CN105624129A - 下调木质素的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个降低木质素合成的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白,属于分子生物学中的基因技术领域，其特征在于降低木质素合成，白桦CCoAOMT基因的序列如序列表SEQ？ID？NO:1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ？ID？NO:2所示。本发明提供白桦木质素合成基因CCoAOMT并用于构建白桦CCoAOMT基因的植物表达载体，构建的植物表达载体经农杆菌浸染烟草植株与白桦植株，获得转基因烟草植株且植物茎部木质素含量降低，表明该基因具有降低烟草茎部木质素含量的功能并且能够调控木质素单体组分的变化。将7年生16个反义转化CCoAOMT基因的白桦单株进行纤维形态和化学组分分析，筛选出1、4、12、16四个具备优势的纸浆用转基因单株。本发明为利用基因工程技术降低白桦木质素含量提供了基因资源与理论依据，具有很大的应用价值。

Description

下调木质素的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白

技术领域：本发明涉及一个降低木质素合成的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域。

背景技术：

木质素为芳香族聚合物，是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质，主要存在于次生加厚的植物细胞壁中，可为植物提供机械支持，保护植物免受真菌入侵，近几十年的研究己阐明了木质素单体的主要生物合成路线，并且通过木质素调控能够提高木本植物的制浆率和草料的可消化性等。同时，植物也能适应三种木质素单体(H/G/S)间较大的比例变化。参与木质素生物合成途径的酶有十多种，其中咖啡酞辅酶A-3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的一种关键酶，主要催化羟基辅酶A酯的甲基化反应，将咖啡酰辅酶A转化成阿魏酰辅酶A。该基因与G型木质素和S型木质素合成密切相关。相关文献报道，抑制CCoAOMT表达会使植物中木质素含量普遍降低，且伴随组分的改变，G和S木质素同时降低，G木质素的下降幅度大于S木质素，S/G比值增加，最终使植物中木质素含量降低，木材结构疏松，有利于工农业生产应用。CCoAOMT近来才被证实与木质化有关。Pakusch等首先提出可能存在一种催化咖啡酰CoA(coenzymeA)甲基化的甲基转移酶；Kuhnl等与Pakusch等在欧芹和胡萝卜的细胞培养液中发现了该酶活性，由于其活性受真菌激活子诱导，起初认为与植物抗病有关。Schmitt等从欧芹中克隆了CCoAOMT的cDNA，但并未确定其功能。Ye等在百日草中首次证实CCoAOMT参与木质素的生物合成。Li和Osakabe首次从裸子植物松树中克隆了CCoAOMT基因，发现其对咖啡酞COA的活力是5-羟基阿魏酞COA的3.2倍。目前，从拟南芥、水稻、烟草、玉米等植物中已经获取了CCoAOMT基因。Zhong等^[19]获得反义CCoAOMT表达的转基因烟草，Klason木质素含量下降36％～47％。G-木质素比-S木质素减少的幅度大，S/G比值增加。Meyermans等^[9]在抑制CCoAOMT表达的转基因杨树中发现木质素含量降低12％，S/G比值增加11％。Zhong等^[19]将反义CCoAOMT转入杨树，也发现木质素含量明显下降，且结构疏松利于脱木质素。进一步证实了CCoAOMT的功能。目前，对于白桦的CCoAOMT基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦CCoAOMT基因序列及其功能的相关专利报道。

发明内容：

本发明提供一种从白桦中克隆白桦木质素合成基因CCoAOMT的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白桦次生木质部RNA，用ThermoScriptTMRT-PCRSystem反转录试剂盒，合成cDNA第一链；

(2)设计用以扩增白桦CCoAOMT片段的简并引物；引物序列为：正向引物：CCoAOMT-F：5′-AGCGATGCYCTYTAYCAGTA-3′；反向引物：CCoAOMT-R：5′-TTCCABAGVGTGTTGTCGTA-3′

(3)利用RT-PCR和RACE方法获得基因的全长cDNA，命名为白桦CCoAOMT；

PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示；

本发明构建了白桦CCoAOMT基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pBI121-CCoAOMT)经农杆菌浸染烟草植株，获得转基因烟草植株且植物茎部木质素含量降低，表明该基因具有降低烟草茎部木质素含量的功能并且能够调控木质素单体组分的变化。

构建白桦CCoAOMT基因植物表达载体的技术方案如下：

选择pBI121载体作为基本植物表达载体，在pBI121上选择XbaⅠ和BamHⅠ两个酶切位点，设计带有酶切位点和保护碱基的白桦CCoAOMT引物，并克隆出白桦CCoAOMT基因全长。双酶切质粒和白桦CCoAOMT基因，再用T4连接酶进行连接，检测构建的载体pBI121-CCoAOMT。

本发明提供的白桦CCoAOMT基因在调节烟草次生木质部木质素含量中的应用。将上述植物表达载体pBI121-CCoAOMT转化农杆菌EHA105，经农杆菌介导的叶盘法浸染，获得白桦CCoAOMT超表达的转基因烟草植株和转基因白桦植株，降低转基因烟草植株次生木质部的木质素含量，与野生型非转基因植株相比，转基因烟草木质素含量降低28.4％-50.2％。构建的植物表达载体(pBI121-CCoAOMT)能够降低转基因烟草次生木质部中木质素的含量，将7年生16个反义转化白桦CCoAOMT基因的白桦单株进行纤维形态和化学组分分析，通过综纤维素含量和酸不溶木素含量两项“优先评价指标”评价分析，筛选出1、4、12、16四个具备优势的纸浆用转基因单株，为今后利用转基因技术降低白桦木质素含量的研究提供了理论基础与基因资源。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1、本发明提供了降低植物木质素含量的白桦CCoAOMT蛋白，可用于改进与植物木质素含量，并且可用于搜寻在其他植物中调控木质素合成的相关基因。

2、本发明提供的含有白桦CCoAOMT基因重组载体，可有效控制植物的木质素含量。

3、本发明提供的白桦CCoAOMT基因具有调控植物木质素含量的功能，可用于植株木质素含量相关的发育研究中，并为植物木质素合成相关基因的功能研究提供参考资源。

4、本发明提供了反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦的综合指标测定，筛选出制作纸浆用的优势转基因植株，为转基因植株在造纸方面的研究提供了参考资源。

附图说明

图1为白桦CCoAOMT基因全长cDNA的PCR扩增显示图。

图2为植物表达载体T-DNA区域基因结构示意图。

图3为植物表达载体pBI121-CCoAOMTPCR鉴定示意图。

图4为反义转化白桦CCoAOMT转基因烟草植株与非转基因烟草植株组织化学染色对比图。

图5为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦的纤维长度分布频数示意图。

图6为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦样本化学组分测定结果示意图。

图7为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦以综纤维素含量为优先评价指标的化学组分排序示意图

图8为反义转化白桦CCoAOMT转基因单株白桦以“酸不溶木素含量”为依据，进行升序排列示意图

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：白桦CCoAOMT基因的克隆

(1)植物材料的获得

实验材料白桦次生木质部，采自东北林业大学白桦林。采集后立即冷藏到-80℃冰箱保存备用。

(2)白桦RNA的抽提

白桦总RNA使用改良的CTAB法步骤进行，使用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测总RNA的纯度和浓度。用ThermoScript^TMRT-PCRSystem反转录试剂盒合成cDNA第一链，然后用CCoAOMT-F和CCoAOMT-R进行PCR扩增，PCR反应体系：cDNA模板2μl，10×Buffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，正反向引物各1μl(20μM)，rTaqDNApolymerase0.15μl灭菌蒸馏水补足25μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸50sec，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带后与pMD18T连接，连接体系如下：目的基因3μl，Teasyvector1μl，T4DNAligase1μl，2×Buffer5μl。连接产物转化大肠杆菌，提取质粒并测序。

白桦CCoAOMT核苷酸序列分析

白桦CCoAOMT基因序列长为744bp，序列见序列表SEQIDNO:1，通过BLASTN序列分析结果表明，和白桦CCoAOMTcDNA相似性最高的是野草莓(Fragariavesca)，为88％；其次为葡萄(V.vinifera)，相似性为86％。

白桦CCoAOMT基因编码的蛋白质序列分析

白桦CCoAOMT基因总共编码247个氨基酸，序列见序列表SEQIDNO:2，通过BLASTP进行序列比对，结果表明，与白桦CCoAOMT氨基酸序列相似性最高的是楮树(Broussonetiapapyrifera)，为92％,其次为颤杨(Populustremuloides)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)，相似性均为91％。

实施例2：白桦CCoAOMT基因的植物表达载体构建

(1)白桦CCoAOMT的双酶切并进行检测

植物表达载体双酶切步骤如下：

克隆载体和植物双元载体pBI121都用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切体系如下：DNA1μg，10×FDbuffer2μl，XbaⅠ0.5μl，BamHⅠ0.5μl，灭菌蒸馏水补足20μl。混匀后37℃孵育2～3h，65℃孵育5min。双酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，按OMEGA回收试剂盒步骤回收目的片段。

(2)双酶切产物的连接

16℃过夜连接，连接体系如下：目的基因4μl，pBI121载体片段2μl，T4连接酶1μl，T4buffer2μl，灭菌蒸馏水补足20μl

(4)转化大肠杆菌及检测

将双酶切后的连接产物直接转到大肠杆菌中，使其大量表达，富集表达载体的浓度。接着将转化产物接种于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上，平板倒置于37℃恒温培养箱中培养12-18h。扩大培养的菌液进行菌液PCR鉴定。

实施例3：白桦CCoAOMT基因在烟草和白桦植株中反义表达功能分析

(1)实验材料：烟草种子和白桦腋芽用95％酒精浸泡3-5min,然后用5.5％次氯酸钠浸泡15min,再用无菌水清洗4-5遍,用无菌滤纸吸干种子表面的液体,接种到MS培养基上。待苗高1cm左右时，转至生根培养基上，从而获得烟草和白桦无菌苗。

(2)农杆菌介导的叶盘法转化烟草和白桦

a、农杆菌培养：平板上挑取EHA105菌株的一个单菌落，接种到20m1附加相应抗生素的细菌培养液体培养基(pH7.0)中，在恒温摇床上，于27℃，180r/min培养至为0.6-1.0。将菌液转入新配制的无激素相应液体培养基中，稀释至OD₆₀₀为0.2-0.3时即可用于转化；

b、菌液侵染：将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm至1cm×1cm的小块，进行菌液侵染，时间设置为10min内不同时段；

c、共培养：将叶片从菌液中取出，于无菌滤纸上吸取多余的菌液，并接种在无抗生素的分化培养基上进行共培养，设置培养基表面加一层滤纸和不加滤纸。叶片近轴面向下；暗培养条件下共培养4d；

d、选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择培养基(共培养基+kan50mg/L+ceb500mg/L)分化培养基上，25℃条件下进行选择培养。

e、继代选择培养：选择培养2—3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的分化培养基中诱导分化。

f、生根培养：待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养。

(3)转基因植株的PCR-Southern检测

将获取的转基因烟草植株提取DNA，以CCoAOMTcDNA全长序列的两端为引物，进行PCR扩增，以未进行基因转化的DNA为模板作阴性对照，以测序确认的CCoAOMTcDNA和T-vector的重组质粒为模板作阳性对照。扩增后各取2-3μlPCR产物在1％的凝胶中电泳，进行PCR-Southern杂交检测。

选择经过PCR-Southern检测为转基因阳性烟草植株和非转基因烟草植株进行木质素含量测定，测定结果如表1所示，转基因植株与非转基因植株相比木质素含量降低28.4％-50.2％。经分析比较得出，转基因植株与非转基因植株在水分含量上有差异且差异显著，在酸不容木质素含量与总木质素含量上有差异且差异极显著。

将7年生16个反义转化CCoAOMT基因的白桦单株进行纤维形态(纤维长度、长度分布、宽度、长宽比)和化学组分(水分、1％NaOH抽出物、有机溶剂抽出物、木素、综纤维素和多戊糖)分析。纤维形态测定结果如图5所示，所有转基因单株白桦均服从正态分布，从纤维长度分布均一的角度上来看，5、6优于其他单株。化学组分测定结果如图6所示，各转基因单株间的不同化学组分含量均存在显著性差异(α远小于0.05，甚至小于0.01)，测定结果具有代表性；间苯醇抽出物、热水抽出物含量变化幅度不大，极差在2.4054％之内，对整体化学组分影响较小，可作为次要因素分析。对综纤维素含量和酸不溶木素含量整体评价结果如图7和图8所示，在16个反义转化CCoAOMT单株中，1、4、12、16单株在两个方面均显现出优势，可作为优势样本根据需要进一步分析。

上述结果表明，白桦CCoAOMT基因反义表达可降低烟草植株的木质素含量，使转基因白桦的化学组分有所改变，可筛选出具备优势的纸浆用转基因单株。

表1：转基因烟草茎部木质素含量

表2：转基因烟草与野生型烟草木质素含量差异显著性分析

*，与对照组相比，差异在P<0.05内显著但是在P<0.001内不显著；**，与对照组相比，差异在P<0.001内显著。

Claims (1)

1.一种降低木质素合成的白桦CCoAOMT基因及其编码蛋白，其特征在于降低木质素合成，白桦CCoAOMT基因的序列如序列表SEQIDNO:1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如列表SEQIDNO:2所示。