CN113462687B - miR408及其相关的生物材料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR408及其相关的生物材料的应用。本发明首先公开了miR408在提高植物茎干的糖化效率或推迟植物茎干的木质化或降低植物茎干的木质素含量或降低植物茎干次生细胞壁的木质素含量或促进植物生长中的应用。本发明进一步公开了一种转基因植物的制备方法。本发明试验证明过表达miR408能够促进杨树增高增粗生长，推迟茎干木质化，并且降低茎干木质素含量；在没有酸预处理的情况下，显著提高杨树茎干84.76％‑92.44％的糖化效率，从而增加生物质能源的利用效率，对于林业生产中培育高效生物质能源树种具有重要的应用价值和环保效益。

Description

miR408及其相关的生物材料的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及miR408及其相关的生物材料的应用。
背景技术
84K杨(银白杨×腺毛杨，Populus alba×Populus glandulosa)，是1984年由中国林业科学研究院林业研究所张绮纹研究员从韩国引进。84K杨为雄性，不飞絮；其抗病性、耐寒性、耐旱性较强。其生长速度较快，是优良的工业用材树种和城乡绿化树种(周永学,符毓秦,樊军锋,刘玉媛,高建社,王军,符军,李均安.(2007).84k杨的生长特性及杂交可配性.东北林业大学学报,35(10),11-12.)。84K杨生长迅速，易于转化，现已建立了高效的遗传转化体系，为转基因材料的获得奠定了坚实的技术支撑(Gang Z,Kang ZS,Sun YF,Han QM,Xiao-Fei LU(2005)Establishment of gene transformation receptor system forpoplar 84K.Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture andForestry 33:87-90)。
次生生长是木本植物中最重要的生物活动过程，由维管形成层产生的一系列活动，包括维管组织形成、次生细胞壁形成、木质化(木质素沉积)、细胞程序化死亡(PCD)及心材形成等。木质素单体氧化聚合形成大分子聚合物沉积在细胞壁上之后，植物细胞就发生了木质化。木质素是植物次生生长过程中的一种重要的次生代谢物质，是植物细胞壁的重要结构组分，能够保持细胞壁的完整性，维持维管植物的机械强度，并且能够在防御病原菌的侵害和对抗环境中的各种胁迫等方面为植物提供物理屏障。
尽管木质化对于植物的生命活动是必需的，木质素的存在也给人类的生产实践带来了诸多负面作用。木质素被认为是导致生物量难分解的主要成分，能够减弱将纤维素和半纤维素转化为糖类等生物燃料的能力。木质素多糖基质的存在限制了采用化学、酶和微生物对植物细胞壁的消化能力，从而阻碍了木质纤维素生物质转化为液体生物燃料。传统上，过去的研究主要集中在木质素合成的功能基因上，期望通过基因工程的方法减少木质素的含量或改变其结构，从而使生物质材料利于造纸、提高饲料消化率或减少生物能源原料加工过程中的顽拗性。然而，将这些功能基因低表达、敲除或过度表达会显著影响正常生长。采用基因工程的方法降低木质素含量的植株，通常会由于木质部缺乏木质素沉积而影响植株正常生长，使植物瘦弱，产生的总生物量较少。木质素修饰还可以影响相关次生代谢物(类黄酮、香豆素和其他酚类化合物)的生物合成，从而影响植物的正常生长发育。
microRNAs是一种长度为21-24个核苷酸的内源性小非编码RNA，是真核生物的关键调控因子，在植物发育和逆境响应中发挥着重要作用。
因此，鉴定木本植物的生长和包括生物质消化和利用率的木材性状改良相关miRNA，对于培育高效林业生物质能源树种提供了潜在的有效方法，在生物质能源利用方面具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何改善木本植物的生长和木材性状，尤其是如何提高杨树茎干的糖化效率、推迟杨树茎干的木质化、降低杨树茎干的木质素含量和促进杨树生长。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了miR408在如下任一中的应用：
A1)提高植物茎干的糖化效率；
A2)推迟植物茎干的木质化；
A3)降低植物茎干的木质素含量；
A4)降低植物茎干次生细胞壁的木质素含量；
A5)促进植物生长；
所述miR408的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
与miR408相关的生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内。
A1)提高植物茎干的糖化效率；
A2)推迟植物茎干的木质化；
A3)降低植物茎干的木质素含量；
A4)降低植物茎干次生细胞壁的木质素含量；
A5)促进植物生长；
所述与miR408相关的生物材料为如下任一所示：
B1)所述miR408的前体；
B2)所述miR408的编码基因；
B3)所述miR408的前体的编码基因；
B4)含有B2)或B3)的表达盒；
B5)含有B2)或B3)或B4)的重组载体；
B6)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)的重组微生物；
B7)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)的转基因植物细胞系；
B8)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)的转基因植物组织；
B9)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)或B8)的转基因植物器官；
B10)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)或B8)或B9)的转基因植株；
B11)由B10)可再生细胞产生的组织培养物；
B12)由B11)产生的原生质体。
上述应用中，B1)所述miR408的前体的序列如SEQ ID NO.3所示。
上述应用中，B2)所述miR408的编码基因和B3)所述miR408的前体的编码基因的序列均如SEQ ID NO.2所示。
上述应用中，B4)所述重组载体可含有miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因的重组载体。
可用现有的植物表达载体构建含有miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因或其表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pCAMBIA-2300、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用上述蛋白质的基因构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
本发明中含有miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因的重组载体可为pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408，该pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408为将pCAMBIA-2300载体的KpnⅠ和BamHⅠ识别位点间的序列替换为SEQ ID No.2所示的miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因，且保持其他序列不变得到的载体。
上述应用中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述应用中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶。
上述应用中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明中，所述提高植物茎干的糖化效率是不经过酸处理提高植物茎干的糖化效率。生物质能源的转化过程，分为酸处理和不经过酸处理两种。酸处理虽然会提高生物质能源的转化率，但是增加能耗，污染环境，本发明不需要经过酸处理，就能够显著提高生物质能源的转化效率。具体植物茎干的糖化效率为：酶解后植物细胞壁释放出来的糖含量/酶解前植物细胞壁残渣中糖含量。
本发明中，所述促进植物生长表现在促进植物增高生长和/或促进植物增粗生长。具体的，所述增高生长为通过促进节间伸长而不是节间数来实现；所述增粗生长是通过促进节间增粗来实现。
miR408或与其相关的生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内：
D1)在培育茎干的糖化效率提高和/或木质化推迟和/或木质素含量降低和/或次生细胞壁的木质素含量降低和/或生长快的转基因植物中的应用；
D2)在制备培育茎干的糖化效率提高和/或木质化推迟和/或木质素含量降低和/或次生细胞壁的木质素含量降低和/或生长快的转基因植物产品中的应用；
D3)在植物育种中的应用。
本发明进一步提供了一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在目的植物中过表达miR408，得到转基因植物；所述转基因植物相对于目的植物的茎干的糖化效率提高和/或木质化推迟和/或木质素含量降低和/或次生细胞壁的木质素含量降低和/或生长快。
上述方法中，所述过表达miR408的方法为在植物中导入miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因。
具体的，所述miR408的编码基因和miR408的前体的编码基因的序列均如SEQ IDNO.2所示。
上述方法中，将在植物中导入miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因可通过携带有本发明miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明上述蛋白质的基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
本发明携带有本发明miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因的植物表达载体为pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408，用双酶切(KpnⅠ和BamHⅠ)的方法构建得到；具体的所述pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408为将pCAMBIA-2300载体的KpnⅠ和BamHⅠ识别位点间的序列替换为SEQ ID No.2的miR408的编码基因或miR408的前体的编码基因，且保持其他序列不变得到的载体。
本发明中所述植物为M1)或M2)或M3)或M4)：
M1)木本植物；
M2)杨柳科植物；
M3)杨属植物；
M4)84K杨。
SEQ ID NO.2所示的DNA分子也在本发明的保护范围之内。
本发明通过试验证明：过表达miR408能够促进杨树增高增粗生长，推迟茎干木质化，并且降低茎干木质素含量；在没有酸预处理的情况下，显著提高杨树茎干84.76％-92.44％的糖化效率，从而增加生物质能源的利用效率，对于林业生产中培育高效生物质能源树种具有重要的应用价值和环保效益。
附图说明
图1为过表达miR408转基因阳性植株鉴定；a为转基因阳性植株的鉴定，其中，#1-7和#9分别代表转基因阳性植株1-7和9，M代表marker，P代表阳性对照，WT是阴性对照；b为对各个转基因阳性植株的miR408成熟序列的表达量。
图2为过表达miR408基因对杨树生长的影响；其中，a是温室生长6个月的野生型(WT)和过表达miR408转基因植株1、5、6的生长状态；b为野生型(WT)和过表达miR408转基因植株1、5、6的第5和第15节间状态；c和d分别代表生长6个月的植株高度和基部直径的统计结果。“*”表示与WT相比具有显著差异(P<0.05)，“**”表示与WT相比具有极显著差异(P<0.01)。图3为过表达miR408基因对杨树茎干的木质素含量的影响；“**”表示与WT相比具有极显著差异(P<0.01)。
图4为过表达miR408基因对杨树茎干的细胞壁残渣中总糖含量(a)、酶解细胞壁释放出来的总糖含量(b)和糖化效率(c)的影响；“***”表示与WT相比具有极显著差异(P<0.001)。
图2、3和4中，#1代表过表达miR408转基因植株1或过表达miR408转基因株系1、#5代表miR408转基因植株5或过表达miR408转基因株系5、#6代表过表达miR408转基因植株6或过表达miR408转基因株系6；WT代表野生型84K杨。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的数据采用SPASS软件进行差异显著性分析。
实施例1植物表达载体pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408载体的构建
1.目的基因的获得：以野生型84K杨的cDNA为模板，以pagmiR408-F和pagmiR408-R为引物(在pagmiR408-F和pagmiR408-R的5'端分别引入KpnⅠ和BamHⅠ的识别位点和保护碱基)，通过RT-PCR的方法进行扩增，得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小，然后进行胶回收，回收产物进行测序，得到包含KpnⅠ和BamHⅠ的识别位点和保护碱基和SEQ ID NO.2所示的miR408的前体的编码基因(或miR408的编码基因)(简称为pagmiR408)的回收产物。miR408的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。miR408的前体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
引物序列如下：
pagmiR408-F：5'-GGGGTACCAGAGACAGATGAAGACGGGG-3'(下划线为KpnⅠ的识别位点，斜体为保护碱基)；
pagmiR408-R：5'-CGGGATCCGAGCCACAAGCCAGGGAA-3'(下划线为BamHⅠ的识别位点，斜体为保护碱基)。
2.载体的构建：把回收产物和pCAMBIA-2300载体(记载于非专利文献“Zhu,Yingying,et al."A xylem﹑roduced peptide PtrCLE20 inhibits vascular cambiumactivity in Populus."Plant Biotechnology Journal(2019).”)分别用KpnⅠ和BamHⅠ酶切，然后胶回收；用T4连接酶在16℃连接过夜。通过热激的方法转到大肠杆菌，在卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，鉴定正确的植物表达载体命名为pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408。
pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408为将pCAMBIA-2300载体的KpnⅠ和BamHⅠ识别位点间的序列替换为SEQ ID No.2的pagmiR408，且保持其他序列不变得到的载体。
实施例2转基因植株的获得及qRT-PCR分析
1.转基因植株的获得
采用农杆菌介导的叶盘法(该方法记载于非专利文献“Gang Z,Kang ZS,Sun YF,Han QM,Xiao-Fei LU(2005)Establishment of gene transformation receptor systemfor poplar 84K.Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture andForestry 33:87-90中)，将实施例1构建的pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408转化进入84K杨中，得到转基因植株。
分别提取转基因植株叶片的基因组DNA并以转基因植株叶片的基因组DNA为模板，以野生型84K杨叶片的基因组DNA为阴性对照，以pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408为阳性对照，分别利用以pCAMBIA-2300-35S-pagmiR408的35S启动子的5'端设计上游引物(35S-F：5'-CCACGTCTTCAAAGCAAGT-3')和用去掉实施例1中的R引物的酶的识别位点和保护碱基的引物为下游引物(5'-GAGCCACAAGCCAGGGAA-3')进行PCR扩增，进行转基因植株的鉴定，若得到的231bp的PCR产物，则说明为阳性转基因植株。鉴定结果如图1中a所示，最终得到了8个转基因阳性植株，即转基因阳性植株1-7和9。
2.qRT-PCR筛选不同表达水平的转基因植株
以生长两个月的阳性转基因植株的组培苗茎干为材料，提取RNA，反转录成cDNA。采用polyA加尾法鉴定不同阳性转基因植株中miR408成熟序列的表达量，筛选不同表达水平的转基因植株，具体方法如下：，设计荧光定量引物：5S的上游引物F：5'-TATTCTGGTGTCCTAGGCGT-3',5S的下游引物R：5'-GGACCTCCCCTACAGTATCTTC-3'；miR408的上游引物F：5'-TGCACTGCCTCTTCCCTGG-3',miR408的下游引物R：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。反应体系为：cDNA：1μL，2×miRcute Plus miRNA PreMix：10μL；上游引物：0.4μL；下游引物：0.4μL；加水至20μL。荧光定量PCR反应条件为95℃15min，94℃20s，64℃34s，40个循环。以5S rRNA基因为内参基因，每个样品技术重复3次，用2-ΔΔCT法计算荧光定量的结果。
鉴定结果如图1中b所示，8个阳性转基因植株中miR408成熟序列的表达量具有一定的差异，最终选取过表达miR408转基因植株1、5和6进行生长表型的分析。
为了获得足够数量的转基因植株进行后续分析实验，转基因植株在组培瓶里生长2个月后，将其和野生型同期扩繁，具体的方法为：
将无菌苗茎干剪下，取出放在滤纸上。用镊子和剪刀剪成一段段1cm左右的茎段，确保每个茎段上都有一个腋芽。把叶子切除2/3，保留1/3，以免蒸腾作用过强导致植株死亡。用镊子把剪好的茎段垂直插入新鲜配置的生根培养基中，标注日期时间和株系。
实施例3过表达转基因植株与野生型植株生长表型的分析
1.植株生长分析：对温室生长6个月的野生型84K杨和过表达miR408转基因株系1、5和6的植株高度、基部直径、节间数、第5节间(IN5)和第15节间(IN15)的节间长和节间宽度进行测定，每个株系测量10株，结果取平均值。
对植株高度和基部直径的测量结果进行分析，植株高度结果如图2中a和c所示：过表达miR408转基因株系1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)的生长状态和植株高度均明显高于野生型84K杨(图中以“WT”表示)；基部直径的结果如图2中d所示：野生型84K杨(图中以“WT”表示)相比，过表达miR408转基因株系1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)的基部直径也明显增加。对过表达miR408转基因株系1、5和6的植株高度和基部直径取平均值，发现过表达miR408能够促进过表达miR408转基因植株26％的增高生长和22％的增粗生长。此外，过表达miR408转基因植株的植株高度明显增加而节间数不变，说明过表达miR408能够通过促进节间伸长而不是增加节间数来促进植株增高生长。
IN5和IN15的节间长度和节间宽度的检测结果如图2中b所示：相对于野生型84K杨(图中以“WT”表示)，过表达miR408转基因株系1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)的节间长度和节间宽度也有所增加，但是IN5的节间伸长和茎干增加的幅度要明显大于IN15，说明过表达miR408可以促进植株的早期生长。
实施例4过表达转基因植株与野生型植株木质化程度的分析
通过木材切片的方法，将生长6个月的野生型84K杨和实施例2的过表达miR408转基因植株1、5、6的第5节间(IN5)、第6节间(IN6)、第7节间(IN7)、第8节间(IN8)、第9节间(IN9)、第15节间(IN15)和第20节间(IN20)切成10μm厚的切片。
1.间苯三酚染色分析野生型和过表达转基因植株茎干木质化程度的差异：
第5-8节间(IN5-IN8)的切片用间苯三酚染色发现：过表达miR408转基因植株1、5、6的IN6(第6节间)的形态和木质化细胞的数目和层数均与野生型84K杨的IN5类似，新生的木质部细胞均有3-4层，且未连接成环。同样，过表达miR408转基因植株1、5、6的IN7(第7节间)的形态和木质化细胞的数目和层数均与野生型84K杨的IN6类似，木质部细胞有4-5层，并且已经连接成环；过表达miR408转基因植株1、5、6的IN8(第8节间)的形态和木质化细胞的数目和层数均与野生型84K杨的IN7(第7节间)类似，木质部有5-6层成环的木质部细胞，以上结果说明说明过表达miR408可以推迟植株的茎干木质化。
2.CRM和SRS分析过表达转基因植株与野生型植株茎干次生细胞壁中木质素的含量
通过相对定量的方法，对第15节间(IN15)的切片进行激光共聚焦拉曼光谱(confocal Raman microspectroscopy,CRM)分析。具体方法为：采用雷尼绍共聚焦显微拉曼光谱仪(Via-Reflex532XYZ),将IN15的新鲜木材切片置于载玻片上，盖盖玻片后，置于CRM显微镜下进行观察。相关技术参数为：532nm的激光束通过50×的物镜聚焦到样本表面，激光强度是5mV，拉曼光谱采集峰为1,600cm-1，选择10×10mm的样品区域进行扫面，步长为0.5mm。发现：野生型84K杨的木质素荧光信号强度在33到533之间，而过表达植株的木质素荧光信号强度在9到378之间，说明过表达miR408转基因植株的茎干次生细胞壁中木质素含量要明显低于野生型84K杨。对第5节间(IN5)、第9节间(IN9)、第15节间(IN15)和第20节间(IN20)的切片进行受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)分析。相关技术参数为：检流计式扫描为7fps，共振式扫描为30-120fps，横向分辨率约为350nm，纵向分辨率约为1100nm，灵敏度约为103，穿透深度为≤400μm，木质素特异峰为1,600cm-1。对于野生型84K杨和每个过表达miR408转基因植株，每个样本至少选择三幅图像进行荧光强度分析。每个图像选取约50个细胞，计算所选细胞的平均荧光强度。计算结果发现过表达miR408转基因植株1、5、6的第5节间、第9节间、第15节间和第20节间这四个节间的次生细胞壁上的荧光信号均弱于野生型84K杨。
以上结果说明过表达miR408可以降低茎干次生细胞壁上木质素含量。
3.AcBr的方法分析过表达转基因植株与野生型植株茎干木质素含量
取生长6个月的过表达转基因miR408植株1、5、6和野生型84K杨(WT)的茎干，40℃烘干，研磨后采用AcBr(乙酰基溴)的方法测其木质素含量。具体方法如下：(1)称取20.5mg样品放入10ml玻璃试管中，加入5ml 25％现配的乙酰基溴，立即盖上盖子，50℃水浴4小时。(2)取出后冷却到室温，3500rpm离心15min，将上清转移到4ml玻璃管。(3)准备15ml玻璃管，先加2.5ml 2M NaOH，再加3ml醋酸并混匀，然后再加入步骤2中的液体1ml，震荡混匀，再加入0.25ml羟胺(0.5M)，混匀后，紫外吸收光280nm测定吸光值。AcBr木质素含量＝吸光度读数/17.12(mg/g/CWR)。结果如图3所示，3个过表达miR408转基因植株1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)的茎干木质素含量较野生型84K杨(图中以“WT”表示)下降10％。
实施例5过表达转基因植株与野生型植株茎干糖化效率的分析
取生长6个月的实施例2的过表达miR408转基因植株1、5、6和野生型84K杨的茎干，40℃烘干，研磨后进行细胞壁糖化分析实验。
本实施例采用气相色谱质谱(Gas chromatography and mass spectrometry,GC-MS)测定酶解前和酶解后细胞壁释放出来的糖含量，具体方法参考非专利文献“Dubois,M.,Gilles,K.A.,Hamilton,J.K.,Rebers,P.t.&Smith,F.Colorimetric method fordetermination of sugars and related substances.Anal.Chem.28,350-356(1956)”。结果如图4所示，发现3个过表达miR408转基因植株1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)中细胞壁残渣(细胞壁残渣为植物茎干研磨后，经过一系列有机溶剂萃取，去除脂溶性成分，剩余的不溶物质)中总糖含量均有一定程度的增加，但是差异并不显著(图4中a所示)；经过酶解后，过表达miR408转基因植株1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)的细胞壁释放出来的总糖含量显著增加(图4中b所示)；用酶解后植物细胞壁释放出来的糖含量/酶解前植物细胞壁残渣中糖含量代表糖化效率，计算结果表明过表达miR408转基因植株1、5和6(图中分别以“#1”、“#5”、“#6”表示)茎干的糖化效率显著增加，可提高茎干的84.76％-92.44％糖化效率(图4中c所示)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京林业大学
<120> miR408及其相关的生物材料的应用
<130> GNCFY200726
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 84K杨(银白杨×腺毛杨，Populus alba×Populus glandulosa)
<400> 1
augcacugcc ucuucccugg c 21
<210> 2
<211> 105
<212> DNA
<213> 84K杨(银白杨×腺毛杨，Populus alba×Populus glandulosa)
<400> 2
agagacagat gaagacgggg aacaggcaga gcatggatgg agctactaac agaagtacct 60
gttttggccc tacccatgca ctgcctcttc cctggcttgt ggctc 105
<210> 3
<211> 105
<212> RNA
<213> 84K杨(银白杨×腺毛杨，Populus alba×Populus glandulosa)
<400> 3
agagacagau gaagacgggg aacaggcaga gcauggaugg agcuacuaac agaaguaccu 60
guuuuggccc uacccaugca cugccucuuc ccuggcuugu ggcuc 105

Claims (7)

1.过表达miR408在如下任一中的应用：
A1)提高植物茎干的糖化效率；
A2)促进植物生长，所述促进植物生长表现为促进植物增高生长和/或促进植物增粗生长；
所述miR408是核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的microRNA；
所述植物为杨树。
2.与权利要求1中所述miR408相关的生物材料在如下任一中的应用：
A1)提高植物茎干的糖化效率；
A2)促进植物生长；所述促进植物生长表现为促进植物增高生长和/或促进植物增粗生长；
所述与所述miR408相关的生物材料为如下任一所示：
B1)所述miR408的前体；
B2)所述miR408的编码基因；
B3)所述miR408的前体的编码基因；
B4)含有B2)或B3)的表达盒；
B5)含有B2)或B3)或B4)的重组载体；
B6)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)的重组微生物；
B7)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)的转基因植物细胞系；
B8)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)的转基因植物组织；
B9)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)或B8)的转基因植物器官；
B10)含有B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)或B8)或B9)的转基因植株；
B11)由B10)可再生细胞产生的组织培养物；
B12)由B11)产生的原生质体；
所述植物为杨树。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述miR408的前体的序列如SEQ ID NO.3所示，或所述miR408的编码基因和所述miR408的前体的编码基因均如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1中所述的miR408或权利要求2或3中所述的生物材料在如下任一中的应用：
D1)在培育茎干的糖化效率提高和/或生长快的转基因植物中的应用；
D2)在制备培育茎干的糖化效率提高和/或生长快的转基因植物产品中的应用；
所述植物为杨树。
5.一种制备转基因植物的方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：在目的植物中过表达miR408，得到转基因植物；所述转基因植物相对于目的植物的茎干的糖化效率提高和/或生长快；
所述植物为杨树。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述过表达miR408的方法为在植物中导入所述miR408的编码基因或所述miR408的前体的编码基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述miR408的编码基因和所述miR408的前体的编码基因均如SEQ ID NO.2所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102409053A (zh) * 2011-11-14 2012-04-11 北京市农林科学院 一种提高植物中纤维生物质能源利用效率的方法
CN110317826A (zh) * 2019-05-22 2019-10-11 中国农业大学 调控PvGRF9含量或活性的物质在调控植物茎生长发育中的应用

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