CN117887731A - 乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，属于基因工程技术领域。过表达PdERF48基因可以显著增加杨树株高、茎粗和茎节数；可以显著降低木质部木纤维细胞的细胞壁厚度，显著增加木质部导管和纤维细胞的面积，进而使杨树木质部宽度显著增加，而敲除PdERF48基因的性状与过表达性状互补；PdERF48基因为乙烯响应因子，具有转录抑制活性，可能与ABA合成酶——PdNCED1蛋白相互作用来调控ABA信号通路，进而影响杨树的次生生长；本发明的研究首次揭示乙烯响应因子和ABA信号可以协同作用，系统调控木质部发育，可以为揭秘林木木质部发育机制提供新的思路，为早日解析林木木质部发育贡献力量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用。
背景技术
木材是地球上最丰富的生物质，在我们的工业生产和生活中发挥重要作用。我国是全球第一大木材进口国，每年的木材需求量约为8亿立方米，对外依赖度超过50％，因此木材安全成为涉及国家安全的战略问题。
木材(树木的次生木质部)是由维管形成层分化来的高度特化的维管组织，次生细胞壁加厚且高度木质化，主要组成成分包括纤维素、半纤维素和木质素等。次生木质部的发育是一个复杂的调控过程，主要包括维管形成层干细胞分化成木质部母细胞，木质部母细胞不断向内分裂出木质部细胞，木质部细胞的细胞壁次生增厚和程序性死亡等，最终形成成熟的次生木质部。
植物激素在次生木质部发育过程中发挥了重要的调节作用，其中生长素在维管形成层的起始和维持干细胞的分化等方面起决定作用，在维管形成层发育的起始阶段，生长素能够激活MP/ARF5(MONOPTEROS)，进而调控维管形成层细胞的分化。此外赤霉素、细胞分裂素和油菜素内酯等激素在调控形成层活性和木质部发育等过程中也发挥重要作用。
乙烯作为植物激素在植物生长发育中发挥重要作用，其在林木的维管发育中也发挥重要作用。乙烯能够促进形成层的分化和调控应拉木(tension wood)的形成。外源乙烯或者乙烯前体ACC(aminocyclopropane-1-carboxylate)处理杨树后都能促进维管形成层的活性进而提高木材产量。解析次生木质部发育调控过程对林木分子育种具有重要的理论指导和现实意义。
杨树是温带地区重要的经济树种，具有成材早、适应性强和木材蓄积量大等优点，同时杨树遗传背景丰富，遗传转化技术成熟，易于繁殖，全基因组测序已经完成，这些优点使杨树成为林木研究的模式树种。因此，以杨树为研究对象解析木材的发育机制是利用基因工程培育高产、速生和优质林木新品种的前提，对保障我国木材安全具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，以加快木材木质部生长、促进木材增产、降低我国木材进口依赖、为林木分子育种贡献力量。
为实现上述目的，本发明提供乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，所述乙烯响应因子PdERF48的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述作用为过表达PdERF48基因可以显著增加杨树株高、茎粗和茎节数，敲除PdERF48基因可以显著降低杨树株高、茎粗和茎节数。
优选的，所述作用为过表达PdERF48基因可以显著降低木质部木纤维细胞的细胞壁厚度、显著增加木质部导管和纤维细胞的面积，敲除PdERF48基因可以显著提高木质部木纤维细胞的细胞壁厚度、显著降低木质部导管和纤维细胞的面积。
优选的，所述作用为在杨树木质部次生生长中的作用。
包含乙烯响应因子PdERF48的载体、菌株在杨树育种中的应用，所述载体包括过表达载体、敲除载体、沉默载体，菌株包括大肠杆菌、农杆菌。
南林895杨树是南京林业大学科技攻关选育出的新品种，具有速生、优质、高产等特点，2002年通过国家林木良种审定，并列入国家首批林木良种名录，成为国家林业局重点推广的杨树新品种(张跃虎,刘刚.杨树新品种南林95杨、895杨繁育技术[J].中国林副特产,2003,000(004):38-39.)，之后很快成为黄河以南的主要杨树种植品种。但是目前对杨树的研究主要针对北方种植的品种，如毛果杨和84K，而对于南林895杨树进行遗传改造进而有效提高其生物产量的方法报道相对较少，对南林895杨树遗传改造成功将对提高黄河以南地区杨树的生物产量以及我国木材的总产量产生重大影响。
因此，本发明提供的乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，其具体技术效果如下：
(1)过表达PdERF48基因可以显著增加杨树株高、茎粗和茎节数，敲除PdERF48基因可以显著降低杨树株高、茎粗和茎节数；
(2)过表达PdERF48基因可以显著降低木质部木纤维细胞的细胞壁厚度，显著增加木质部导管和纤维细胞的面积，进而使杨树木质部宽度显著增加，而敲除PdERF48基因的性状与过表达性状互补；
(3)PdERF48基因为乙烯响应因子，具有转录抑制活性，可能与ABA合成酶——PdNCED1蛋白相互作用来调控ABA信号通路，进而影响杨树木质部的次生生长；
(4)本发明的研究首次揭示乙烯响应因子和ABA信号可以协同作用，系统调控木质部发育，可以为揭秘林木木质部发育机制提供新的思路，为早日解析林木木质部发育贡献力量。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是过表达PdERF48基因阳性植株表型分析结果，其中A部分为阳性植株表达量分析结果，B部分为部分植株的表型照片，C部分为株高统计结果，D部分为距营养土5mm的茎直径统计结果，E部分为茎节数统计结果；
图2是敲除PdERF48基因靶点和氨基酸变化情况(A部分)及敲除突变体植株的表型分析结果，其中B部分为部分植株的表型照片，C部分为株高统计结果，D部分为距营养土5mm的茎直径统计结果，E部分为茎节数统计结果；
图3是PdERF48基因过表达植株和敲除突变体下部茎显微结构，其中A部分为各株系杨树的下部茎显微结构照片，B部分为形成层细胞层数统计结果，C部分为木质部宽度统计结果，D部分为木纤维细胞的细胞壁厚度统计结果，E部分为木质部细胞层数统计结果，F部分为木质部导管细胞面积统计结果，G部分为纤维细胞面积统计结果；
图4是PdERF48的转录活性(A部分)、ACC处理30日龄杨树幼苗后PdERF48的表达量分析结果(B部分)和亚细胞定位结果(C部分)；
图5是PdERF48过表达和敲除突变体杨树茎转录组和蛋白质组的分析结果，其中A部分为GO分析PdERF48过表达和敲除突变体杨树茎转录组和蛋白质组与表型相关的差异基因(DEGs,Fold>2,p value<0.05)和差异蛋白(DEPs,Fold>1.5,p value<0.05)，B部分为转录组和蛋白质组检测基因和蛋白的交集，C-E部分为转录组和蛋白质组联合分析PdERF48过表达差异基因和蛋白的关联程度，F-K部分为转录组和蛋白质组联合分析PdERF48敲除突变体差异基因和蛋白的关联程度；
图6是PdERF48过表达和突变体杨树茎转录组和蛋白质组的差异基因表达量验证结果。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
实施例中所用的仪器设备、试剂和材料均通过商业途径获得。
实施例一
构建PdERF48基因的过表达载体，方法如下：
S1.1、利用试剂盒提取“南林895”的总RNA，通过反转录试剂盒将获得的RNA反转录成cDNA，对获得的cDNA进行PCR扩增，引物F序列如SEQ ID NO.2所示；引物R序列如SEQ IDNO.3所示。
S1.2、利用“HindIII-HF”限制性内切酶对pCAMBIA1300载体(包含35S启动子)进行酶切，通过同源重组法，将PdERF48扩增片段插入到pCAMBIA1300载体的酶切位点之间(具体操作参见Tang et al.,NewPhytol.,2020)，PdERF48基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
S1.3、通过冰浴、热激等常规操作将步骤S1.2获得的重组载体转化入感受态农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)EHA105中，涂板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定正确的菌落摇菌至OD600为0.6-0.8，将菌液置于-80℃留存，具体操作方法参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。
实施例二
杨树叶片的遗传转化，方法如下：
S2.1、从-80℃冰箱中取出保存的菌液，加入1mL含50mg/L卡那和利福平抗性的液体LB培养基中，28℃、220rpm条件下孵育24h，以活化菌株，然后取200μL菌液加至50mL含有50mg/L卡那和利福平抗性的液体LB培养基中培养至OD600为0.6-0.8。
S2.2、5000rpm，离心10min收集菌体，将菌体在含有浓度为100μM/L乙酰丁香酮(AS)的共培养液体培养基中，于28℃，220rpm培养箱中培养至OD600为0.3-0.4，作为侵染液。
S2.3、取“南林895”无菌苗的上端第2-5片嫩叶，用无菌刀片在主脉上划3-4刀放入侵染液中浸泡8min左右，将叶片放在灭菌滤纸上吸干水分，平铺到共培养固体培养基上，28℃条件下暗处理2d。
S2.4、将叶片转至选择培养基上，进行暗培养，当愈伤长至米粒大小后，用无菌刀片切下，转至诱导芽的筛选培养基上进行培养，当愈伤长出嫩芽后，将芽切下插入生根培养基中进行培养。
共培养固体培养基、选择培养基、筛选培养基、生根培养基的配制方法参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。
实施例三
转基因阳性植株鉴定和表达量分析，方法如下：
S3.1、取实施例二中在生根培养基中生长2个月的遗传转化苗，利用CTAB法提取杨树茎的DNA，对杨树茎利用GFP标签引物片段进行阳性鉴定，共获得12株转基因株系。
GFP标签正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示。
S3.2、分别提取野生型(WT)和步骤S3.1鉴定的阳性苗叶片的RNA，利用试剂盒分别反转录成cDNA，以PdUBQ基因作内参，进行荧光定量PCR分析，获得转基因阳性植株的表达量，每个样本设置6个生物学重复，结果见图1中A部分。
PdUBQ基因的特异性引物的正向引物序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.7所示。
PdERF48荧光定量PCR分析的特异性引物的正向引物序列如SEQ ID NO.8所示，反向引物序列如SEQ ID NO.9所示。
由图1中A部分可以看出，转基因阳性植株中PdERF48基因的相对表达量均明显高于WT植株，其中相对表达量最高的为2#株系、7#株系、9#株系和11#株系，分别为WT相对表达量的5.8、6.6、7.2、7.1倍。
实施例四
构建PdERF48基因的敲除载体，方法如下：
通过在线软件CRISPR-P2.0(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)分别在PdERF48基因的特异序列区段，设计sgRNA特异靶点，靶点位置和序列信息见图2的A部分，并将靶点序列依次串联进pYLCRISPR/Cas9P35S-H载体中(刘耀光院士馈赠)，获得PdERF48特异基因编辑载体PdERF48-CRISPR/Cas9，(具体步骤参见Tang et al.,Plant Cell,2022)。
实施例五
将实施例四构建的PdERF48基因敲除载体，进行杨树叶片的遗传转化，方法与实施例二完全相同。
通过提取植株的DNA，扩增靶点两侧片段后送公司测序，将测序结果与WT序列比对，对PdERF48基因敲除突变体进行鉴定，扩增靶点两侧片段所用上游引物序列如SEQ IDNO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示。共获得120株转基因株系，其中有2株不同编辑形式的纯合突变体，分别命名为erf48-45株系和erf48-66株系经序列分析发现，erf48-45株系和erf48-66株系都有两种不同的编辑形式，突变位点都在第5位氨基酸，其中erf48-45株系分别导致第5位和之后的氨基酸发生变异，并分别在第13和11位氨基酸提前终止，erf48-66株系分别导致在第5氨基酸的提前终止和第5位和之后的氨基酸发生变异并在第10位氨基酸提前终止(见图2的A部分)。
实施例六
根据实施例三过表达转基因植株和实施例五敲除突变体表达量的鉴定结果，选择表达量较高的2#株系、7#株系、9#株系和11#株系，和纯合敲除突变体erf48-45株系和erf48-66株系，进行表型观察，方法如下：
S6.1、关于株高和地径
将生长情况一致的野生型和PdERF48转基因阳性苗同时扦插在温室中的营养土中培养，培养条件为：16h/8h光周期，80μmol/m2/s光照强度，温度为24-26℃，湿度70％，于温室培养的第60d分别测量各植株的株高、茎粗和茎节数。
过表达株系的测量结果见图1，其中B部分为部分植株的表型照片，C部分为株高统计结果，D部分为距营养土5mm的茎直径统计结果，E部分为茎节数统计结果。
敲除突变体株系的测量结果见图2，其中B部分为部分植株的表型照片，C部分为株高统计结果，D部分为距营养土5mm的茎直径统计结果，E部分为茎节数统计结果。
由图1的B部分和C部分可以看出，PdERF48基因过表达后植株在温室培养60d后，株高明显高于WT，平均增加了约15％，且过表达株系的茎略有增粗(图1的D部分)。进一步统计茎节数发现，过表达PdERF48株系的茎节数显著增多，平均增加了约20％(图1的E部分)，表明过表达株系株高增加可能是茎节数增多的结果。
由图2的B、C、D部分可以看出，敲除纯合突变体erf48-45株系和erf48-66株系的株高和茎粗均显著低于WT，统计茎节数发现erf48-45株系和erf48-66株系的茎节数与WT相比均显著减少(E部分)。与过表达株系的性状互补。
S6.2、木质部发育情况
步骤S6.1中移栽至温室第60d，统计完植株株高和地径后，分别取野生型杨树895、2#和9#PdERF48转基因阳性苗、erf48-45株系和erf48-66株系的第20茎节(从上往下数)进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋过程获得包含茎节材料的蜡块；用切片机对蜡块进行切片后置于载玻片上，然后用展片机进行展片、封片，然后经过二甲苯、酒精处理的脱蜡过程后，用1％浓度的甲苯胺蓝(TBO)对切片材料进行染色，1min后，用水冲洗，即可用ZEISS显微镜进行观察拍照，具体步骤参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。结果见图3，其中A部分为各株系杨树的下部茎显微结构照片，B部分为形成层细胞层数统计结果，C部分为木质部宽度统计结果，D部分为木纤维细胞的细胞壁厚度统计结果，E部分为木质部细胞层数，F部分为木质部导管细胞面积统计结果，G部分为纤维细胞面积统计结果。
由图3的A部分可以看出，与WT相比，过表达PdERF48株系的基部茎(从上往下数第20节)的木质部宽度都显著增宽，而erf48-45和erf48-66突变体则明显变窄。由C部分可以看出，与WT相比，过表达株系的木质部宽度增加了约15％以上，而erf48-45和erf48-66的木质部宽度都下降了约20％左右。细胞壁厚度统计发现过表达植株木质部的木纤维细胞的细胞壁厚度显著下降，而erf48-45和erf48-66的木纤维细胞的细胞壁厚度则明显增加(图3的A部分和D部分)。
为进一步确定木质部宽度的增加是否由于形成层分化活性增加导致，统计了PdERF48过表达株系和突变体茎形成层的层数，结果如图3的A部分和B部分所示，形成层细胞的层数在PdERF48过表达株系和突变体中没有显著差异，木质部细胞的层数也没有显著差异(图3的E部分)。进一步统计木质部导管和纤维细胞的面积发现PdERF48过表达植株的木质部导管和纤维细胞的面积显著增加(图3的F部分和G部分)，而erf48-45和erf48-66敲除突变体的木质部导管和纤维细胞的面积显著降低(图3的F部分和G部分)，这说明木质部宽度在PdERF48过表达株系和敲除突变体中的变化主要是由于细胞大小的变化导致的。
实施例七
考察PdERF48基因的生物学功能，方法如下：
S7.1、利用原生质体系统对PdERF48的转录活性进行了分析，具体操作方法参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学)。结果如图4的A部分所示，表明PdERF48具有转录抑制活性。
S7.2、以前的研究证明PdERF48在拟南芥的同源基因AtERF9能够响应乙烯信号并能作为负调控因子调控拟南芥对灰霉病的抗性(Maruyama et al.,Plant Sci.,2013)。为确定PdERF48是否也能响应乙烯信号，采用1mM的ACC(乙烯前体)水培处理杨树幼苗12和24h后检测PdERF48的表达，上游引物序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物序列如SEQ ID NO.13所示，以UBQ10作为内参基因，内参基因的上游引物序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物序列如SEQ ID NO.15所示。
结果如图4的B部分所示，ACC处理能够激活PdERF48的表达，表明PdERF48可能是乙烯响应因子，受乙烯诱导。利用烟草瞬时转化系统对PdERF48的亚细胞定位进行分析，结果如图4的C部分所示，表明PdERF48在细胞核和细胞质中均有定位，初步推测定位在细胞核中的PdERF48可能在转录水平发挥作用，而定位在细胞质中的PdERF48还可能参与了除转录以外的调控作用。
实施例八
选用PdERF48过表达株系9#和敲除纯合突变体erf48-66，送生物公司进行转录组和蛋白组分析。
结果如图5所示，与植株表型相关的信号通路中许多基因表达和蛋白含量都发生了明显变化，其中参与激素信号途径的、差异显著的基因和蛋白中，与生长素和ABA信号相关的基因和蛋白最多。
通过qRT-PCR对相关基因进行验证，结果与转录组和蛋白组分析结果一致。
ABA信号途径关键调控因子PdABI4(拟南芥ABI5的同源基因)的表达量在过表达株系(PdERF48OE)中显著下调，约为野生型的1/3，而在突变体中则明显上调，约为野生型的3倍以上。此外，另一个ABA信号途径的响应基因PdRD29在PdERF48过表达植株中显著上调，但在突变体中则显著下调(图6中A和B部分)。生长素信号的关键调控基因PdARF5.1的表达也在PdERF48过表达植株中显著上调而在突变体中显著下调(图6中C部分)。这些结果也证明PdERF48可能通过ABA信号来调控木质部的发育。
实施例九
PdERF48互作蛋白的筛选和验证，方法如下：
将PdERF48构建到pGBKT7载体上，以PdERF48为诱饵筛选杨树茎特异酵母文库(参见徐丽硕士学位论文(2022，青岛农业大学))，来寻找PdERF48的互作蛋白。结果如表1所示，筛选获得多个候选蛋白，包括Potri.011G112400，Potri.010G068200和Potri.017G014800等蛋白，其中ABA合成酶Potri.011G112400出现次数最多。
进一步氨基酸序列比对发现Potri.011G112400与拟南芥NCED3为同源基因，且在杨树中有两个同源基因，分别为Potri.011G112400和Potri.001G393800。这两个基因的命名在之前研究中有不同命名形式，参照Zhou等人的研究将Potri.001G393800命名为PdNCED3，相应地将Potri.011G112400命名为PdNCED1。
结合实施例八获得的PdERF48过表达株系和突变体茎的转录组和蛋白质组数据分析，初步推测PdERF48可能与PdNCED1蛋白相互作用来调控ABA信号通路，进而影响杨树的次生生长。
表1
因此，过表达PdERF48基因可以显著增加杨树株高、茎粗和茎节数；可以显著降低木质部木纤维细胞的细胞壁厚度，显著增加木质部导管和纤维细胞的面积，进而使杨树木质部宽度显著增加，而敲除PdERF48基因的性状与过表达性状互补；PdERF48基因为乙烯响应因子，具有转录抑制活性，可能与ABA合成酶——PdNCED1蛋白相互作用来调控ABA信号通路，进而影响杨树的次生生长；本发明的研究首次揭示乙烯响应因子和ABA信号可以协同作用，系统调控木质部发育，可以为揭秘林木木质部发育机制提供了新的思路，为早日解析林木木质部发育贡献力量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，其特征在于：所述乙烯响应因子PdERF48的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，其特征在于：所述作用为过表达PdERF48基因可以显著增加杨树株高、茎粗和茎节数，敲除PdERF48基因可以显著降低杨树株高、茎粗和茎节数。
3.根据权利要求1所述的乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，其特征在于：所述作用为过表达PdERF48基因可以显著降低木质部木纤维细胞的细胞壁厚度、显著增加木质部导管和纤维细胞的面积，敲除PdERF48基因可以显著提高木质部木纤维细胞的细胞壁厚度、显著降低木质部导管和纤维细胞的面积。
4.根据权利要求1所述的乙烯响应因子PdERF48在杨树木质部发育中的作用，其特征在于：所述作用为在杨树木质部次生生长中的作用。
5.包含乙烯响应因子PdERF48的载体、菌株在杨树育种中的应用，其特征在于：所述载体包括过表达载体、敲除载体、沉默载体，菌株包括大肠杆菌、农杆菌。
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