CN114195873A

CN114195873A - 毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用

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Publication number: CN114195873A
Application number: CN202111439268.1A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 刘慧子; 李爽; 高境烩; 孙佳彤; 姜立泉
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114195873B

Abstract

毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用，属于基因工程技术领域。本发明为了解决木材数量及品质的需要日渐增大，毛果杨PtrbHLH186转录因子生物功能未知的问题，通过农杆菌介导的毛果杨遗传转化系统获得了PtrbHLH186过量表达毛果杨转基因植株，再利用一系列技术手段分析发现，PtrbHLH186转录因子的过量表达影响了植株的生长发育及木材的形成，主要体现在该基因通过对木质素合成酶基因的调控影响树木次生细胞壁的木质素的沉积，进而改变木质部细胞的形态结构及分布，以上结果说明PtrbHLH186转录因子对树木次生木质部的发育具有一定调控作用。本发明研究内容对培育优质木材林木新品种具有重要的理论指导意义。

Description

毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用。

背景技术

木材是纸浆造纸、房屋建造等必不可少的重要原料，也是世界重要的可再生资源。我国是世界木制品加工生产和消费的大国，随着经济社会发展、人口数量增多、人民生活水平提高，我国对木材的数量及品质的需要也日渐增大。树木木材的形成是一个高度有序的发育过程，茎干的维管形成层不断向内分裂分化形成由导管细胞、纤维细胞、射线细胞组成的次生木质部，次生木质部不断经木质素沉积形成木材。木质素的沉积由木质素单体合成酶基因控制。在毛果杨中，共有22个木质素单体合成酶基因，绝大多数基因均参与构成木质素的3种木质素单体(G型、S型、H型)的合成。但也有少数基因在某一种木质素单体的合成途径上发挥主要作用，如PtrCAld5H1、PtrCAld5H2主要参与S型木质素的合成，PtrCCoAOMT2和PtrCCoAOMT3是G型木质素合成的重要合成酶基因。树木木质素的合成的变化直接影响着树木木质部细胞的形态结构，进而影响木材材性。例如：G型木质素主要沉积在杨树木质部的导管细胞中，G型木质素合成的改变直接影响导管细胞的发育；而S型木质素主要沉积在纤维细胞中，S型木质素合成的变化将影响纤维细胞的形成。此外，木质素沉积的早晚直接影响着植物的生长发育。植物的生长发育状态与植物细胞的大小、形态等特征密切相关，细胞形态结构取决于细胞向外的张力，细胞向外的张力取决于细胞壁的延展性，木质素含量的多少、木质素沉积的早晚直接决定着细胞壁的可延展性，进而影响细胞的形态结构。

bHLH转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在多种生物进程中发挥重要的调控作用。其中，毛果杨PtrbHLH186转录因子在茎干木质部中高丰度表达，但该基因的生物功能迄今为止从未被研究。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用，所述毛果杨PtrbHLH186基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步地限定，所述的毛果杨PtrbHLH186基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

进一步地限定，上述应用是通过PtrbHLH186基因的过量表达使毛果杨生长迟缓，茎干木质化提前，G型木质素合成增加，茎干纤维和导管细胞数量增加，单个导管细胞孔径变小，单位面积上导管细胞所占面积增加。

进一步地限定，上述应用是利用PtrbHLH186基因构建植物表达载体，然后将含有PtrbHLH186基因的植物表达载体转入毛果杨中，获得转基因植株，具体包括如下步骤：

(1)克隆毛果杨PtrbHLH186基因，所述PtrbHLH186基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

(2)将PtrbHLH186基因构建到植物表达载体中，获得重组载体；

(3)将步骤(2)获得的重组载体转化到毛果杨中，获得转基因植株，并通过抗性筛选、鉴定，获得转基因阳性植株。

进一步地限定，步骤(1)所述毛果杨为毛果杨(Populus trichocarpa)Nisqually-1基因型野生型植株。

进一步地限定，所述步骤(1)中用于克隆毛果杨PtrbHLH186基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地限定，步骤(2)所述植物表达载体为pBI121。

进一步地限定，步骤(3)所述转化方法为农杆菌转化法。

本发明还提供了一种含有毛果杨PtrbHLH186基因的植物表达载体，所述植物表达载体为pBI121。

本发明还提供了上述植物表达载体在影响树木次生木质部发育中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过农杆菌介导的毛果杨遗传转化系统获得了PtrbHLH186过量表达毛果杨转基因植株。利用一系列技术手段分析发现，PtrbHLH186转录因子的过量表达使毛果杨生长迟缓、茎干木质化提前、G型木质素合成增加、茎干纤维和导管细胞数量增加、单个导管细胞孔径变小、单位面积上导管细胞所占面积增加，进而发现PtrbHLH186基因对树木次生木质部的发育具有一定调控作用，主要体现在该基因通过对木质素合成酶基因的调控影响树木次生细胞壁的木质素的沉积，进而改变木质部细胞的形态结构及分布，影响植株的生长发育及木材的形成。本发明研究内容对培育优质木材林木新品种具有重要的理论指导意义。

附图说明

图1为本发明PtrbHLH186过量表达及野生型植株温室生长4个月后的生长状况图；图中L1、L2、L3、L4分别表示过表达植株4个不同株系，WT代表野生型毛果杨，比例尺为10cm；

图2为本发明PtrbHLH186过量表达植株转录水平鉴定结果图；图中L1、L2、L3、L4分别表示过表达植株4个不同株系，WT代表野生型毛果杨，误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；

图3为本发明温室生长4个月的转基因植株生长表型分析结果图；图中L1、L2、L3、L4分别表示过表达植株4个不同株系，WT代表野生型毛果杨，误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，**P<0.01；

图4为本发明毛温室生长1-4个月的转基因植株生长表型分析图；误差线代表由至少三个生物学重复计算的标准误，星号代表t检验结果，**P<0.01；

图5为本发明PtrbHLH186过表达植株不同茎节的形态观察结果图；OE-PtrbHLH186-L4代表PtrbHLH186过量表达转基因植株，WT代表野生型毛果杨，IN代表茎节，比例尺＝200μm；

图6为本发明PtrbHLH186过量表达及野生型毛果杨中木质素单体合成酶基因转录水平检测结果图；OE-PtrbHLH186代表PtrbHLH186过量表达转基因植株，WT代表野生型毛果杨；误差线表示由三个独立重复的生物学重复计算的标准误差；星号表示t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；

图7为本发明PtrbHLH186过表达及野生型毛果杨木质部导管和纤维细胞的统计分析结果图；图中(a)为野生型(WT)和OE-PtrbHLH186转基因植株第10茎节的扫描电子显微照片，分别以×500(左图)和×1500(右图)放大倍数成像；比例尺＝20μm；图中(b)为4个月大的WT和OE-PtrbHLH186的第10节间的茎横截面及放大图像；比例尺＝100μm；图中(c)为OE-PtrbHLH186和WT植株的茎横截面显示了木质部组织中导管细胞的大小和数量；导管细胞用绿色填充；比例尺＝100μm；图中(d)为第10茎节固定面积内纤维细胞和导管细胞的数量统计结果图；图中(e)为单个导管细胞的面积统计结果图；图中(f)为单位面积中导管细胞的总面积统计结果图；*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

以下实施例中如无特别说明均为常规方法。所使用的材料、试剂、酶、感受态细胞、质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：毛果杨PtrbHLH186转录因子的获得及植物表达载体的构建

(1)PtrbHLH186基因序列的克隆

利用Qiagen公司植物RNA提取试剂盒提取毛果杨(Populus trichocarpa)Nisqually-1基因型野生型植株总RNA，利用Takara反转录试剂盒(RR047A)进行反转录获得cDNA。

参照phytozome网站提供的毛果杨基因组序列信息，在目的基因序列两端设计基因特异性引物并委托生物公司合成引物，获得用于PtrbHLH186基因克隆的上、下游引物序列见表1。

表1用于PtrbHLH186基因克隆的上、下游引物序列

注：划线部分代表酶切位点，酶切位点前面为保护碱基。

利用上述引物通过聚合酶链式反应(PCR)获得目的序列，对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离目的条带。利用Qiagen公司的胶回收试剂盒对目的片段进行胶回收。

(2)植物表达载体的构建

对回收获得的目的DNA片段和pBI121植物表达载体进行双酶切，具体反应体系及反应条件如下：

酶切体系：

酶切条件：

37℃1小时

酶切后通过电泳分离目的条带，并用Qiagen胶回收试剂盒回收目的条带。利用T4连接酶将目的基因装入植物表达载体pBI121中，具体反应体系及条件如下：

T4连接体系：

连接条件：

4℃过夜

取出TOP10感受态细胞于冰上解冻，将以上连接产物全部加入到感受态细胞中，混合均匀。42℃热激1分钟，置于冰上冰浴3分钟，加入无抗性的LB培养基，37℃、200rpm活化一个小时。低转速收集菌体，并将菌体涂布在固体LB培养基(含卡那霉素50mg/L)上，37℃过夜培养。次日，用载体引物对获得的单克隆进行PCR鉴定，引物如表2：

表2用于植物表达载体构建单克隆检测引物序列

对PCR产物进行电泳分析，确定阳性克隆。挑取阳性单克隆于5ml LB培养基中(卡那霉素，50mg/L)，220rpm，37℃，过夜培养。次日，保存菌种并离心收集菌体，进行质粒的提取，用引物35SP1和NosT2对提取到的质粒进行测序，具体过程参照Qiagen质粒提取试剂盒说明书。

根据phytozome网站提供的毛果杨基因组序列信息，利用PCR的方式获得目的基因，并连接pBI121载体。经测序分析发现，我们获得的基因共1053bp(SEQ ID NO：1)，编码351个氨基酸(SEQ ID NO：2)，与phytozome网站提供的毛果杨PtrbHLH186序列信息相一致，表明我们成功获得了毛果杨PtrbHLH186基因。

实施例2：毛果杨PtrbHLH186过量表达植株的获得

(1)冻融法转化农杆菌

①取出农杆菌感受态细胞至于冰上，将30ng左右的质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min，立即放入液氮中，冰冻1min，再立即放入37℃，水浴3min。

②加入1ml液体LB，28℃180-200rpm培养2-3h。

③瞬离15s，去上清，保留上清液300-400μl，重悬，在LB(卡那霉素+庆大霉素)固体培养基上涂板，28℃培养48h左右。

④挑取大的克隆，接种于5ml LB(卡那霉素+庆大霉素)液体培养基中，220rpm 28℃过夜培养。

⑤以菌液为模板进行PCR，确认阳性克隆，具体方法参照实施例1。

⑥保存阳性克隆菌种，500ml菌液+500ml 50％甘油，混匀，液氮速冻，-80℃保存。

(2)农杆菌介导的毛果杨遗传转化

①取含有植物表达载体的农杆菌菌种10μl，加入到5ml抗性LB(卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L)培养基中，28℃，220rpm，过夜培养。

②次日，取培养好的菌液100μl加入到50ml抗性LB液体培养基中(卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L)，28℃，220rpm，培养至OD600＝0.4，备用。

③取3-6个月大毛果杨温室苗幼嫩的茎段，在10％次氯酸钠中消毒20min。

④用无菌水充分清洗消毒后的外植体茎段。

⑤将茎段切成5mm左右的小段，放入到培养好的菌液中，侵染5分钟。

⑥捞出茎段，放在CIM1培养基上，黑暗培养2天。

⑦两天后，用无菌水充分清洗外植体茎段，并摆放在CIM2培养基上，黑暗培养，每2周更换培养基。

⑧CIM2培养基上黑暗培养2个月后，转至SIM1培养基上置于光下培养，一个月后转至SIM2培养基上，光下培养。

⑨长出抗性芽后，将抗性芽插入到生根培养基中诱导生根。

(3)转基因植株的鉴定

①将抗性植株连同状态一致的野生型植株种入土中，培养至4个月大，收集抗性植株和野生型对照的次生木质部。

②进行RNA提取，具体步骤参照植物RNA提取试剂盒(Qiagen)说明书。

③获得的RNA用NanoDrop进行浓度、品质的测定。

④参考说明书用OligdT引物对已获得的RNA进行反转录，获得cDNA。

⑤将获得的cDNA稀释10倍，进行RT-qPCR，内参为PtrActin 7，引物序列见表3。

定量PCR反应体系15μl：

⑥用2^△△Ct法对定量结果进行计算。

表3用于转基因植株鉴定的引物序列

通过农杆菌介导的遗传转化的方式共获得了4个独立抗性株系，分别命名为L1、L2、L3、L4，PtrbHLH186过量表达及野生型植株温室生长4个月后的生长状况图如图1所示。经过转录水平鉴定后，与毛果杨野生型植株相比，PtrbHLH186基因在4株抗性植株中转录水平均有明显上升(图2)，表明成功获得PtrbHLH186基因的过量表达转基因毛果杨植株。

实施例3：毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用

(1)对实施例2获得的独立抗性株系以及毛果杨野生型植株进行生长表性分析

生长表型分析包括如下指标：

树高测量：分别对1、2、3、4个月大的野生型及过量表达PtrbHLH186的转基因温室植株测量土面以上至顶芽的高度，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。

茎节数量：分别对1、2、3、4个月大的野生型及过量表达PtrbHLH186的转基因温室植株统计茎节数量，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。

基茎测量：分别对1、2、3、4个月大的野生型及过量表达PtrbHLH186的转基因温室植株用游标卡尺测量土面以上5cm处直径，野生型植株及转基因植株至少3个生物学重复。

通过对比观察温室培养的毛果杨野生型植株和PtrbHLH186过表达植株发现，过量表达PtrbHLH186后植株出现了明显的生长表型变化，如图1。相比野生型植株，转基因植株的生长明显迟缓，统计分析数据显示(见图3和图4)，转基因植株的高度、茎节数量、基茎粗度极显著降低，说明PtrbHLH186的过量表达造成了毛果杨植株生长发育的改变。

(2)对实施例2获得的独立抗性株系以及毛果杨野生型植株进行组织切片观察

分别取温室生长4个月的野生型及PtrbHLH186过表达植株茎干的第2、3、4、5、6、8、10茎节进行石蜡切片及组织化学染色分析，所用染料分别为番红和固绿，番红能够将植物细胞中的木质素染成红色，固绿能够将植物细胞内纤维素染成绿色。利用电子显微镜进行细胞形态观察(见图5)，结果表明，PtrbHLH186过表达植株次生生长明显提前，过表达植株在第4茎节开始出现纤维细胞，而野生型植株在第6茎节开始出现纤维细胞，转基因植株表现出明显的木质化的提前及木质化程度的增强，表明PtrbHLH186的过表达影响了植株次生生长过程。

(3)对实施例2获得的独立抗性株系以及毛果杨野生型植株进行木材组分分析

Klason法结合高效液相色谱法分析木质素及单糖含量

①取4个月大温室生长的毛果杨野生型及PtrbHLH186过表达植株茎干，去树皮，剪成6cm大小的茎段，使用丙酮浸泡萃取后置于通风橱中风干茎段。

②用粉碎机打碎茎段成粉状，过40目的筛网。

③用72％硫酸将木粉水解90min。

④向样品中加入ddH₂O将硫酸稀释至3％。

⑤121℃高温高压处理90min。

⑥利用陶瓷过滤坩埚将样品过滤，不可溶性木质素在陶瓷坩埚中，烘干，称重，即得酸不可容性木质素含量。

⑦收集上一步部分滤液，通过紫外分光光度计即可测量酸可溶性木质素含量。

⑧将剩余滤液用碳酸钙中和硫酸，过滤后通过高效液相色谱测量单糖含量。

硝基苯碱氧化法对木质素单体的定性定量分析

①取4个月大小毛果杨温室植株野生型及PtrbHLH186过表达植株茎干，去树皮，剪成6cm大小的茎段，使用丙酮浸泡萃取后置于通风橱中风干茎段。

②用粉碎机打碎茎段成粉状，过40目的筛网。

③用NaOH和硝基苯在175℃条件下水解木粉2.5h。

④待样品冷却使至室温用HCl中和NaOH。

⑤1000g，1min离心收集上清液。

⑥上清液经2μm滤膜过滤后用高效液相色仪对S、G、H型木质素进行分析定量。

利用Klason酸水解木质素分析方法对转基因及野生型植株的茎干进行木质素含量的分析。结果表明，PtrbHLH186基因的过量表达使植株茎干的木质素的含量增多(表4)。结合高效液相色谱法对合成纤维素、半纤维素的四种主要单糖的定量分析发现，转基因植株的葡萄糖合成极显著降低，导致碳水化合物的总量降低，碳水化合物与木质素的比值极显著降低。硝基苯碱氧化法测得的木质素单体含量结果显示，转基因植株中G型木质素的含量极显著增加(表5)。以上结果表明，PtrbHLH186基因影响树木木材形成过程，降低了纤维素、半纤维素的合成，并通过增强G型木质素单体的合成增强了树木木质素的合成。

表4 PtrbHLH186过量表达及野生型毛果杨木质素含量及单糖含量测定结果

注：表4中的数值表示每100克绝干木头中的含量；OE-PtrbHLH186代表PtrbHLH186过量表达转基因植株，WT代表野生型毛果杨；误差线表示由三个独立重复的生物学重复计算的标准误差；星号表示t检验结果，*P<0.05，**P<0.01。

表5 PtrbHLH186过量表达及野生型毛果杨木质素单体含量测定结果

注：表5中OE-PtrbHLH186代表PtrbHLH186过量表达转基因植株，WT代表野生型毛果杨；％表示占总木质素中的含量；误差线表示由三个独立重复的生物学重复计算的标准误差；星号表示t检验结果，*P<0.05，**P<0.01；G、H、S分别表示木质素单体类型。

(4)对实施例2获得的独立抗性株系以及毛果杨野生型植株进行木质素合成酶基因表达水平分析

收集毛果杨温室生长的野生型及PtrbHLH186过表达植株木质部组织进行RNA提取、反转录、RT-qPCR检测转基因植株中木质素单体合成酶基因的相对表达水平，具体方法参照实施例2，所用引物序列如表6。

表6用于检测木质素单体合成酶基因转录水平引物序列

毛果杨中，木质素的合成由22个木质素单体合成酶基因控制。为了进一步分析转基因植株木质素含量发生改变的原因。利用转基因和野生型植株的木质部组织进行了RT-qPCR检测了22个木质素单体合成酶基因的表达水平。结果显示，控制G型木质素合成的酶基因的表达水平极显著增强，如PtrCCoAOMT2和PtrCCoAOMT3，同时控制总木质素合成的基因的表达水平也极显著增加，如PtrPAL2、PtrPAL4、PtrCCR2和PtrCAD1(见图6)。由此可见，PtrbHLH186基因通过促进相关木质素合成酶基因的表达，促进植株木质素合成。

(5)对实施例2获得的独立抗性株系以及毛果杨野生型植株进行细胞统计分析

本发明中细胞的统计分析用M8扫描仪(Precipoint)和ViewPoint软件进行。野生型和转基因植株分别取3个横切面以上，进行导管细胞平均孔径大小的统计、单位面积上(mm²)导管数量的统计、单位面积上(mm²)导管所占面积统计以及单位面积上(mm²)纤维细胞数量的统计。利用SPSS V19.0软件进行统计学的数据处理与分析。

在杨树中，G型木质素的合成具有一定的细胞类型特异性，它主要沉积在导管细胞壁中。由于转基因植株中G型木质素含量明显增加，推测转基因植株茎干导管细胞的发育可能被影响。针对转基因及野生型植株茎干的第10茎节进行了细胞形态学观察及统计分析。结果表明，PtrbHLH186基因的过量表达使植株木质部中的细胞形态及分布发生明显改变。具体表现为导管和纤维细胞数量极显著增加、单个导管孔径变小、单位面积上导管细胞的总面积增加(见图7)。

综合以上所有结果，PtrbHLH186基因参与杨树次生木质部发育的调控过程。该基因可以通过促进木质素单体合成酶基因的表达，促进木质素的合成。通过促进G型木质素单体合成酶基因的表达，增强G型木质素的沉积，增强了茎干导管细胞的发育，影响植株茎干细胞的形态结构及分布，进而影响植株发育。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北林业大学

<120> 毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用

<130>

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> Populus trichocarpa Nisqually-1基因型野生型植株

<400> 1

atgaatagag gggttttgca gagttcaccg gtgcagcaaa tgatggctgg caaccccaac 60

tggtggagca tcaacaatat gaggccacca ataactcatc atcaacaacc ctctcctttt 120

ctgcctcctc ctagtctctt ccctcaattc ctaccttcca tttcttcttc ttcatcatct 180

tctcttcctc ttccttcttg gaattatgat aacccagatc agcttccaga gtcatggagc 240

caactacttc tgggtggatt ggtgtgtgat gaagacaaga gcaatataag caattttcaa 300

gcaaagaaga tggagaattg ggaggagcaa gtgttacatc aagcatcaag tgcttcggtt 360

atggatgtca agcaagaaaa ctctgcaagc aactacgtgt acggtgcaaa tgaagatttc 420

caggcagctg caaaacctac agcttgttct caagtgatac ctgcttcatc ccccaagtcc 480

tgtgttacca gtttcagcag taacatgttg gatttctcta ccagcaaagg agatggaagg 540

catccaccac cagatcgatc ttctgattgt aacagcaccg ctaatggtgg ggcagtaaag 600

aaagctaggg ttcaatcttc ttccgcccaa cctaccttta aggtgaggaa ggagaaatta 660

ggtgatagga ttaccgctct tcaccagctt gtttctccat ttgggaagac tgacacggcc 720

tctgtcttgt tagaagctat tgggtacatc agattccttc agagccaaat tgaggctctc 780

agcttaccgt acttgggcag tggatccaca aatatgaggc agcaacaatc tgttcaagga 840

gaaagcaact gtatatttcc cgaggacccc ggtcagctgt tgaatgatag ctgcataaag 900

aggaaaggag cttctcagca ggactctcac ggggagccaa aggacctgag gagtagagga 960

ttgtgtcttg ttccagtgtc atgcacactg caagttggca gcgataatgg agcagactac 1020

tgggctcccg ctcttggagg ggggttccga tag 1053

<210> 2

<211> 350

<212> PRT

<213> Populus trichocarpa Nisqually-1基因型野生型植株

<400> 2

Met Asn Arg Gly Val Leu Gln Ser Ser Pro Val Gln Gln Met Met Ala

1 5 10 15

Gly Asn Pro Asn Trp Trp Ser Ile Asn Asn Met Arg Pro Pro Ile Thr

20 25 30

His His Gln Gln Pro Ser Pro Phe Leu Pro Pro Pro Ser Leu Phe Pro

35 40 45

Gln Phe Leu Pro Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Tyr Asp Asn Pro Asp Gln Leu Pro Glu Ser Trp Ser

65 70 75 80

Gln Leu Leu Leu Gly Gly Leu Val Cys Asp Glu Asp Lys Ser Asn Ile

85 90 95

Ser Asn Phe Gln Ala Lys Lys Met Glu Asn Trp Glu Glu Gln Val Leu

100 105 110

His Gln Ala Ser Ser Ala Ser Val Met Asp Val Lys Gln Glu Asn Ser

115 120 125

Ala Ser Asn Tyr Val Tyr Gly Ala Asn Glu Asp Phe Gln Ala Ala Ala

130 135 140

Lys Pro Thr Ala Cys Ser Gln Val Ile Pro Ala Ser Ser Pro Lys Ser

145 150 155 160

Cys Val Thr Ser Phe Ser Ser Asn Met Leu Asp Phe Ser Thr Ser Lys

165 170 175

Gly Asp Gly Arg His Pro Pro Pro Asp Arg Ser Ser Asp Cys Asn Ser

180 185 190

Thr Ala Asn Gly Gly Ala Val Lys Lys Ala Arg Val Gln Ser Ser Ser

195 200 205

Ala Gln Pro Thr Phe Lys Val Arg Lys Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile

210 215 220

Thr Ala Leu His Gln Leu Val Ser Pro Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala

225 230 235 240

Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Gly Tyr Ile Arg Phe Leu Gln Ser Gln

245 250 255

Ile Glu Ala Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Ser Thr Asn Met

260 265 270

Arg Gln Gln Gln Ser Val Gln Gly Glu Ser Asn Cys Ile Phe Pro Glu

275 280 285

Asp Pro Gly Gln Leu Leu Asn Asp Ser Cys Ile Lys Arg Lys Gly Ala

290 295 300

Ser Gln Gln Asp Ser His Gly Glu Pro Lys Asp Leu Arg Ser Arg Gly

305 310 315 320

Leu Cys Leu Val Pro Val Ser Cys Thr Leu Gln Val Gly Ser Asp Asn

325 330 335

Gly Ala Asp Tyr Trp Ala Pro Ala Leu Gly Gly Gly Phe Arg

340 345 350

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctagtctaga atgaatagag gggttttgca 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctaggtcgac tcggaacccc cctccaagag 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cccactatcc ttcgcaagac 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gcgggactct aatcataaaa accca 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tgttgccctt gactatgagc agga 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

acggaatctc tcagctccaa tggt 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

caacaatatg aggccaccaa taact 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

agaaatggaa ggtaggaatt gagg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tgttgccctt gactatgagc agga 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acggaatctc tcagctccaa tggt 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccatccaggt caaattgagg ctgct 25

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acttcttagc tgccttcatg taagct 26

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cctagaagcc atcaccaagt tgctc 25

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gtttctccat tgggtcccac g 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

catccaggtc aaattgaggc tgca 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

acttcttagc tgccttcatg taagc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gagatgctgg aagctatcac caaat 25

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ggctctccat tgggtccaac t 21

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gagatgctgg aagctatcac caagc 25

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

ggctctccat tgggtccaac t 21

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

agtgcgccat agaccatatc ctc 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

attgcagcga cgttgatgtt ctca 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gaaatgtgca attgatcata ttttg 25

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

attgcagcaa cattgatgtt ctcc 24

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gtatgacctt agtgaagaca caatcat 27

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cccttgggtt cttgattagc tc 22

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

actagcccat ccagagatat ccga 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

tcatcttcgg tggcctgaga cttt 24

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

gtgatcatgc tcatcctgcc aagt 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

ttggcagcag tagtaatggc acct 24

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

atcagcatgt aaggcacgcg g 21

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

tgccaaagta accaggtgga agcgt 25

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

agatcaacat gcaaagcacg tga 23

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

gccaaagtaa ccaggaggga gttg 24

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

gatactggct ggctgtttca 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

catgtagcag cgtaaaccgt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

ggtgacatgg acaagattgc 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

aaggctggta agcccttgta 20

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

cagtaattca gaaagctggt gttgc 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

gcatccacaa agatgaaatc aaaac 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

ccttccaacg ccaggaaaga gagta 25

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

gtggccaact tcttgatgcc ttccg 25

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

tgatcgaacc tgctgtaaag ggca 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

tgcacacagc aaccatagag gaca 24

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

cggtgattca gaaagctggt ctgga 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

gcatccacaa agatgaagtc ataag 25

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

tcttgaagaa ttgctatgac gcct 24

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

gaatgcactc aacaagtatc accttg 26

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 51

ggcaagctga tcttgatggg tgtt 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 52

tcccggtgat tgactttctc ccaa 24

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 53

aatccaatat aggcaagcct gtgaacg 27

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 54

atttttggcc ccaaaagctg ctcta 25

<210> 55

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 55

aagccaatat aggcaagcct gtgaatc 27

<210> 56

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 56

aagccaatat aggcaagcct gtgaatc 27

Claims

1.毛果杨PtrbHLH186基因在调控树木次生木质部发育中的应用，其特征在于，所述毛果杨PtrbHLH186基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述毛果杨PtrbHLH186基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是通过PtrbHLH186基因的过量表达使毛果杨生长迟缓，茎干木质化提前，G型木质素合成增加，茎干纤维和导管细胞数量增加，单个导管细胞孔径变小，单位面积上导管细胞所占面积增加。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是利用PtrbHLH186基因构建植物表达载体，然后将含有PtrbHLH186基因的植物表达载体转入毛果杨中，获得转基因植株，具体包括如下步骤：

(1)克隆毛果杨PtrbHLH186基因，所述PtrbHLH186基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将PtrbHLH186基因构建到植物表达载体中，获得重组载体；

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述毛果杨为毛果杨(Populustrichocarpa)Nisqually-1基因型野生型植株。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中用于克隆毛果杨PtrbHLH186基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQID No.4所示。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述植物表达载体为pBI121。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述转化方法为农杆菌转化法。

9.一种含有权利要求1所述毛果杨PtrbHLH186基因的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pBI121。

10.权利要求9所述含有毛果杨PtrbHLH186基因的植物表达载体在影响树木次生木质部发育中的应用。