KR20050026012A - 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아 식물 - Google Patents

근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 대해 기술한다. 특히, 본 발명의 식물은 브라시카 라파(Brassica rapa)로 부터 유전자침투된 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 포함한다. 이러한 내성은 브라시카 올레라체아에서 기존의 내성과 비교하였을 때 개선된 근류병 내성을 제공한다.

Description

근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아 식물{Clubroot resistant Brassica oleracea plants}
실시예 1
브라시카 올레라체아( Brassica oleracea )로의 내성 형질의 전이
F1
근류병 내성이 있는 중국산 양배추 F1 잡종 Parkin 및 브로콜리(Brassica oleracea)간에 수백번 교배를 실시하였다. 이 교배로부터 배를 회생시켰다[참조 문헌: Harbert et al., Euphytica 18 (1969) p. 425-429]. 이들 배중 4개를 식물에서 발육시키고, 이들 중 2개가 질병에 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 두 내성 식물은 19개 염색체를 가진다. 표현형은 중국산 양배추와 브로콜리의 잡종이다.
BC1
배-회생을 다시 실시하여 BC1 식물을 얻는다. 브로콜리 근교계 계열을 역교배 모본으로 이용하였다. 브로콜리 계열을 다음 세대의 역교배 모본으로 다시 이용하였다. 상기 방법에서 두 FI 식물중 하나만이 반응하였고, 5개 배를 식물에서 발육시켰다. 이들중 4개가 근류병에 내성이 있었다. BC1 식물의 표현형은 브로콜리 역교배 부모에 더 흡사하였다. BC1 식물에서 브라시카 라파(Brassica rapa) 게놈의 염색체 분포가 랜덤하기 때문에, 식물에는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)의 18개 염색체와 브라시카 라파(Brassica rapa)의 0-10개 염색체를 포함한다. 따라서, 18-28 염색체를 가진 식물을 얻었다.
BC2
BC2 식물을 BC1 식물상에 종자의 착립에 의해 얻었다. 상기 BC1의 식물 B로 정한 식물의 종자 착립에서 유래된 9개 식물이 근류병에 내성이 있음이 확인되었다. 염색체 수를 확인하고, 정상 DNA 함량에서 편차를 유동세포측정기로 결정하였다. 세종류 식물 B23, B27, B28을 이 프로그램에 이용하였다.
BC3 및 BC4
BC3 및 BC4을 종자 착립에 의해 얻었다. BC2에서 이미 이배체인 식물 B27은 근류병에 대해 우성 내성 유전자를 가지고 있다. BC3와 BC4의 역교배 세대에서 예상 분리비는 1:1이다.
후세대에서 볼 수 있는 것과 같이, 식물 B23 및 B28로 내성 형질이 유전자침투되었다.
현장 테스트
BC27의 BC3의 묘종(seedling) 테스트에서 얻은 내성 형질을 가진 식물을 이용하여 예비 현장 테스트를 실시하였다. 독일 Kleve의 시험 장소에 있는 병충해가 심한 장소에 식물을 심었다. 모든 식물이 건강하게 자랐고, 다자라 수확할 때까지 질병 증상이 나타나지 않았다.
다른 브라시카 올레라체아( Brassica oleracea )로의 전이
브로콜리, 꽃양배추, 양배추, 싹양배추에서 역교배 프로그램을 이용한 방법의 근류병 내성 형질의 공급원으로 내성 B27를 이용하였고, 실시예 3의 내성 변종을 얻었다.
실시예 2
질병 테스트
pH<6에서 모래와 토탄흙 혼합물이 2:1 비율로 된 멀티포트에 파종한 후 1주일 뒤에 묘종을 옮겨심는다. 이식후 1일째에 포트에 1.106 포낭/ml 용액 1㎖을 주입한다. 용액은 ECD 코드 16/3/30, 16/23/30, 16/3/14, 16/7/30(Buczacki et al., 1975: Trans. Br. Mycol. Soc. 65. 295-303)와 근류병 공급원의 혼합물이다. 처음 2주는 흙이 젖은 상태로 유지되고, 그 다음 흙은 약간 마른다. 온실의 배양 온도는 18-20℃ 이고, 이식후 4-5주에 뿌리를 깨끗하게 씻은 후 질병에 대해 기록한다.
또는 표준 흙과 토탄 흙의 비율이 2:1 EGO이고, pH 5-6인 흙이 담긴 멀티포트 트레이에 종자를 직접 뿌린다(멀티포트당 1개 종자). 보통 계열당 20-30개 식물을 테스트한다. 파종후 약 7-10일 후에 접종하고, 제 2 접종은 제 1 접종후 2-5일 후에 실시한다. 종자의 발아가 좋지 않은 경우 블랙 트레이상에 일렬로 파종하고 식물을 7-10일 후에 멀티포트 트레이에 옮겨심는다. 배양 온도는 20-22℃ 이다.
표준 접종물은 분리체 9(독일의 감염 지역에서 분리한 활동성 균 분리체)이다. -20℃ 플라스틱 백에 보관된 감염 뿌리에서 접종균을 얻는다. 뿌리를 약 2분간 믹서에 넣는다(뿌리 1, 물 5부의 비율)
작은 입자들은 투박한 무명을 이용하여 걸러내고, 포낭(둥글고, 가벼운 약간 푸른 색을 띄는)의 수를 헤아린다. 0.5-1*107 포낭/㎖ 1㎖을 Eppendorf 피펫을 이용하여 식물의 아래 부분 줄기 또는 뿌리에 주입한다. 접종물은 현택액에 균질하게 포낭이 혼합될 수 있도록 일정하게 흔들어준다.
시험의 규모에 따라서 적절한 기준을 사용해야 한다. 민감성 대조군은 다음 것을 이용할 수 있다: White Rock(꽃양배추), Maximus 또는 다른 F1(싹양배추), Marathon(흰색 양배추). 내성 형질 대조군으로는 Parkin 또는 Storkin(중국산 양배추)를 추가할 수 있다. Hopkin(민감성 중국산 양배추)를 추가할 수도 있는데, 접종이 성공하였는 지를 초기 단계에서 알 수 있도록 해준다.
시험동안에 식물에는 충분한 양의 수분이 공급되어야 한다. 정규적으로 비옥화 작업이 필요하지만 식물이 과도하게 성장해서는 안된다. 온도는 22-20 ℃(낮/밤)이며, 조도 시간은 16시간이다.
식물에 접종 후 4주(여름)-6주(겨울)후에 식물을 뽑아내고, 세척후 증상을 기록한다.
질병의 관찰 단계별 상태는 다음과 같이 정할 수 있다.
0 = 뿌리 곤봉체 없음. 뿌리가 건강한 상태
1 = 뿌리 측면에 1-2개의 곤봉체, 가끔 뿌리 일부가 갈변됨
2 = 뿌리 측면에 몇 개 작은 곤봉체, 주근(主根)이 약간 두꺼워짐
3 = 대부분에서 주근이 두꺼워짐
4 = 주근의 두꺼워짐이 심각하며, 측면 뿌리와 유착되고, 일부 정상 뿌리도 있음
5 = 뿌리가 한 개의 곤봉체로 됨, 정상 뿌리 없음
온실 테스트에서 질병 상태 단계가 0인 식물(일부 경우에는 1이 되기도 함, 온실 테스트의 심각성 및 관련 유전자 정도에 따라 달라짐)을 근류병이 만연된 들(field De Wit in Enkhuizen)로 옮겨심는다. 보통 온실에서 옮겨심은 식물은 질병에 심각하게 감염되고, 눈으로 바로 확인할 수 있다(발육부진). 그러나, 이들은 매우 드문 식물이다.
질병 검사에 또 다른 질병 상태 관찰 단계는 다음과 같다;
1 = 눈으로 확인되는 뿌리 균혹은 없다
2 = 측면 뿌리에 한 개 균혹
3 = 측면 뿌리에 몇 개 작은 균혹(식물은 건강함)
4 = 직근(直根)에 약간의 균혹, 측면 뿌리에 몇 개 작은 균혹
5 = 직근(直根)에 중간 정도 수준의 균혹, 측면 뿌리에 많은 작은 균혹
6 = 직근(直根)에 심각한 균혹, 측면 뿌리에 매우 큰 균혹
7 = 심각한 균혹, 몇 개 건강한 뿌리가 남아있음
8 = 심각한 균혹, 건강한 뿌리가 거의 없음
9 = 심각한 균혹, 건강한 뿌리가 전혀 없음
실시예 3
현장 실습 결과
Werribee, Victoria, Australia에서 현장 실습. 2002년 1월에 근류병에 감염된 토양으로 식물을 옮겨심었다. 이식후 6주뒤에 본 발명에 따른 근류병 내성 꽃양배추 잡종(F308, F311)를 민감성 변종 (White Rock, Triumphant) 및 살진균제(Shirlane)의 양을 달리하여 처리하고, 석회를 추가(pH를 증가시켜 근류병 심각성을 감소시키는 역할)(Dixon & Page, 1998, Acta Horticulturae, 459, 343-349)시킨 민감성 변종(Triumphant)과 비교하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 하기 테스트에서는 1-9 단계별 상태를 관찰하였다.
처리 콜리(Cauli) 뿌리 0-9 단계
1. Quicklime(2.5t/ha) 4.11
2. Shilan(3L/ha) 2.33
3. Shirlan(3L/ha)+Quicklime(2.5t/ha) 2.22
4. Shirlan(2L/ha) 3.00
5. Control-Triumphant 5.06
6. F308 1.00
7. F311 1.00
8. White Rock 5.11
표 2는 오스트레일리아의 3 지역(Cora Lyn, Werribee, Trentham)에서 구한 분리체를 사용한 꽃양배추의 어린 식물 테스트 결과이다. 상기에서 설명하는 것과 필적하는 방법으로 분리체를 접종시켰다. White Rock은 민감성 대조군으로 사용하고, E70은 본 발명에 따른 내성 잡종 꽃양배추이다. 하기 테스트에서는 1-9 단계별 질병 상태를 관찰하였다.
처리 평균
Cora Lyn Werribee Trentham
White Rock 8.2 8.7 3.9
E70 1 1 1
표 3은 2년간 근류병에 자연 감염된 유럽의 여러 지역에서 현장 테스트를 실시한 결과이다. D249, D506, E245, E246는 본 발명에 따른 내성 꽃양배추 잡종이다. White Rock이 민감성 꽃양배추 변종이고, SPR666 및 A876는 본 발명에 따른 내성 브라시카 스프라우트(Brassica sprouts) 잡종이며, Romulus 및 Maximus은 민감성 브라시카 스프라우트(Brassica sprouts) 변종이고, F1 182, F1187은 본 발명에 따른 내성의 흰색 양배추 잡종이고, Marathon은 민감성 흰색 양배추 변종이다. 0-5 단계별 상태(상기 참고)를 생장 계절이 끝나는 시점에 평가(diO5)하였다.
실시예 4
분자 마커
내성 형질에 링커된 RAPD 마커는 두가지 흰색 양배추 군(D1544, D1545)을 이용하여 발생시켰다. 각 프라이머 O20 및 Y13을 이용하여 근류병 내성에 엄격히 링크된 두 개 분자 마커로 PCR 증폭 생성물을 얻었다. D1544군의 질병 테스트 결과(내성 또는 민감성)에서 O20 및 Y13는 둘다 94.6%(56개중 53개) 유관하였고, 이는 링크 거리가 5.4cM라는 것을 말한다. D1555군의 경우에, O20의 질병 테스트의 유관성은 100%이나 Y13는 95.7%(47개중 45개)이며, 이는 O20과 내성 형질간은 밀접히 링커(O cM)되어있고, Y13과 내성 형질간 4.3cM이라는 것을 나타낸다. 140개 이게s놈성반수체 흰색 양배추 군에서 RAPD 테스트하면, 질병 테스트 결과의 유관성이 O20는 100%(O cM), Y13은 98.6%(1.4 cM)로 나타났다.
프라이머 O20 (5'-ACA CAC GCT G-3')는 약 400 bp의 특이적 단편을 생산한다.
프라이머 Y13 (5'-GGG TCT CGG T-3')는 약 640 bp의 특이적 단편을 생산한다.
증폭 조건은 다음과 같다. PCR후 25㎕ DNA를 1.8% 아가로즈 겔상에서 전기영동시킨다.
PCR 프로그램:
본 발명은 질병에 내성이 있는 식물, 특히 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 관한 것이다.
근류병은 브라시카(Brassica)가 자라는 많은 지역에서 심각한 문제를 일으키는 만연한 질병이다[참조 문헌: Dixon (1999) Grower April 29, pp 29]. 근류병은 단세포 유기체인 플라시노디오포라 브라시카(Plasinodiophora brassicae)에 의해 발병한다. 근류병의 증상으로는 뿌리가 봉형으로 딱딱하게 팽창되어, 결국 썩게되는 뿌리의 기형이 포함된다. 이 질병은 또한 생장 저하로 인하여 발육이 저지되고, 물이 부족한 경우에는 잎이 시들기도 한다. 근류병은 화학적 방법으로는 효과적으로 방제할 수 없다. 따라서, 작물의 우수한 유전자 내성이 질병으로부터 작물을 보호하는데 있어서 중요하다.
브라시카(Brassicas) 속(genus)에는 상업적으로 중요한 몇 가지 종들이 포함되는데; 예를 들면 브라시카 라파(B. rapa)(중국산 양배추, 배추, 순무), 브라시카 나푸스(Brassica napus)(오일 시드, 스웨덴 순무), 브라시카 준시아(Brassica juncea) (겨자), 브라시카 니그라(Brassica nigra)(흑겨자), 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)(꽃양배추, 브로클리, 캐비지, 싹양배추, 사보이(savoy) 캐비지, 보레콜(borecole), 순무양배추, 보레콜 및 기타)등이 있다. 브라시카 속의 종에 속하는 아종은 통상 성적으로 일치(sexually compatible)하나, 브라시카 속의 다른 종간에서는 반드시 성적으로 일치하는 것것은 아니다. 예를 들면, 브라시카 라파(B. rapa) 및 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)는 동일한 수의 염색체를 가지지 않기 때문에(각 10개와 9개 염색체) 반드시 그러한 것은 아니다. 이와 같은 성질로 인하여 한 브라시카 종에서 다른 종으로 형질이 전이되기는 힘들다.
브라시카 속내에서 근류병에 내성이 되는 몇 가지 인자에 대해 설명되었다[참조 문헌: Bradshaw et al. (1997) Ann. Appl. Biol. 130:337-348; Gowers (1982) Euphytica 31:971-976]. 일부 내성은 단성(monogenic)이고, 일부는 다성(polygenic)이고, 일부는 우성이고 일부는 열성이다. 브라시카 라파(B. rapa) 및 브라시카 나푸스(B. napus)에서 단성, 우성 내성이 설명된 바 있는데, 예를 들면 브라시카 라파 중국산 양배추에서 단성 우성 내성에 대해 설명된 바 있다[참조 문헌: Yoshikawa (1983) Japan Agricultural Research Quarterly, Vol. 17, no, 1, p. 6-11]. 이와 같은 내성을 가지는 중국산 양배추 F1-잡종은 근류병으로부터 양호하게 보호되는 것으로 밝혀졌지만, 근류병 중 소수 종류('부류')는 이와 같은 내성을 극복할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 부류는 유럽보다는 아시아 지역에 더 만연한 것으로 보인다.
대조적으로, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)에서는 내성의 다성, 열성 인자에 대해 설명된 바 있다[참조 문헌: Voorrips (1995) Euphytica 83:139-146]. 이와 같은 내성 인자는 근류병에 내성을 제공하는데는 충분하지 않으며, 시판되는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 계열간에 형질 전이가 매우 어렵다는 것이 입증되었다. 이로 인하여 내성을 가지는 품종 개량은 상당히 힘들고 시간이 소요되는 작업이 된다.
따라서, 근류병에 대해 개량된 내성, 즉 내성 형질의 육종이 용이하고, 시판되는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 계열로 전이가 용이한 내성을 가지는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)가 요구된다.
따라서, 본 발명은 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)에서 근류병 에 대한 불만족스러운 내성의 문제를 해결하는 것이다. 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)에 대한 내성을 개선시키기 위해서, 본 발명은 중국산 양배추(B. rapa)로부터 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 브로콜리로 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 전이시킨 다음, 추가로 이 형질을 다른 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 예를 들면, 흰색 양배추, 꽃양배추, 싹양배추로 전이시키는 것에 관한 것이다. 브라시카 라파(B. rapa)와 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)간의 성적 불일치 문제를 해결하기 위해, 배-회생(embryo-rescue) 기술을 이용하여 이종간의 잡종화에 의해 근류병 내성 형질을 전이시킨 다음, 역교배를 반복하고, 모든 역교배 세대에서 질병에 대해 테스트하였다. 생성된 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에서 근류병에 대해 높은 수준의 내성이 수득되었다. 내성 형질은 안정적이고, 다음 세대로 유전되며, 근류병에 민감한 또는 다소 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 전이될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 단성, 우성의 근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물(당해 식물의 종자 및 물질 포함) 및 이의 후손을 제공한다. 본 발명은 또한 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 생산하는 방법, 근류병 내성 형질을 근류병에 민감한 또는 다소 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 전이시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 근류병 내성 형질에 링크된 분자 마커도 제공한다.
본 발명은, 본 발명의 내성 형질이 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 시판되는 계열간에 용이하게 전이된다는 점에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)의 기존 근류병 내성에 비하여 특히 유리하다. 내성 식물에는 질병이 발생되지 않기 때문에 수확률이 높다. 본 발명의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 재배할 때, 근류병에 대한 작물 보호용 화학물질이 훨씬 덜 요구되거나 전혀 요구되지 않는다.
본 발명은 다음과 같다:
근류병, 병원체 플라스모디포라 브라시카(Plasmodiophora brassicae)에 의해 발생한 근류병에 대한 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물 내성. 본 발명의 특정 구체예에서, 근류병 내성은 단성이며, 우성이다. 바람직하게는 실시예 2에서 설명하고 있는 1-9 단계별 질병 테스트에서 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 레벨 2 또는 그 이하로 평가된다. 바람직하게는, 실시예 2에서 설명하고 있는 1-9 단계별 질병 테스트에서 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 레벨 1로 평가된다. 바람직하게는, 실시예 2에서 설명하고 있는 0-5 단계별 질병 테스트에서 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 레벨 1 또는 그 이하로 평가된다. 바람직하게는, 실시예 2에서 설명하고 있는 0-5 단계별 질병 테스트에서 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 레벨 0로 평가된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 뿌리 털 감염에 내성이 있다. 또 다른 구체예에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 브로콜리, 흰색 양배추, 양배추, 싹양배추, 사보이, 또는 적색 양배추이다. 또 다른 구체예에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 근류병에 대해 동종접합성(homozygous) 또는 이종접합성(heterozygous)이다. 또 다른 구체예에서, 근류병에 대한 내성은 분자 마커에 유전적으로 링크되어 있다. 바람직하게는 분자 마커는 PCR 증폭을 통하여 수득할 수 있다. 적절하게는, 내성 형질은 분자 마커의 10cM내에 있고, 바람직하게는 6cM내, 좀 더 바람직하게는 5cM내, 보다 더욱 바람직하게는 3cM내, 더욱 더 바람직하게는 1.5cM내에 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 근류병 내성 형질은 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 분자 마커에 링크되어 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 내성은 근류병 내성이 있는 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물, 바람직하게는 중국산 양배추 F1 잡종 Parkin으로부터 수득할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 근류병 내성 형질은 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열로부터 수득할 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 내성 형질은 CFL667 계열로부터 유래되거거나 수득될 수 있고 또한 내성을 가지는 CFL667 계열의 선조 및 후손으로부터도 유래 또는 수득될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 식물은 근교계 또는 잡종이다. 또 다른 구체예에서, 식물은 이게놈성반수체(dihaploid)이다. 또 다른 구체예에서, 식물은 세포질 웅성 불임(cytoplasmic male sterile (CMS))이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 근류병에 내성을 부여하는 유전자좌(locus)를 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 대해 설명한다. 바람직하게는, 이 유전자좌는 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 분자 마커의 10cM(centi-Morgan)내에 있고, 바람직하게는 6cM미만, 좀 더 바람직하게는 5cM내, 보다 더욱 바람직하게는 3cM내, 좀 더 더욱 바람직하게는 1.5cM내에 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 내성 형질은 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열에 포함된 유전자좌에 상응하는 유전자좌에 있으며, 바람직하게는 CFL667계에 존재하는 내성 형질과 함께 분리된다. 바람직한 구체예에서, 근류병 내성을 부여하는 유전자좌는 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열로부터 또는 내성을 가지는 CFL667 계열의 선조 및 후손으로부터도 유래 또는 수득될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 내성 형질에 관한 유전자좌는 CFL667 계열 또는 내성을 포함하는 CFL667의 선조 또는 후손으로부터 유래 또는 수득될 수 있다.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
본 발명의 내성 형질을 포함하는, 상기에서 설명한 식물의 종자 및 식물의 후손.
상기 설명한 식물의 열매. 상기 설명한 식물의 일부분, 예를 들면 당해 식물의 꽃가루, 배주 또는 배.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물. 이때, 상기 식물이 내성에 대해 동종접합성이고 이러한 내성에 동종접합성인 식물을 단성, 우성의 근류병 내성에 대해 동종접합성인 "테스터(tester)" 식물과 교배시키는 경우에, 이 교배를 통하여 생성된 제1 세대 후손의 식물은 근류병 내성에 대해 1:0 분리비를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 제1 세대 후손의 식물이 자가수분하는 경우에, 생성된 제2 세대 후손은 근류병 내성에 대해 1:0 분리비를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, "테스터" 식물은, NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열으로부터 유래되고 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성 형질을 포함하는 식물, 또는 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 상기 CFL667의 후손 또는 조상이다. 바람직한 구체예에서, "테스터" 식물은 세포 융합을 통하여 CLF667 계의 식물 또는 CFL667 계열의 후손 식물로부터 유래된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, "테스터" 식물은 웅성 불임이다.
브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 근류병에 내성을 가지며, 이때 당해 식물이 상기 내성에 대해 이종접합성이고 상기 내성에 대해 이종접합성인 상기 식물을 우성, 단성의 근류병 내성에 대해 이종접합성인 "테스터" 식물과 교배시키는 경우, 이 교배를 통하여 생성된 제1 세대 후손의 식물은 근류병 내성에 대해 3:1 분리비를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 제1 세대 후손 식물을 내성에 대해 이종접합성인 식물과 추가로 교배하는 경우, 생성된 제2 세대 후손 식물은 근류병 내성에 대해 5:1 분리비를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, "테스터" 식물은, NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열의 식물, 또는 상기 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 CFL667의 후손 또는 조상, 또는 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열로 부터 유래되고 CFL667 계열에 포함된 단성, 우성의 근류병 내성을 포함하는 식물이다. 바람직한 구체예에서, 개별 식물의 후손을 헤아리면, 생성된 제2 세대 후손은, 제1 세대 후손의 개개의 식물 유전자 상태(각각 이종접합성 내성, 동종접합성 내성 또는 동종접합성 민감성)에 따라, 내성에 대해 3:1, 1:0 또는 1: 1 분리비를 나타낸다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 근류병에 대한 내성은 단성, 바람직하게는 우성, 단성이다. 바람직한 구체예에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 내성에 대해 동종접합성이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 내성에 대해 이종접합성이다.
본 발명은 또한 다음의 내용에 대해서도 제공한다:
본 발명의 내성 형질을 포함하는, 상기에서 설명한 식물의 종자 및 이의 후손.
상기 설명한 식물의 열매. 상기 설명한 식물의 일부분, 예를 들면 당해 식물의 꽃가루, 배주, 또는 배.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
근류병에 대한 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물 내성을 부여하기 위한, 본 발명에 따른 우성, 단성의 근류병 내성의 용도. 바람직하게는, 이와 같은 내성은 브라시카 라파(Brassica rapa), 바람직하게는 중국산 양배추 F1 잡종 Parkin에서 수득될 수 있다.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
a) 근류병에 내성인 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물을 수득하고;
b) 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물을 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 교배시키고;
c) b) 단계 교배로부터 생성된 배를 회생시키고;
d) c) 단계의 배로부터 식물을 재생시키고;
e) d) 단계의 식물로부터 근류병에 내성인 식물을 선별하고;
f) e) 단계로 부터 생산된 식물과 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)를 역교배시키는 단계를 포함하여, 근류병에 대한 우성, 단성 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 생산하는 방법.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은, 내성 형질을 엘리트(elite) 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 근교계 내로 유전자침투시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 근교계를 또 다른 근교계 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)와 교배시켜, 잡종을 만드는 것도 포함한다.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
상기 방법을 이용하여 수득할 수 있는, 잡종 식물을 포함한 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
a) 근류병에 우성, 단성 내성인 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물을 수득하고;
b) a) 단계의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 교배시키고;
c) b) 단계의 교배로 부터 근류병에 내성인 식물을 선별하는 단계를 포함하여, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 우성, 단성의 근류병 내성을 부여하는 방법.
바람직한 구체예에서, 상기 방법은 당해 내성을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물로 역교배시킴을 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은, 1-9 단계별 질병 테스트에서 레벨 4 또는 그 이상으로, 바람직하게는 레벨 3 또는 그 이상으로 평가되고, 0-5 단계별 질병 테스트에서는 레벨 3 또는 그 이상으로, 바람직하게는 레벨 2 또는 그 이상으로 평가된다.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
브라시카(Brassica) 게놈에서 증폭시킨, 길이가 약 400bp이고, 서열번호 1을 포함하는 DNA 단편.
브라시카(Brassica) 게놈에서 증폭시킨, 길이가 약 640bp이고, 서열번호 2를 포함하는 DNA 단편.
바람직한 구체예에서, 상기에서 설명하는 DNA 단편은 브라시카(Brassica) 식물에서 근류병에 대한 우성, 단성 내성의 존재를 나타내는 것이다.
근류병에 내성인 브라시카(Brassica) 식물을 확인하기 위한 상기 설명한 DNA 단편의 용도.
브라시카(Brassica) 게놈에서 약 400 bp의 DNA 단편을 검출하기 위한 프라이머 O20(서열번호 1)의 용도.
브라시카(Brassica) 게놈에서 약 640 bp의 DNA 단편을 검출하기 위한 프라이머 Y13(서열번호 2)의 용도.
근류병에 내성이 있는 브라시카(Brassica) 식물을 확인하기 위한 프라이머 O20 또는 Y13의 용도.
바람직한 구체예에서, 브라시카(Brassica) 식물은 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)이다.
서열번호 1 또는 서열번호 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에서 근류병에 대한 우성, 단성 내성을 검출하기 위한 키트.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
a) 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 수득하고;
b) a) 단계의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 교배시키고;
c) PCR 증폭에 의해 수득가능하고 내성 형질과 함께 분리되는 DNA 단편을 포함하는 식물을 선별하는 단계를 포함하여, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 우성, 단성의 근류병 내성 형질을 전이시키는 방법.
바람직하게는, DNA 단편은 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호 2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 바람직하게는, c) 단계의 식물은 근류병에 내성이 있다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물 속에 상기 내성 형질을 역교배시키는 것을 포함한다.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
a) 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에서 샘플을 수득하고;
b) 샘플에서 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호 2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 DNA 단편을 검출(이때 b) 단계의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 근류병에 내성이 있다)하는 단계를 포함하여, 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 확인하는 방법.
본 발명은 다음의 내용에 대해서도 설명한다:
a) 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물군을 제공하고;
b) 식물군의 식물에서 샘플을 수득하고;
c) 샘플에서 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호 2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 DNA 단편을 검출(이때, b) 단계의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 근류병에 내성이 있다)하는 단계를 포함하여, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물군으로부터 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 선별하는 방법.
정의
형질: 특징 또는 표현형, 예를 들면 질병에 대한 내성. 형질은 열성 또는 우성적으로 유전되거나 단성 또는 다성일 수 있다. 형질은 예를 들면, 근류병과 같은 질병에 대한 내성이다.
내성: 질병의 증상이 없거나 미약한 증상을 나타내는 식물의 특징 또는 표현형. 따라서, 내성은 병원체의 발생을 감소시킬 수 있는 식물의 능력이다[참조 문헌: Robinson, R.A., 1969: Review Applied Mycology 48, 593-606].
단성: 단일 유전자좌에 의해 결정됨.
다성: 한 개 이상의 유전자좌에 의해 결정됨.
우성: 이종접합성 또는 동종접합성 상태에서 나타나는 표현형을 결정.
열성: 동종접합성 상태에서만 나타남.
유전자좌: 한 개 이상의 유전 인자를 포함하는 염색체상의 영역, 예를 들면, 질병에 대한 내성과 같은 형질에 기여하는 한 개 또는 여러 개의 유전자.
유전적 링크: 동일 염색체상에 위치하여 함께 유전되는 염색체 영역의 경향. 유전자좌간의 재조합 %로 측정(centiMorgan, cM).
동질(isogenic): 이종 DNA 서열의 유무에 의해서만 상이한 점을 제외하고는 유전자적으로 동일한 식물.
마커를 이용한 선별: 식물에서 한 개 이상의 목적하는 형질과 링크된 핵산을 검출하여 식물(들)에서 목적하는 형질(들)을 선별하는 과정을 말한다.
이게놈성반수체(Dihaploid): 완전한 동종접합성 식물을 제공하는, 게놈의 반수체(단일 염색체) 상태의 배가(예를 들면, 약 배양(anther culture) 또는 마이크로스포어 배양을 이용).
"테스터" 식물: 테스트할 식물에서 형질을 유전학적으로 특징화시키는데 이용되는 식물. 일반적으로 테스트할 식물을 "테스터" 식물과 교배시키고, 교배의 후손에서 형질의 분리 비율을 기록한다.
본 발명은 근류병 질병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물, 좀더 구체적으로는 플라스모디포라 브라시카 병원체로 인한 근류병 질병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 기술한다. 특히, 본 발명은 상기 질병에 대한 단성, 우성 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 기술한다. 이러한 내성은 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)에서의 기존의 내성과 비교하였을 때, 상기 질병에 대한 개선된 내성을 제공하고, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물간에 용이하게 전이될 수 있다.
브라시카 종 및 아종은 참조 문헌[P.H. Williams, Screening Crucifers for multiple disease resistance, Workshop 1981, Un. Wisconsin-Madison]에 기재되어 있고, 참조 문헌[Song, KM et al. TAG 75, 1988, 784-794; TAG 76, 1988, 593-600 and TAG 79, 1990, 497-506 (Series of 3 articles)]에서 유전적으로 분석되었다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물의 예시는 다음과 같다:
브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) L. (서양평지-작물)
변종 아세파라(acephala) DC. (케일)
변종 알비플로라(albiflora) Sun[= B. alboglabra](중국산 케일)
변종 알보글라브라(alboglabra)[= B. alboglabra](중국산 케일)
변종 보트리티스(botrytis) L.(꽃양배추, 헤딩 브로콜리)
변종 카피타타(capitata) L.(캐비지)
변종 취넨시스(chinensis) Prain(버마 sarson)
변종 핌브리아타(fimbriata) Mill(키친 케일)
변종 후르티코사(fruticosa) Metz.(사우젼드-헤드 케일)
변종 제닌리페라(geninlifera) DC.(싹양배추)
변종 곤지로드스(gongylodes) L.(순무양배추)
변종 이탈리카(italica) Plenck.(브로콜리, 카라브레스)
변종 사바우다(sabauda) L.(사보이 캐비지)
변종 사벨리카(sabellica)(콜라드)
변종 트론추타(tronchuda) L.H. Bailey(트론추타 캐비지)
변종 코스타타(costata)(포르투갈 캐비지)
변종 메듈로사(medullosa)(매로우 스템 케일)
변종 파이니폴리아(painifolia)(케일, 져지 케일)
변종 레이노사(raynosa)(사우젼드-헤드 케일)
변종 셀렌시아(selensia)(보렌콜)
본 발명의 바람직한 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 흰색 양배추, 꽃양배추, 싹양배추, 브로콜리이다.
본 발명에 따라, 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 중국산 양배추(B. rapa)로부터 브로콜리(Brassica oleracea)로 전이시킨다. 자성 모본 식물인 브로콜리(Brassica oleracea 변종 이탈리카(italica))와 웅성 모본인 브라시카 라파(B. rapa) 간의 종간 잡종화를 수행하였다.
브로콜리 근교계를 자성 모본으로 선택하여, 교배의 최종 산물에서 상이한 기원의 세포 소기관을 방지한다. 이종간 교배에서 웅성 모본은 "Parkin" 상표(Takii Seeds, Japan)로 일본에서 시판되는 근류병 내성을 가지는 중국산 양배추 F1 잡종이다. 교배 또는 역교배 후에, 수득된 식물의 염색체를 계수하여 식물의 배수성 수준을 평가하고, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 염색체 세트의 수득을 위한 단계를 평가하였다. 참조 문헌[Chiang et al. (1979) Euphytica 28: 41]에서 설명하는 방법에 따라 염색체 계수를 수행하였다. Partec CA Ⅱ(Partech, UK)을 이용하여 유동 세포측정(flow cytometer) 작업을 수행하였다.
교배로 생긴 F1 잡종을 배-회생(embryo rescue)에 의해 수득할 수 있었다. 브라시카 라파(B. rapa) 및 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)는 염색체 수가 동일하지 않으므로, 성적으로 일치하지 않기 때문에, 배-회생 방법이 이용되어야 하였다. 배-회생법은 배유가 분해되는 문제를 극복할 수 있다. 참조 문헌: Harbert et al. (Euphytica 18 (1969) p. 425-429]에서 설명하는 배-회생법을 이용하였다. 수분후에 10-12일령의 멸균된 배주를 반으로 가르고, 일정하게 움직이는 배양 배지에 넣는다. 배양 배지는 기본적으로 White's 배지이나, 8% 슈크로즈 및 400ppm 카세인 가수분해물이 추가된다. 배주에서 배를 씻어내고, 액상배지에 생장시킨다.
근류병 내성 F1 식물을 브로콜리와 교배시켰다(즉, 역교배). 상기한 배-회생법이 처음 역교배로부터 생성된 식물(즉, BC1 식물)을 수득하는데 요구되었다.
근류병에 내성이 있는 BC1 식물을 다시 브로콜리와 역교배시키고, 통상의 종자 착립에 의해 세 종류의 근류병 내성 BC2 식물이 수득되었다. 식물을 추가로 브로콜리와 역교배시키고, 4번째 역교배에서 얻어진 식물(BC4)을 다른 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 작물에 대한 내성 형질의 공급원으로 이용하였다.
실시예 1에서는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)에 근류병 내성을 전이시킬 수 있는 상세한 실험 프로토콜을 설명한다. 실시예 2에서는 내성 형질의 존재에 대해 테스트하는데 이용되는 질병 테스트에 대해 설명한다. 실시예 3에서는 근류병 내성을 입증하는 현장 실습 결과를 나타내었다.
본 발명에 따른 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 포함하는 대표적인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)인 CFL667 계열은 2002년 6월 28일자로 NCIMB[Aberdeen AB2 1RY, Scotland, UK]에 수탁번호 NCB4B 41134로 기탁되었다. CFL667 계열 식물은 세포질 웅성 불임 계열로 내성 형질에 대해 이종접합성이다.
따라서, 본 발명에 따른 근류병 내성 형질은 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 본원의 실시예 2의 0-5 단계에서 0 또는 1 등급으로 평가되거나, 또는 실시예 2의 1-9 단계에서 1 또는 2등급으로 평가된 식물로서 정의된다.
브라시카 분야에 익히 공지된 표준 육종 기술을 이용하여, 근류병 내성 형질은 다른 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea), 특히 흰색 양배추, 꽃양배추, 싹양배추로 전이시켰다. 또한 상기 형질을 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 엘리트 계열 속에 유전자침투시켰다. 엘리트 계열 속에 내성 형질을 유전자침투시키는 것은 역교배와 같은 반복적 선별 육종을 통하여 성취될 수 있다. 이와 같은 경우에 엘리트 계열(반복 모본)(recurrent parent)을 우선 내성 형질을 가진 공여체(donor) 근교계(비-반복 모본)와 교배시킨다. 이 교배에 의한 후손을 반복 모본과 다시 교배시킨 후, 근류병 내성에 대해 생성 후손에서 선별한다. 근류병 내성에 대한 선별하에, 반복 모본과의 역교배의 3, 4, 보다 바람직하게는 5 이상의 세대 후, 후손은 내성을 가지는 유전자좌에 대해 이종접합성이나, 대부분 또는 거의 모든 다른 유전자에 대해서는 반복 모본과 같다[참조 문헌: Poehlman & Sleper (I 995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1. Theory and Technique, 360-376(이는 참조로서 본원에 인용된다]. 각 교배후에 근류병 내성에 대해 선별작업을 수행한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)로 전이시키는 방법이 포함되는데, 그 방법은 다음의 단계를 포함한다: 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 제1 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 제2 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 교배시키고, 이러한 교배로 부터 생성된 근류병에 내성이 있는 식물을 선택한다. 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은, 1-9 단계별 질병 테스트에서 4 또는 그 이상으로, 바람직하게는 3 또는 그 이상으로 평가되고, 0-5 단계별 질병 테스트에서 3 또는 그 이상으로, 바람직하게는 2 또는 그 이상으로 평가된다. 이 방법은, 내성 형질이 제2 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물로 전이될 때까지, 상기 선별된 식물을 제2 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 역교배시킴을 포함한다.
바람직하게는, 근류병 내성 형질을 시판되는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 계로 전이시킨다. 이와 같은 계열은 근교계이다. 또는, 시판 계열은 두 종의 근교계를 교배시켜 수득한 잡종이다. 이 경우에, 근류병 내성 형질은 모본 근교계중 하나에 있거나 둘다에 있을 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 포함하는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea)의 근교계 또는 잡종 계열(이러한 근교계 또는 잡종의 종자 및 물질 포함) 및 이의 후손 식물을 기술한다. 내성 형질은 브라시카 라파(B. rapa), 바람직하게는 중국산 양배추 F1 잡종 "Perkin"으로부터 수득할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 근류병 내성 형질은 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열에 존재한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 근류병 내성 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물은 웅성 불임이다. 정상 꽃은 자가수분하기 때문에 웅성 불임은 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 잡종 종자 육종에 가치가 있다. 웅성 불임 식물은 생존 화분을 생성하지 못하고, 자가수분을 할 수 없다. 교배에서 한쪽 모본 변종의 화분을 제거함으로써, 식물 육종업자는 균일한 품질의 잡종 종자를 확실히 수득할 수 있다. 세포질 웅성 불임(CMS)이 특히 유용한 웅성 불임 시스템이다. 브라시카에서 이러한 CMS의 예시로 무우에서 처음 발견된 Ogura CMS가 있다[참조 문헌: Ogura (1968) Mern. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 6: 39-78; Makaroff (1989) Journal of Biol. Chem. 264: 11706-11713; US 5,254,802]. 따라서, 본 발명은 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 포함하는 불임 특히, CMS, 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물(당해 식물의 종자 및 물질 포함) 및 이의 후손을 기술한다. 바람직하게는, 내성 형질은 브라시카 라파(B. rapa), 바람직하게는 중국산 양배추 F1 잡종 "Parkin"으로부터 수득할 수 있다. 바람직하게는, CMS는 Ogura 게놈으로부터 유래된다.
당업계에 익히 공지된 방법을 이용하여 웅성 불임 식물의 웅성 가임력을 회복시킬 수 있다. CMS 식물, 특히 CMS 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물의 가임성을, 세포 융합을 이용하여 적절하게 회복시킨다. 이를 위해서, CMS 식물 세포를 웅성 가임 식물의 세포와 융합시켜, 가임 식물 세포질 배경에서 불임 식물의 핵을 가임 식물의 핵으로 대체시켜 가임력을 회복시킨다. 세포 융합 기술은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들면 참조 문헌[Sigareva and Earle (1997) Theor. Appl. Genet. 94: 213]에 기재되어 있다. 이와 같은 세포 융합 기술을 이용하여, 웅성 불임 식물을 재생시킬 수 있고, 자가수분하거나 다른 식물과 교배시킬 수 있다.
형질, 특히 질병에 대한 내성과 같이 기록가능한 표현형과 같은 특정 형질은 교배를 통하여 유전적으로 전달될 수 있고, 형질 분리는 교배로 부터 생성된 후손에서 기록될 수 있다. 이로써, 형질이 우성인지 열성인지를 결정할 수도 있다. 또한 형질의 유전 인자가 동일한 유전자좌(동일 유전자(들) 또는 상이한 유전자, 또는 동일 대립형질 또는 상이한 대립형질)에 있는 지 또는 링크되거나 되지 않은 상이한 유전자좌에 있는 지를 결정할 수도 있다.
예를 들면, 특정 형질에 대해 동종 접합성 식물을 동일한 표현형을 가지는 우성 형질에 대해 동종 접합성인 "테스터" 식물과 교배하였을 때, 교배후 후손은 형질의 표현형에 대해 분리되지 않는다(1:0 비율). 형질의 유전 인자가 동일 유전자좌 또는 상이한 유전자좌에 있는 경우에, 1:0 비율로 기록된다. 상기 교배의 제1 세대 후손 식물이 자가수분하는 경우에 테스트할 식물과 "테스터" 식물에서 동일 유전자좌의 유전 인자에 근거하여 우성 형질에 대해 1:0 비가 관찰된다. 대조적으로, 테스트할 식물과 "테스터" 식물에서 링크안된 상이한 유전자좌의 유전 인자에 근거하여 우성 형질에 대해 15:1 비가 관찰된다. 유전 인자가 상이한 유전자좌에 있으나 유전적으로 링크된 경우에, 분리 비는 일반적으로 1:0과 15:1 사이이다.
또 다른 실시예에서, 우성 형질에 대해 이종접합성인 테스트할 식물을 동일한 표현형을 가지는 우성 형질에 대해 이종접합성인 "테스터" 식물과 교배하면, 교배 후손은 내성 표현형에 대해 3:1로 분리된다. 형질의 유전인자가 동일한 유전자좌 또는 상이한 유전자좌에 있는 경우에, 3:1 비가 기록된다. 상기 교배의 제1 세대 후손 식물을 "테스터" 계열 식물과 교배하거나 다시 형질에 이종접합성인 테스트할 식물과 교배시키는 경우에, 동일 유전자좌의 유전 인자에 근거하여 우성 형질에 대해 3:1 비가 관찰되는 반면, 링크안된 상이한 유전자좌의 유전 인자에 근거한 우성 형질에 대해 23:9 비가 관찰된다. 두 유전 인자가 상이하나 유전적으로 링크된 유전자좌에 있는 경우에, 분리비는 일반적으로 상기 두 비사이에 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 개별 식물의 제 2 세대 후손을 별도로 분석하였다. 이 경우에, 동일 유전자좌의 유전 인자에 대해 이종접합성 식물과 교배하였을 때, 제2 세대 후손 식물의 50%는 3:1, 25%는 1:0, 그리고 나머지 25%는 1:1로 분리된다. 테스트할 식물의 링크안된 유전 인자를 사용하는 경우에, 2세대에서 후손 식물의 50%는 3:1, 25%는 7:1, 그리고 나머지 25%는 1:1로 분리된다(제 2 세대에서 내성에 대해 고정된 식물은 없다).
형질이 질병에 내성이고, 질병 테스트를 하면 민감한 식물은 죽거나 민감한 식물이 개화를 하지 못한다면, 민감성 제1 세대 후손 식물의 죽음 또는 부족으로 인하여 제 2 세대 후손에서는 상이한 분리비가 기록된다. 예를 들면, 이와 같은 경우에, 상기 3:1 및 23:9 대신에, 5:1 및 19:5의 비가 관찰된다. 개개의 식물을 기록하는 경우에, 제2 세대 후손은 동일한 유전자좌의 유전 인자에 대해 는 2/3가 3:l 이고 1/3이 1:0 이며, 상이한 유전자좌의 유전 인자에 대해 2/3는 3:1이고 1/3은 7:1이다.
다른 교배 전략을 이용할 수도 있는데 예를 들면, 동종접합성 또는 이종접합성 식물의 다른 조합 또는 형질을 포함하지 않는 식물을 이용할 수 있다. 후손에서 형질의 분리비를 기록한다. 이와 같은 교배 전략 및 이에 상응하는 분리비는 당업자에 공지된 것으로, 당업자는 적절한 "테스터" 식물을 어떻게 얻고 이용하는지, 그리고 이러한 교배로부터 얻은 분리비를 어떻게 해석해야하는 지를 알고 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기에서 설명하는 교배 과정을 본 발명의 근류병 내성에도 적용시킨다. 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 근류병 내성에 대해 동종접합성 또는 이종접합성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 대해 설명하는데, 이때 근류병 내성이 테스트되는 식물에서는 동종접합성이고, 테스트되는 식물을 근류병 내성에 대해 동종접합성인 "테스터" 식물과 교배시키는 경우에, 상기 교배의 제1 세대 후손은 근류병 내성에 대해 분리비가 1:0 이다. 이와 같은 교배에서 "테스터" 식물은, 예를 들면 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열에서 유래되고 본 발명의 내성 형질을 포함하는 식물이다. 바람직한 구체예에서, "테스터" 식물은 CFL667계 식물에서 유래되거나 CFL667계 식물의 후손으로부터 세포 융합을 통하여 유래될 수 있다. 본 발명의 내성을 포함하는 다른 가임 식물을 "테스터" 식물로 사용할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 제1 세대 후손의 식물이 자가수분할 수 있는 경우에, 생성된 제2 세대 후손은 내성에 대해 분리비가 1:0로 나타난다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제1 세대 후손 식물이 자가수분할 수 있는 경우에, 생성된 제2 세대 후손은 내성에 대해 분리비가 15:1로 나타난다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 자가수분 후에 제2 세대 후손에서 분리비는 1:0 내지 15:1로 기록된다. 따라서, 분리비에 근거하여, 테스트되는 식물의 내성 및 "테스터" 식물의 내성이 동일한 유전자좌 또는 링크되거나 되지 않은 상이한 유전자좌에 있는 지를 결정한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 근류병 내성에 대해 동종접합성 또는 이종접합성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물을 기술하는데, 이때 근류병 내성이 테스트할 식물에서 이종접합성이고, 테스트할 식물을 근류병 내성에 대해 이종접합성인 "테스터" 식물과 교배시키는 경우에, 교배 제 1 세대 후손은 근류병 내성에 대해 3:1 분리비를 나타낸다. 이와 같은 교배에 이용되는 "테스터" 식물은, 예를 들면 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열의 식물, 또는 본 발명에 따른 내성을 포함하는 CFL667 계열 식물의 후손이 될 수 있다. 본 발명의 내성 형질을 포함하는 모든 다른 식물을 "테스터" 식물로 이용할 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 제1 세대 후손 식물을 내성에 이종접합성인 테스트받을 식물과 교배하는 경우에, 생성되는 제2 세대 후손은 내성에 대한 분리비가 3:1로 나타난다.
그러나, 민김한 식물은 근류병 내성에 대한 질병 테스트에서 일반적으로 생존할 수 없거나 이와 같은 테스트후에 개화가 되지 않기 때문에, 제2 세대 후손의 분리비는 5:1로 나타난다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제1 세대 후손의 식물을 "테스터" 계열의 식물과 추가로 교배하면, 생성되는 제2 세대 후손은 내성에 대해 분리비가 23:9로 나타날 것으로 기대되었으나, 일반적으로 19:5의 분리비를 나타낸다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제2 세대 후손에서 분리비는 5:1 내지 19:5로 기록된다. 개개 식물의 후손을 별도로 기록하는 경우에, 상기 설명한 비가 관찰된다. 따라서, 분리비에 근거하여, 테스트할 식물의 내성과 "테스터" 식물의 내성이 동일 유전자좌에 있는지 또는 링크되거나 되지 않은 상이한 유전자좌에 있는 지를 결정한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은, 단성, 우성의 근류병 내성 형질에 링크된 분자 마커에 대해 설명한다. 이와 같은 분자 마커는 내성 식물과 민감성 식물을 분자 수준에서 차별화시킬 수 있으므로, 브라시카, 특히 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에서 단성, 우성 내성이 있다는 것을 나타낸다. 이와 같은 분자 마커는 내성 식물과 민감성 식물간의 유전적 다형성에 근거한 것으로써, 내성 형질 유전자좌에 또는 매우 가까이에 위치한다. 분자 마커는 예를 들면 내성 식물을 육종하고 수득하거나, 육종 동안에 내성 형질의 존재를 추적하거나, 시판되는 종자에 내성의 존재를 조절하는데 이용될 수도 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서 본 발명은 브라시카 식물, 적절하게는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에서 근류병 내성을 매핑하는 방법; 브라시카 식물, 적절하게는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물에 내성 형질이 있는 지를 결정하는 방법; 질병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 식물, 바람직하게는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물로 내성 형질을 전이시키는 방법을 제공한다. 예를 들면 상기 방법들을 이용하여 새로운 내성 식물 또는 계열을 육종하거나 종자의 품질을 관리할 수 있다. 본원에서 설명하는 분자 마커를 이용하면 내성 계열 식물을 신속하게 시장으로 출하시킬 수도 있고 시판되는 종자의 품질 관리를 더 잘할 수도 있다. 질병 검사를 피하고 분자 마커를 사용하여 대체할 수 있다.
본 발명의 분자 마커와 방법은 육종 프로그램 및 종자 생산 공정에서와 같이 상업적 변종을 유도하는 다양한 단계에서 특히 유익하다. 예를 들면 본 발명을 이용하여 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물, 예를 들면 엘리트 근교계 속에 내성 형질을 유전자침투시킬 수 있다. 근류병 내성 형질의 선별은 각 교배로부터 생산된 종자 또는 식물을 분자 마커로 테스트하여 수행한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 단성, 우성의 근류병 내성 형질을 당해 질병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물로 전이시키는 방법도 포함하는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다: 질병에 내성이 있는 제1 식물을 질병에 민감한 또는 덜 내성인 식물과 교배시키고, 교배에서 얻은 종자를 수확하고, 종자 샘플 또는 종자에서 자란 식물의 샘플을 수득하고, 샘플에서 본 발명의 분자 마커를 검출(이때, 본 발명의 분자 마커의 존재는 종자 또는 식물에 내성 형질이 있다는 것을 나타낸다)하고, 분자 마커의 존재에 대해 양성인 식물(이때, 식물은 바람직하게는 질병에 내성을 가진다)을 선별한다. 바람직하게는, 내성 형질을 질병에 민감한 또는 덜 내성인 식물과 추가로 역교배시킨다.
본 발명의 분자 마커는 안정적인 동종 근교계 또는 재배종(가끔 변종이라고도 함)을 만드는데 편리하게 이용될 수 있으므로, 특정 계열이 만족할만한 순도 및 균질성을 가질 때 까지 자가수분시킨다. 본 발명을 특정 계열 또는 재배종의 시판용 종자를 만들 때 유사하게 이용할 수도 있다. 각 교배 후에, 본 발명의 방법을 교배후 얻은 종자에 적용하여 내성 식물만을 선별한다. 바람직한 구체예에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 근류병 내성 종자 또는 식물을 만드는 방법도 포함한다: 내성 식물을 자가 교배시키고, 교배로 얻은 종자를 수득하고, 종자의 샘플 또는 종자에서 자란 식물의 샘플을 얻고, 샘플에서 본 발명의 분자 마커를 검출(이때, 분자 마커의 존재는 종자 또는 식물에 질병 내성 형질이 있다는 것을 말한다)한다.
유사하게, 본 발명을 잡종 종자 생산에 이용한다. 이 경우, 본 발명을 이용하여, 현장에서 발아하여 성장된 모든 잡종 종자는 질병에 내성이 있다는 것을 확인한다. 바람직하게는, 본 발명의 분자 마커를 이용하여, 질병 내성 형질이 잡종 종자에 존재한다는 것을 보증하는 품질 보증에도 이용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 제1 식물과 제 2 식물(이때 두 식물중 하나는 근류병에 내성이 있다)을 교배하고, 교배로부터 생성된 종자를 수확하고, 종자의 샘플 또는 종자에서 자란 식물의 샘플을 얻고, 샘플에서 본 발명의 분자 마커를 검출(이때, 분자 마커의 존재는 종자 또는 식물에 질병 내성 형질이 있다는 것을 말한다)하는 단계를 포함하여, 종자를 만드는 방법도 포함한다. 본 발명은 상업 육종 및 종자 생산 과정에 상당한 장점을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 분자 마커는 근류병 내성 형질의 유전자좌로부터 10cM(centi-Morgan)내에 있고, 적절하게는 6cM내, 좀더 바람직하게는 5cM내, 바람직하게는 3cM내, 좀더 적절하게는 1.5cM내에 있어, 내성 형질과 반드시 함께 분리된다.
본 발명 내용에서 바람직한 다형성의 예는 단일 서열 반복체(SSR)[참조문헌: Hearne et al. (1992) Trends Genet 8:288-294], 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)[참조 문헌: Botstein B et al. (1980) Am J Hum Genet 32:314-331], 결실, 증폭, 교차와 같은 기타 유형의 DNA 재배열을 포함한다.
당분야에 공지된 다형성을 검출하는 방법을 본 발명에 적용시켜 내성 형질에 링크된 분자 마커를 만들 수 있다. 바람직한 방법에는 PCR 증폭 기술을 이용하는 방법, 예를 들면, SSR 기술 및 RAPD 기술(Williams et al. (1990) Nucl Acids Res 18:65316535)이 포함된다. 일반적으로 PCR에 적절한 올리고뉴클레오티드의 길이는 약 8 내지 50nt, 좀더 바람직하게는 10 내지 30nt이다. 본 발명의 다형성을 포함하는 부위를 포함하는 PCR 증폭된 DNA 단편의 길이는 바람직하게는 약 100-3,000nt, 좀더 바람직하게는 약 200 내지 2,000nt, 가장 바람직하게는 약 300 내지 1,000nt이다. 본 발명에 적용시킬 수 있는 다형성을 검출하거나 또는 선별하는 다른 방법은 핵산의 직접적 서열분석, 일본쇄 다형성 검정, 리가제 연쇄 반응, 효소에 의한 절단, 서던 하이브리드화 반응을 포함한다.
또 다른 방법에는 절단 증폭된 다형성 서열(CAPS; Konieczny et al., The Plant Journal 4(2):403-410, 1993)을 검출하는 방법 및 dCAPS으로도 공지된 절단 증폭된 변형 다형성 서열에 대해 "CAMPS"로 명명된 방법(Neff et al, 1998. Plant J. 14. 387-392; Michaels and Arnasino, 1998. Plant J 14: 381-385)으로 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 검출하는 방법 등 몇몇이 포함된다. CAPS 방법에서, 제한 부위에 접한 프라이머를 이용하여 다형성 제한 부위를 함유하는 핵산을 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 다형성 제한 부위에 상응하는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 절단된 생성물을 겔 전기영동을 이용하여 분석하였다.
서던 하이브리드화 방법은, 특히 RFLP(제한 단편 길이 다형성) 기술(Botstein B et al. (1980) Am J Hum Genet 32:314-331)을 이용하여, 서열에서 상이한 부분을 확인하는데 효과적인 방법이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 RAPD 기술(실시예 4)을 이용하여 수득한 근류병 내성 형질에 밀접하게 링크된 분자 마커에 대해 설명한다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 제공되는 것이다. 다음의 실시예로 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니다.
본원에서 인용된 모든 참조 문헌은 이의 전문이 참조로 인용된다.
<110> Syngenta Participations AG <120> Clubroot resistant Brassica oleracea plants <130> 70059WO_PCT <150> GB 0217406.8 <151> 2002-07-26 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 acacacgctg 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 gggtctcggt 10

Claims (45)

  1. 단성, 우성의 근류병 내성을 가지는 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물.
  2. 제1항에 있어서, 1-9 단계별 질병 테스트에서 레벨 2 또는 그 이하로 평가되거나 0-5 단계별 질병 테스트에서 1 또는 그 이하 레벨로 평가되는 브라시카 올레라체아 식물.
  3. 제1항에 있어서, 1-9 단계별 질병 테스트에서 레벨 1로 평가되거나 0-5 단계별 질병 테스트에서 레벨 0으로 평가되는 브라시카 올레라체아 식물.
  4. 제1항에 있어서, 브로콜리, 흰색 양배추, 꽃양배추, 싹양배추, 보로콜, 사보이, 또는 적색 양배추인 브라시카 올레라체아 식물.
  5. 제1항에 있어서, 내성 형질이 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있는 분자 마커에 링크된 식물.
  6. 제1항에 있어서, 프라이머 O20 (서열번호 1) 또는 프라이머 Y13 (서열번호 2)를 이용한 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있는 분자 마커에 링크된 식물.
  7. 제5항에 있어서, 내성 형질이 분자 마커의 10cM내에 위치하는 식물.
  8. 제5항에 있어서, 내성 형질이 분자 마커의 6cM내에 위치하는 식물.
  9. 제1항에 있어서, 내성이 근류병에 내성이 있는 브라시카 라파(B. rapa) 식물에서 수득될 수 있는 식물.
  10. 제1항에 있어서, 내성이 중국산 양배추 F1 잡종 Parkin에서 수득되는 식물.
  11. 단성, 우성의 근류병 내성을 부여하는 유전자좌를 포함하는 브라시카 올레라체아 식물.
  12. 근류병에 내성을 가진 브라시카 올레라체아 식물에 있어서,
    a) 당해 식물이 근류병 내성에 대해 동종접합성이고, 이러한 내성에 대해 동종접합성인 당해 식물을 단성, 우성의 근류병 내성에 대해 동종접합성인 "테스터" 식물과 교배시키는 경우, 교배후 제1 세대 후손 식물은 근류병 내성에 대해 1:0 분리비를 나타내고;
    b) 제1 세대 후손 식물을 자가수분시키는 경우, 생성된 제2 세대 후손 식물은 근류병 내성에 대해 1:0 분리비를 나타내는, 근류병에 내성을 가진 브라시카 올레라체아 식물.
  13. 제12항에 있어서, "테스터" 식물이, NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열으로부터 유래되고 상기 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 식물, 또는 상기 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 상기 CFL667 계열의 후손 또는 조상인, 브라시카 올레라체아 식물.
  14. 근류병 내성에 이종접합성이고, 이러한 내성에 대해 이종접합성인 당해 식물을 단성, 우성의 근류병 내성에 대해 이종접합성인 "테스터" 식물과 교배시키는 경우, 교배로 부터 생성된 제1 세대 후손 식물이 근류병 내성에 대해 3:1 분리비를 나타내는, 근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아 식물.
  15. 제14항에 있어서, 제1 세대 후손의 식물을 근류병 내성에 대해 이종접합성인 식물과 추가 교배시키는 경우, 생성된 제 2 세대 후손 식물이 근류병 내성에 대해 5:1 분리비를 나타내는 브라시카 올레라체아 식물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, "테스터" 식물이 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 CFL667 계열의 식물, 또는 상기 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 상기 CFL667 계열의 후손 또는 조상, 또는 상기 CFL667 계열에 포함된 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하고 NCIMB에 수탁번호 NCIMB 41134로 기탁된 상기 CFL667 계열로 부터 유래된 식물인, 브라시카 올레라체아 식물.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 근류병 내성에 동종접합성인 브라시카 올레라체아 식물.
  18. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 근류병 내성에 이종접합성인 브라시카 올레라체아 식물.
  19. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 근교계 또는 이게놈성반수체인 브라시카 올레라체아 식물.
  20. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 잡종인 브라시카 올레라체아 식물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 세포질 웅성 불임인 브라시카 올레라체아 식물.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따른 식물의 종자.
  23. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따른 식물의 열매 또는 일부분.
  24. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따른 식물의 화분, 배주 또는 배인 식물의 일부분.
  25. 근류병에 대한 브라시카 올레라체아 식물 내성을 부여하는데 있어서 단성, 우성의 근류병 내성의 용도.
  26. 제25항에 있어서, 내성이 중국산 양배추 F1 잡종 Parkin에서 수득될 수 있는 용도.
  27. a) 근류병에 내성인 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물을 수득하고;
    b) 상기 브라시카 라파(Brassica rapa) 식물을 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 교배시키고;
    c) b) 단계 교배로부터 생성된 배를 회생시키고;
    d) c) 단계의 배로부터 식물을 재생시키고;
    e) d) 단계의 식물로부터 근류병에 내성인 식물을 선별하고;
    f) e) 단계로 부터 생성된 식물을 브라시카 올레라체아(Brassica oleracea) 식물과 역교배시키는 단계를 포함하는, 단성, 우성의 근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아 식물을 생성하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 내성 형질을 엘리트 브라시카 올레라체아 근교계로 유전자침투시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 근교계를 또 다른 브라시카 올레라체아 근교계와 교배시켜, 잡종을 만드는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 브라시카 올레라체아 식물.
  31. a) 근류병에 단성, 우성 내성인 브라시카 올레라체아 식물을 수득하고;
    b) a) 단계의 브라시카 올레라체아 식물을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물과 교배시키고;
    c) b) 단계의 교배로부터 근류병에 내성인 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물에 우성, 단성의 근류병 내성을 전이시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 내성 형질을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물에 역교배시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 브라시카 게놈에서 증폭시킨, 길이가 약 400bp이고 서열번호 1를 포함하는 DNA 단편.
  34. 브라시카 게놈에서 증폭시킨, 길이가 약 640bp이고 서열번호 2를 포함하는 DNA 단편.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 브라시카 식물에서 단성, 우성의 근류병 내성의 존재를 나타내는 DNA 단편.
  36. 근류병에 내성이 있는 브라시카 식물을 확인하는데 있어서 제33항 또는 제34항에 따른 DNA 단편의 용도.
  37. 브라시카 게놈에서 약 400 bp의 DNA 단편을 검출하는데 있어서 프라이머 O20(서열번호 1)의 용도.
  38. 브라시카 게놈에서 약 640 bp의 DNA 단편을 검출하는데 있어서 프라이머 Y13(서열번호 2)의 용도.
  39. 근류병에 내성이 있는 브라시카 식물을 확인하는데 있어서 프라이머 O20 또는 Y13의 용도.
  40. 제36항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 브라시카 식물이 브라시카 올레라체아인 용도.
  41. 서열번호 1 또는 서열번호 2에서 제시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 브라시카 올레라체아 식물에서 단성, 우성의 근류병 내성을 검출하기 위한 키트.
  42. a) 우성, 단성의 근류병 내성을 포함하는 브라시카 올레라체아 식물을 수득하고;
    b) a) 단계의 브라시카 올레라체아 식물을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물과 교배시키고;
    c) 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호 2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득된 DNA 단편을 포함하는 식물을 선별하는 단계 (이때, c) 단계의 식물은 근류병에 내성이 있다)를 포함하는, 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물에 우성, 단성의 근류병 내성을 전이시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 내성 형질을 근류병에 민감한 또는 덜 내성인 브라시카 올레라체아 식물에 역교배시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. a) 브라시카 올레라체아 식물에서 샘플을 수득하고;
    b) 상기 샘플에서 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 DNA 단편을 검출하는 단계(이때, b) 단계의 브라시카 올레라체아 식물은 근류병에 내성이 있다)을 포함하는, 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아 식물을 확인하는 방법.
  45. a) 브라시카 올레라체아 식물군을 제공하고;
    b) 상기 식물군의 식물에서 샘플을 수득하고;
    c) 상기 샘플에서 프라이머 O20(서열번호 1) 또는 프라이머 Y13(서열번호2)을 이용한 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있는 DNA 단편을 검출하는 단계(이때, b) 단계의 브라시카 올레라체아 식물은 근류병에 내성이 있다)을 포함하는, 브라시카 올레라체아 식물군으로부터 근류병에 내성이 있는 브라시카 올레라체아 식물을 선별하는 방법.
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