，淘汰；其余6个株行的所有植株均抗虫，蕾期前每个植株分别进行FBP7::iaaM鉴定，非高衣分基因植株33株，淘汰，选择健壮、抗虫、具有高衣分植株30株，栓花自交，每株单独收获，每株各收5个自交铃，得FBC₆F₃种子。

(6)2019年冬季，在海南种植夏季收获的30个FBC₆F₃材料，单独种植形成30个株行，每个株行15株。在5片真叶时开展抗虫性鉴定和FBP7::iaaM的PCR鉴定，所有植株均抗虫，22个株行出现了无FBP7::iaaM的植株，淘汰。剩余8个株行的所有植株既抗虫又具有转高衣分基因，交繁殖，各株行分别混合收种，考察评价每个株行的衣分、纤维品质、铃重、结铃性等，筛选出比金陆长1号衣分明显提高且纤维品质、铃重、结铃性与之相当的株行5个：RFB-1、RFB-5、RFB-13、RFB-21、RFB-27，即获得转基因抗虫优质高衣分棉花新品系(RFB)。

表1转基因抗虫高衣分新品系RFB的主要性状

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所

<120> 一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法

<141> 2020-12-17

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcagagcca tgaataggtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttgcagac cagtaagggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtgatacc ccaaattggg 20

Claims (7)

1.一种转基因抗虫优质高衣分棉花新品系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以转基因抗虫优质棉花品系为母本，以转基因高衣分品系为父本进行杂交，得转基因抗虫杂交组合F₁；

(2)以所述转基因抗虫杂交组合F₁为母本，以所述转基因抗虫优质品系为父本进行杂交，得回交一代BC₁F₁；

(3)以所述回交后代中具有转基因高衣分基因的植株为母本，以所述转基因抗虫优质棉花品系为轮回亲本，进行回交，连续回交五代，得回交六代BC₆F₁；

(4)对所述回交六代BC₆F₁中具有转基因高衣分基因的植株进行自交，单株收获，得BC₆F₂；

(5)筛选所述BC₆F₂中所有植株都抗虫的抗虫株行中具有转基因高衣分基因的植株进行自交，单株收获，得BC₆F₃；

(6)筛选所述BC₆F₃中所有植株都抗虫且具有转基因高衣分基因的株行进行自交繁殖，株行收获评价筛选，得转基因抗虫优质高衣分棉花新品系。

2.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤(1)中所述母本包括金陆长1号；所述父本包括IF1-1。

3.根据权利要求1所述选育方法，其特征在于，所述转基因高衣分材料IF1-1含有FBP7::iaaM基因。

4.根据权利要求3所述培育方法，其特征在于，所述高衣分基因FBP7::iaaM的PCR鉴定引物包括IF-up、IF-dn1和IF-dn2；且所述IF-up的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述IF-dn1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，IF-dn2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求4所述培育方法，其特征在于，所述PCR鉴定的体系以25μL计，包括：5×PrimeSTAR缓冲液5μL、dNTP 2μL、上游引物和下游引物各1μL、棉花gDNA 10～200ng、PrimeSTAR DNAPolymerase 0.5U和余量的水。

6.根据权利要求4或5所述培育方法，其特征在于，所述PCR鉴定的程序包括：98℃变性10sec，56℃退火5sec、72℃延伸60sec，32循环。

7.根据权利要求1所述培育方法，其特征在于，步骤(1)～步骤(5)中抗虫性的筛选方法，包括：在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度为0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。

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