CN113234850B - 一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，属于作物遗传育种技术领域。该方法通过选择卷筒叶恢复系广恢998为母本，大穗型茎秆粗壮的恢复系R470为父本进行有性杂交、自交，系谱法选择卷筒叶、茎秆粗壮且主要农艺性状优良的单株至F4，随后从该世代至F10代株系中逐代挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为受体亲本，以未知褐飞虱抗性基因的普通野生稻BPHR96为供体亲本进行杂交，并通过筛选与褐飞虱抗感虫性状连锁的分子标记、以及利用其选择的目标基因型单株为父本连续回交、自交和褐飞虱抗性鉴定培育卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法。
背景技术
水稻是世界上主要的粮食作物之一，随着人口日益增加，粮食需求也在不断地增长。在耕地面积不变的情况下，只能通过提高水稻单产来提升水稻总产量来满足需求。改良水稻株型是提高水稻产量的重要途径。
叶片是水稻进行光合作用、呼吸、蒸腾等活动的主要场所，也是水稻株型的重要构成要素。叶片的适度卷曲改善了个体和群体的透光性，一方面缩小了叶片与茎杆的夹角，使叶片直立，促使叶片上下2个面的受光态势得到改善，反射率降低，提高了光合强度。另一方面，叶片卷曲可以保持叶片不披垂，在群体生长的中后期保证中下部的光照条件，提高了叶面积指数，增加光合面积，提高光能的利用率，从而提高水稻产量。因此叶片适度卷曲有利于塑造紧凑株型、改善群体结构、提高光合效率和产量。
褐飞虱是为害水稻的重大迁飞性害虫，广西是褐飞虱境外虫源迁入中国的“桥头堡”和北往南返的必经之地，同时广西也是长江中下游稻区的主要虫源地。由于境外虫源基数高，往往容易导致广西褐飞虱危害频繁大发生，从而造成全国连年大规模暴发，给我国粮食安全构成严重威胁。据统计，从2006年-2015年我国褐飞虱发生造成的直接产量损失年均达百万吨以上(刘万才等，2016)。长期以来，褐飞虱的防治主要依靠化学杀虫剂。大量使用化学农药一方面会导致农药残留、环境污染、生产成本增加；另一方面会导致褐飞虱对主打特效杀虫剂容易产生强抗药性。同时由于滥用农药，还会杀死了稻田中的褐飞虱天敌，反而诱发褐飞虱的再猖獗。科学研究和生产实践证明，种植褐飞虱抗性水稻品种是控制褐飞虱最经济有效和环保的措施。
目前，褐飞虱抗性育种上主要利用抗源B5上的Bph14和Bph15基因，从已经报道的研究来看，仅我国国内就有数十家育种单位利用Bph14和Bph15进行抗性改良和材料创新。大面积使用单一抗源材料，容易导致抗性品种对褐飞虱控制力逐渐减弱甚至丧失抗性(谭玉娟等，1988；张扬等，1990)。同时褐稻虱是一种典型的迁飞性害虫，不同迁飞地具有不同致害生物型虫源及种群混杂，容易产生褐飞虱生物型变异(张扬等，2011)，褐飞虱致害生物型的变异容易使抗性品种丧失抗性。由于培育优良的抗虫品种需要耗费漫长的时间，所以虽然我国各个地方推广的水稻品种非常多，但是具有稻飞虱抗性的品种却非常少。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法。
本发明所用的普通野生稻BPHR96具有对褐飞虱免疫的抗性水平，广恢998是光能高效利用的优质抗病多穗型恢复系，并利用其育成杂交稻组合16个通过审定(7个组合通过国家品种审定)。本发明以是广恢998为母本，茎秆粗壮的恢复系R470为父本，经过杂交和自交系谱法选择具有父母本的诸多优点(如分蘖力强、茎秆粗壮、配合力好、卷筒叶等)的F4单株为母本，以未知褐飞虱抗性基因的普通野生稻BPHR96为供体亲本进行杂交，并通过筛选与褐飞虱抗感虫性状连锁的分子标记、以及利用其选择目标基因型单株为父本连续回交、自交和褐飞虱抗性鉴定培育卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系。相较于对某个材料抗褐飞虱性状改良产生的衍生品种，本发明实现了水稻有性杂交遗传重组培育完全自主知识产权优良恢复系又同步增强了该品种的褐飞虱抗性。同时，利用不同的不育系与其测配，其杂种F1代的褐飞虱抗性都达到了中抗水平，为组配高产、优质抗褐飞虱的杂交水稻品种奠定了坚实的基础。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，包括如下步骤：
(1)以卷筒叶恢复系广恢998为母本，大穗型茎秆粗壮的恢复系R470为父本杂交、自交，选择卷筒叶、株型紧凑、主要农艺性状优良的单株，一直至F4代。
(2)从F4株系中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株，取每个单株中的2个稻穗温汤杀雄，剪颖(其余稻穗收种形成F5代)做母本，以抗褐飞虱普通野生稻导入系BPHR96为父本进行杂交获得F1。
(3)将F4中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F5代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株(采用步骤2的方法：一部分穗子杂交，一部分穗子收获种子形成F6)为母本，步骤2获得的F1单株为父本进行回交，获得BC1种子(至少500种子)，将BC1种子分为两部分。
(4)将BC1的一部分种子进行褐飞虱抗性鉴定，采取抗虫和感虫单株(各30株)叶片分别构成抗感虫混合池，利用普通野生稻BPHR96与广恢998和R470之间全基因组多态性分子标记对抗感虫混合池进行连锁分析，发现第4染色体长短臂上各有1对分子标记与褐飞虱抗感虫性状连锁，获得连锁的分子标记。
(5)BC1的另外一部分种子大田种植获得BC1F1，利用长短臂连锁的分子标记对BC1F1单株进行标记分析，选取2个标记均为杂合基因型的单株作为父本。
(6)重复步骤3的方法，将F5中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F6代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤5挑选的单株作为父本杂交，获得BC2种子。
(7)种植BC2种子形成BC2F1，利用长短臂连锁的分子标记筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本。
(8)重复步骤3的方法，将F6中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F7代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤7挑选的单株作为父本杂交，获得BC3种子。
(9)种植BC3种子形成BC3F1，利用长短臂连锁的分子标记筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本。
(10)重复步骤3的方法，将F7中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F8代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤9挑选的单株作为父本杂交，获得BC4种子。
(11)种植BC4种子形成BC4F1，利用长短臂连锁的分子标记筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本。
(12)重复步骤3的方法，将F8中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F9代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤11挑选的单株作为父本杂交，获得BC5种子。
(13)种植BC5种子形成BC5F1，利用长短臂连锁的分子标记筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本。
(14)重复步骤3的方法，将F9中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F10代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤13挑选的单株作为父本杂交，获得BC6种子。
(15)种植BC6种子形成BC6F1，分单株收种，按株系种植形成BC6F2，利用长短臂连锁的分子标记筛选2个标记均为抗性基因型的单株，分单株收种。
(16)将BC6F2代收获单株的种子播种(BC6F3)进行苗期褐飞虱抗性鉴定，将高抗褐飞虱的单株种稻大田，选择主要农艺性状优良的单株与三系不育系天丰A进行测交，分单株收获相应的测交单株形成BC6F4代以及对应的测交种。
(17)按株系分小区种植BC6F4及对应的测交种，每个小区种植100株，综合考察测交种小区农艺性状、结实率、产量等杂种优势，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株整齐度好的对应株系混合收种，同时根据相应株系测交种的褐飞虱抗性鉴定结果，最终选育出卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系BPHR4684。
其中水稻苗期褐飞虱抗性鉴定采用标准苗期集团法(Standard SeedboxScreening Technique，SSST)进行。
所述1对分子标记对应的引物序列如下：
BPH-InDel1：
SEQ ID NO.3：TGTCTTGGGTTTTATTGTCC；
SEQ ID NO.4：CGGACCTACTGGAAATTATG。
BPH-InDel2：
SEQ ID NO.5：TAGCTAAAAACCGGCAACTA；
SEQ ID NO.6：ATTAAATGTTTGGACCGTTG。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，实现了水稻有性杂交遗传重组培育完全自主知识产权优良恢复系又同步增强了该品种的褐飞虱抗性。
附图说明
图1为本发明卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系BPHR4684的育种流程图。
图2为实施例1中标记选择BC6F2分离群体抗性基因型纯合单株的电泳图。
图3为实施例1中BC6F3株系苗期褐飞虱抗性评价结果图。
图4为实施例1中卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系BPHR4684与卷筒叶感虫恢复系R4684的株型对比图。
具体实施方式
实施例1
一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，步骤如下：
(1)以卷筒叶恢复系广恢998为母本，大穗型茎秆粗壮的恢复系R470为父本进行杂交获得F1种子，种植形成F2分离大群体，采用系谱法从F2-F3选择卷筒叶、株型紧凑、主要农艺性状优良的单株至F4代。
(2)从F4株系中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株，取每个单株中的2个稻穗温汤杀雄，剪颖做母本，抗褐飞虱普通野生稻BPHR96为父本进行杂交获得F1；其余稻穗收种获得F5种子，从F5株系中继续挑选茎秆粗壮的卷筒叶优良单株为母本，与上述获得的F1单株为父本进行回交，获得BC1种子。
(3)通过对BC1进行褐飞虱抗性鉴定，采取抗虫和感虫单株(各30株)叶片分别构成抗感虫混合池，从水稻12条染色体上挑选出483个SSR和InDel标记(约每0.7Mb选1个标记)对抗感虫亲本BPHR96与广恢998和R470之间进行多态性筛选，其中有174个分子标记在亲本间具有多态性，约占总标记数的36.0％。
(4)利用亲本间多态性的分子标记对抗感虫池进行分析(集团分离分析法BSA)筛选与抗性基因紧密连锁的分子标记，最终在水稻的第4染色体的短臂和长臂上各筛选到了1个在抗、感混合池中均表现出多态性的InDel标记BPH-InDel1和BPH-InDel2，在其它染色体上并未找到在抗、感虫混合池中存在多态性的分子标记。因此，第4染色体上的分子标记BPH-InDel1和BPH-InDel2很可能与BPHR96中的抗褐飞虱基因紧密连锁。
BPH-InDel1标记的抗虫片段(132bp)如下：
SEQ ID NO.1:
TGTCTTGGGTTTTATTGTCCCTGACTCTGAAATGCTAGAGCAAACTGGATCCTAAATGGTATAATAACTGCAAGCTTAGTGTAACTTACAATAGAACCAGCACCGATTCCCTCATAATTTCCAGTAGGTCCG；
BPH-InDel1标记的感虫片段(142bp，其中横线标注的序列是比抗虫片段多插入的10bp碱基)如下：
SEQ ID NO.7：
TGTCTTGGGTTTTATTGTCCCTGACTCTGAAATGCTAGAGCAAACTGGATCCTAATACAATATTCATGGTATAATAACTGCAAGCTTAGTGTAACTTACAATAGAACCAGCACCGATTCCCTCATAATTTCCAGTAGGTCCG；
BPH-InDel2标记的抗虫片段(98bp)如下：
SEQ ID NO.2：
AAGACGAATGGTCAAATGTTGGATAAAAAATCAACGGCGTCCAGGTAGTACTAGTTTGCTGCAACAATGGAGGGAGTGCAGTAAGGTTTTGTTTTCCG；
BPH-InDel2标记的感虫片段(113bp，其中横线标注的序列是比抗虫片段多插入的15bp碱基，同时还有1个碱基的差异)如下：
SEQ ID NO.8：
AAGACGAATGGTCAAATGTTGGATAAAAAATCAACGGCGTCATACATTTTAAAATGGAGGTAGTACTAGTTTGCTGCAACAATGGAGGGAGTGCAGTAAGGTTTTGTTTTCCG。
(5)从F5-F10代株系中逐代挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株作为轮回亲本(母本)，利用与褐飞虱抗感虫性状连锁的分子标记选择各回交世代(BC1-BC5)群体目标基因型均为杂合的单株为父本连续回交至BC6。
(6)利用与褐飞虱抗感虫性状连锁的分子标记对BC6F1植株筛选2个标记基因型均为杂合的单株，分单株收种形成BC6F2。按株系种植BC6F2，利用与褐飞虱抗感虫性状连锁的分子标记筛选2个标记均为抗性基因型且选择主要农艺性状优良的单株，如图2中34号对应的单株，分单株收种形成BC6F3。
(7)对BC6F3植株进行苗期褐飞虱抗性鉴定，结果表明2个分子标记检测结果与褐飞虱抗性鉴定结果完全吻合，部分结果参见图3和表1，将高抗褐飞虱的单株种稻大田，选择主要农艺性状优良的单株与三系不育系天丰A进行测交，分单株收获相应的测交单株形成BC6F4代以及对应的测交种。
表1 BC6F2群体分子标记分析及相应家系褐飞虱抗性鉴定
注：A、B表示抗虫基因型；ab表示感虫基因；H表示杂合基因型。HR表示高抗褐飞虱；R表示抗褐飞虱；R-S表示家系中有抗感分离的植株；S表示感褐飞虱；HS表示高感褐飞虱。
(8)按株系种植BC6F4及对应的测交种，综合考察测交种小区农艺性状、结实率、产量等杂种优势，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株整齐度好的对应株系混合收种，最终选育出卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系BPHR4684，参见图4。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所
<120> 一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法
<130> 2021.6.24
<141> 2021-06-28
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> 水稻()
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgtcttgggt tttattgtcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cggacctact ggaaattatg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tagctaaaaa ccggcaacta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
attaaatgtt tggaccgttg 20
<210> 7
<211> 142
<212> DNA
<213> 水稻()
<400> 7
tgtcttgggt tttattgtcc ctgactctga aatgctagag caaactggat cctaatacaa 60
tattcatggt ataataactg caagcttagt gtaacttaca atagaaccag caccgattcc 120
ctcataattt ccagtaggtc cg 142
<210> 8
<211> 113
<212> DNA
<213> 水稻()
<400> 8
aagacgaatg gtcaaatgtt ggataaaaaa tcaacggcgt catacatttt aaaatggagg 60
tagtactagt ttgctgcaac aatggaggga gtgcagtaag gttttgtttt ccg 113
Claims (6)
1.一组特异分子标记片段，其特征在于，所述特异分子标记片段分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述特异分子标记片段作为抗虫片段，用于在亲本“广恢998”、“恢复系R470”和“抗褐飞虱普通野生稻导入系BPHR96”的杂交后代中进行褐飞虱抗性鉴定。
2.扩增权利要求1所述的特异分子标记片段的分子标记引物对，其特征在于，所述分子标记片段SEQ ID NO.1对应的分子标记引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述分子标记片段SEQ ID NO.2对应的分子标记引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求2所述的分子标记引物对，其特征在于，使用分子标记引物对SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，扩增得到一条132bp的特异片段，使用分子标记引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR扩增，扩增得到一条98bp的特异片段，则表明分别获得抗性连锁基因；使用分子标记引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，扩增得到一条142bp的特异片段，使用分子标记引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR扩增，扩增得到一条113bp的特异片段，则表明分别获得感虫连锁基因；使用分子标记引物对SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，扩增得到一条142bp和一条132bp的特异片段，使用分子标记引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行PCR扩增，扩增得到一条113bp和一条98bp的特异片段，则表明分别获得杂合基因型。
4.权利要求2或3所述的分子标记引物对在水稻抗褐飞虱分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，用于在亲本“广恢998”、“恢复系R470”和“抗褐飞虱普通野生稻导入系BPHR96”的杂交后代中进行褐飞虱抗性鉴定。
5.一种卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以恢复系广恢998为母本，恢复系R470为父本杂交、自交，选择卷筒叶、株型紧凑、主要农艺性状优良的单株，一直至F4代；
（2）从F4株系中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株，取每个单株中的至少1个稻穗温汤杀雄，剪颖做母本，以抗褐飞虱普通野生稻导入系BPHR96为父本进行杂交获得F1，其余稻穗收种形成F5代；
（3）从F5代群体中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，方法同步骤2，一部分穗子杂交，一部分穗子收获种子形成F6，步骤2获得的F1单株为父本进行回交，获得BC1种子；
（4）种植BC1种子获得BC1F1，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6对BC1F1单株进行标记分析，选取2个标记均为杂合基因型的单株作为父本；
（5）重复步骤3的方法，将F5中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F6代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤4挑选的单株作为父本杂交，获得BC2种子；
（6）种植BC2种子形成BC2F1，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本；
（7）重复步骤3的方法，将F6中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F7代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤6挑选的单株作为父本杂交，获得BC3种子；
（8）种植BC3种子形成BC3F1，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本；
（9）重复步骤3的方法，将F7中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F8代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤8挑选的单株作为父本杂交，获得BC4种子；
（10）种植BC4种子形成BC4F1，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本；
（11）重复步骤3的方法，将F8中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F9代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤10挑选的单株作为父本杂交，获得BC5种子；
（12）种植BC5种子形成BC5F1，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6筛选2个标记基因型均为杂合的单株作为父本；
（13）重复步骤3的方法，将F9中选单株剩余穗子收获的种子种植形成F10代群体，从中挑选茎秆粗壮的卷筒叶单株为母本，以步骤12挑选的单株作为父本杂交，获得BC6种子；
（14）种植BC6种子形成BC6F1，分单株收种，按株系种植形成BC6F2，利用分子标记引物对SEQ ID NO.3-6筛选2个标记均为抗性基因型的单株，分单株收种；
（15）将BC6F2代收获单株的种子BC6F3进行褐飞虱抗性鉴定，种植高抗褐飞虱的单株，选择主要农艺性状优良的单株与三系不育系进行测交，分单株收获相应的测交单株形成BC6F4代以及对应的测交种；
（16）按株系分小区种植BC6F4及对应的测交种，综合考察测交种小区农艺性状、结实率、产量优势，选取杂种优势强、结实率和产量高以及小区植株整齐度好的对应株系混合收种，同时根据相应株系测交种的褐飞虱抗性鉴定结果，最终选育出卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系。
6.根据权利要求5所述的卷筒叶抗褐飞虱水稻恢复系的育种方法，其特征在于，所述步骤（15）中三系不育系为天丰A。
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