CN101434937B

CN101434937B - 一种泡桐4-香豆酸：辅酶a连接酶基因及其应用

Info

Publication number: CN101434937B
Application number: CN2008102314756A
Authority: CN
Inventors: 裴海朝; 杨艳坤; 陈昌民; 熊治国; 牛静勇; 刘志刚; 叶金山; 王军军; 陈占宽
Original assignee: HENAN LVSHIDA FORESTRY NEW TECHNOLOGY INSTITUTE
Current assignee: HENAN LVSHIDA FORESTRY NEW TECHNOLOGY INSTITUTE
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2008-12-23
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2028-12-23
Also published as: CN101434937A

Abstract

本发明公开了一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶及其编码基因与应用。该4-香豆酸：辅酶A连接酶氨基酸残基序列如SEQ ID No：1所示。利用这些信息可以构建成4-香豆酸：辅酶A连接酶基因、或该基因的反义基因、RNA干扰体，用于植物材质改良，可以建立起木质素含量高、或低的新种质材料。

Description

一种泡桐4-香豆酸:辅酶A连接酶基因及其应用

技术领域：

本发明涉及一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate：coenzymeAligase，4CL)基因及其应用，属于生物工程领域，特别涉及到泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)白花泡桐〔Paulowniafortunei(Seem.)Hemsl)编码4CL基因及其应用。

背景技术：

1、关于泡桐及其泡桐木材的材质改良：

泡桐(Paulownia)为泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)落叶乔木，原产我国，除个别种分布到越南、老挝外，其他各种均为我国所特有。

泡桐是世界三大优质、速生用材树种之一，分布范围很广，二十三个省、市、自治区都有。不少地区作为四旁植树、农桐间作、林网建设的主要树种；有些地方还逐渐向山地造林发展，栽培量很大，仅河南省栽植的泡桐就达二亿株左右。泡桐生长快，如果管理得好，泡桐五六年即可成材。泡桐材质轻，纹理鲜明美观，具有易干燥、易加工、不翘、不裂、不易变形、不易燃烧、绝缘性好、耐酸耐腐、防湿隔热、导音性能好等优点，是单板与人造板生产的重要原料；特别适合制作航空、舰船模型、救生器械、乐器及家具制作等，不但用于工农业及日常生活等各个方面，而且也是我国传统的出口物资，在我国林业生产中占有特殊地位。

但是应该看到，泡桐材质的另一面：木材轻(容重低)，强度与硬度低，严重限制了它在建筑、交通、家装、家具、造纸等方面的应用。因此，改良泡桐的材质，提高其强度与硬度，拓宽其应用范围，具有重大的应用与经济价值。

泡桐的材质改良有两个方向：一是提高其强度与硬度，拓宽其在木材建筑、交通、家装与家具等方面的应用；二是提高木材中纤维素的含量，降低其木质素的比率，以提高纸浆的产量、降低对环境的污染，使之更适用于造纸。

2、关于木材的材质改良与4-香豆酸：辅酶A连接酶基因的关系：

木材的材质或特性主要是由木纤维的基本组分——木质素、纤维素的单体种类、性质及其比率与总量决定的。纤维素约占木材干重的40～50％，木质素约占15～36％，二者总计占到木材总重的70％以上，且二者均直接或间接来源于光合作用产生的光合产物。

纤维素是木材细胞中的骨架、韧性成分，是由葡萄糖组成的大分子多糖。木质素是由对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇四种醇单体形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是木材细胞间的粘合剂、刚性原料和保持性物质。

木质素生物合成是一个极其复杂的过程，涉及苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonialyase PAL)、4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate：CoAligase 4CL)、肉桂酸CoA还原酶(cinnamoyl-CoA reductase CCR)等多个基因。这些基因的功能、作用不同，并分处在木质素生物合成的源头、中、下游的不同位置，其中PAL是位于源头的第一个酶，处于最高端；4CL位于中游，而CCR则处于较下游的位置。这些酶中的任何一种酶，都不能缺失、不能替代；任一种酶的失常都将影响木质素的合成，导致材质的变化，且影响的范围、形式与结果不同。

木材材质改良的实质，就是通过改变木质素、纤维素生物合成关键酶基因，调控木质素、纤维素单体种类、性质及其比率与总量。4CL是苯丙烷类代谢途径的最后一个酶，其作用是催化不同羟基肉桂酸生成相应的硫酯(CoA酯)，即4--香豆酰-CoA、阿魏酰-CoA、5-羟基阿魏酰-CoA和芥子酰-CoA-是木质素合成的基本原料与前体。这些硫酯处于苯丙酸代谢途径和木质素特异代谢途径的分支点。在此，4CL是木质素单体合成途径上的限速酶，决定着木质素合成的方向与速度。增强4CL基因的表达，提高4CL酶的活性，可以提高木质素在木材中的比率，增强其强度与硬度；反之，沉默或抑制4CL基因，可以降低其在木材中的比率，提高纤维素的比率，用于造纸则可提高纸浆的产量，降低木质素对环境的污染。

发明内容：

本发明提供了一种来源于泡桐科(Paulowniaceae)泡桐属(Paulownia)白花泡桐〔Paulownia fortunei(Seem.)Hemsi〕的4-香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate：coenzyme Aligase，4CL)基因序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有4CL的克隆载体PUC 19/4CL，和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC19/4CL。

泡桐4CL基因的DNA序列或其片段通常可以依据本发明提供的mRNA、氨基酸序列信息资料以PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

该基因全长2026bp，CDS 1632(98-1729)bp，起始密码子ATG位于98-100bp处，终止密码子TAA位于1727-1729bp处；推测共编码543个氨基酸，见SEQ IDNo：1。通过GenBanK BLAST比对的结果，显示：泡桐与丹参(Salvia miltiorrhizaAY237164.1)、黄芩(Scutellaria baicalensis AB166768.1)、覆盆子(Rubusidaeus AF239686.1)、毛果杨(Populus trichocarpa EU603299.1)4-香豆酸：CoA连接酶基因编码序列的同源性分别为97％、97％、96％、66％。

泡桐与烟草4-香豆酸：CoA连接酶氨基酸序列(GenBank AccessionNo：AAB18637.1)同源性为84％。

对该基因及其氨基酸序列的进化与系统发育分析结果显示，泡桐的分类地位亦与现行植物分类一致。

蛋白质结构域预测表明白花泡桐4CL基因全长cDNA编码的4香豆酸：CoA连接酶，含有预计的AMP-binding位点PYSSG TTG LPKG，催化活性反应区GEICIRG和保守的Cys残基(以方框标示)，是典型的4CL蛋白。白花泡桐4CL基因全长cDNA序列已在GenBanK数据库注册，注册号为FJ230968，见SEQ IDNo：2。

含有本发明基因的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的效果和益处在于该4CL是首次被克隆、测序和的白花泡桐〔Paulownia fortunei(Seem.)Hemsi〕4-香豆酸：辅酶A连接酶基因，可用于构建具有功能4-香豆酸：辅酶A连接酶基因、基因的表达载体及其工程菌。该基因编码的4-香豆酸：辅酶A连接酶参与、影响植物木质素合成代谢过程，可以改变陆生植物，特别是用材林树种的木材结构、组成与理化特性，及其应用范围、应用价值。

可以将本发明提供的4Cl基因编码序列，或部分片段序列反向、或两段完全相同部分序列分别以正、反方向插入(置于)来源于植物或病原微生物的、其特征为在植物中具有转录活性的启动子、终止子之间，构建成功能惊异的不同4CL基因或其构建体。以目的或要求不同，可以构建成在植物任何组织和任何发育时期表达的基因(选用在基因植物的组成型表达的启动子)、在植物组织器官或发育阶段特异性表达的基因(选用组织器官或发育阶段特异性表达的启动子)、或者是人为精确控制或特殊条件诱发基因(选用诱导型启动子)。这些基因或其构建体的用途、应用范围，可以包括但不限于下列几种类型。

1、构建功能的4CL基因，用于植物的种质与材质改良：提高木材中木质素的含量或比率，增加木材的硬度、强度，扩大其应用的范围；提高农作物或经济作物茎秆的抗倒伏能力，为高产奠定基础等。

2、以4CL基因的部分片段，构建4CL基因的反义基因或RNA干扰基因，抑制植物内源4CL基因的表达，木质素合成受阻，导致木质素含量减少。但是，木材另一主要成分是纤维素，二者之和约占到木材总量的70～80％，切二者均直接或间接来源于植物的光合的碳代谢产物。在此，木质素含量的大力减少，将严重影响植物碳化物流向与分配。由此，可以顺理成章预见到这一基因的第三功能。

3、以4CL基因的部分片段，构建4CL基因的反义基因或RNA干扰基因，沉默植物内源4CL基因，调控植物、特别是用材树种木材中另一种主要成分-纤维素的代谢，育成高纤维素、低木质素植物。

本发明中4CL基因的克隆，采用的技术方案是基于基因的同源性，利用简并寡核苷酸引物的RT-PCR法，以白花泡桐RNA为模板，首先用简并引物，通过RT-PCR的方法，得到了4CL基因的部分cDNA片段。然后，据此片段提供的cDNA序列信息，设计了2条反向嵌套式引物与2条正向嵌套式引物，用RACE方法获得了未知的5’和3’端基因片段。最后，将获得的3条cDNA序列进行拼接，获得了白花泡桐4CL全长cDNA序列。将获得的4CL基因片段与和专用的克隆载体pMD19-T连接，获得pUC19-4CL质粒。利用热激法将这一质粒导入感受态E.coli细胞JM109，成为携带pUC19-4CL的大肠杆菌细胞JM109/pUC19-4CL。

附图说明：

图1为4CL简并引物扩增片段电泳结果图片。

具体实施方式：

一、本发明泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶基因mRNA克隆的具体程序与方法、步骤：

这些步骤仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列步骤中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》、《实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：泡桐部分4CL编码序列的克隆和测序：

1、简并引物的设计：通过GenBanK BLAST系统分析了植物4-香豆酸：辅酶A连接酶蛋白氨基酸的同源性，选取其完全同源部分，优选了2对简并引物，下面列出了本发明所涉及的所有PCR引物。

(1)简并引物：

B4F7 5’-CACARCARGTHGAYGGHGAVAAYCC-3’

B4R7 5’-CCWGCYTCDGTCATBCCRTADCCCTG-3’

B4F8 5’-CACARCARGTHGAYGGHGAVAAYCC-3’

B4R8 5’-CKRATGCARATYTCWCCRGSRTGRTT-3’

(2)5’RACE引物：

Outer Primer 5’-catggctacatgctgacagccta-3’

Inner Primer 5’-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3’

4.5GSP1 5’CAAAACAATCGGCGGCACGAAGGGC 3’

4.5GSP2 5’AACGGAACAATATCGAATTTCTGCATGATCAGG 3’

(3)3’RACE引物3’RACE：

Outer Primer 5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

Inner Primer 5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’

4.3GSP1 5’CCCTTCGTGCCGCCGATTGTTTTG 3’

4.3GSP2 5’AAGAGCCCGGTGGTGGACAAATATGAC 3’

(4)反义的4CL基因片段：

4R414F 5’-AGGATCCCATATGAGTGAGGGACTACGCATTGGAG-3’

4R515R 5’-GTCTAGAGCTCCGTCCGCACAGATGAAAGGTC-3’

(5)检测引物：

4ceF 5’GAAGGTGGCTCCTACAAATGC 3’

4ceR 5’CAAGACCGGCAACAGGATT 3’

2、泡桐总RNA的提取：取生长旺盛的幼嫩白花泡桐枝条，剥去韧皮部，用清洁刀片刮取木质部外周形成层部分的细胞，液氮研磨成粉，加入TaKaRa公司生产的总RNA提取试剂RNAiso Reagent(D312)，提取RNA。

3、反转录：采用TAKARA公司生产的反转录酶XL(Reverse TranscriptaseXL AMV)，以Oligo dT为引物，以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，合成cDNA。

反转录反应液组成：

泡桐总RNA 1ul

5×RT Buffer 4ul

dNTP Mixture(各10mM) 2ul

RNase Inhibitor(40U/ul) 0.5ul

Oligad(T)₁₈Primer(2.5uM) 1ul

AMV(5U/ul) 2ul

RNase Free dH₂O 9.5ul

Total 20ul

反转录液加完后轻轻混匀，离心。

反转录反应程序：室温放置10分钟；42℃恒温槽中保温1小时；冰水中急冷2分钟。

4、PCR反应：用TaKaRa LA Taq^TM Hot Star Version试剂盒进行PCR。PCR反应物组成如下(50ul)：

TaKaRa LA Taq HS(5U/ul) 0.5ul

10×LA PCR Buffer 5ul

dNTP Mixture(各2.5mM) 8ul

B4F7(或B4F8)Primer(100mM) 1ul

B4R7(或B4R8)Primer(100mM) 1ul

反转录反应液 2ul

dH₂O 32.5ul

Total 50ul

反应程序为：

94℃ 30sec

55℃ 30sec

72℃ 40sec 30Cycles

72℃ 5min。

反应结束后，取8ul进行电泳鉴定。结果显示，扩增出2条分别为0.38kb(3)、0.54(1)kb的片段，参见电泳图片1。

将此2个片段回收，插入pMD19-T vector，转化、挑单菌落鉴定、测序。测序结果见SEQ ID No：3、SEQ ID No：4。以B4F7、B4R7简并引物扩增的片段385bp，以B4F8、B4R8简并引物扩增的片段541bp，与预期相符。以此2个DNA片段序列推测的氨基酸与烟草4CL的同源性均达到93％，可以确认这两个序列均为泡桐4CL基因的部分mRNA序列。

实施例2：泡桐4CL mRNA 5’上游未知序列的获得：

一个优选的方案是使用TaKaRa公司出品的5’-FULL RACE kit(Code No：D315)。这种技术系统第一步是磷酸化，第二步是去帽子，第三步才是加接头，从理论上讲其第一步就淘汰了所有丢失了“帽子”的、中间断裂的、残缺的、不完整的mRNA，致使所克隆的5’未知末端是完整的，所克隆的mRNA才有可能是全长的。同时采用了加特异性接头与嵌套PCR等技术，使之可以高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5‘末端的全长序列。

依据获得的简并引物RT-PCR获得泡桐4CL部分编码序列，优选了2条特异的嵌套式PCR引物，见实施例1中1(简并引物的设计)。

具体的克隆程序包括：a.泡桐总RNA的提取：同实施例1中2(泡桐总RNA的提取)；b.泡桐总RNA去磷酸化处理；c.去帽子反应；d.5’RACE接头的连接；e.反转录反应；f.以外测的特异性引物GSP1与5’RACE Outer Primer【见实施例1中1(简并引物的设计)】进行PCR反应；g.以内测的特异性引物GSP2与5’RACE Inner Primer【见实施例1中1(简并引物的设计)】进行PCR反应。电泳结果显示，扩增的片段长0.93kb左右。

电泳回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化，菌落PCR鉴定、测序。测序结果见SEQ ID No：5。序列中显示出Inner Primer与4.5GSP2 Primer的位置。序列中有效序列长897bp。

实施例3：泡桐4CL mRNA 3’下游未知序列的获得：

一个优选的方案是使用TaKaRa公司出品的3’-FULL RACE Core Set Ver.20(Code No：D314)。这种技术系统使用加有特异性序列的Oligad(T)的接头及其引物等技术，使得通过已知的部分cDNA序列，可以更灵敏、特异地扩增cDNA的3’末端序列。

具体的克隆程序包括：a.泡桐总RNA的提取：同实施例1中2(泡桐总RNA的提取)；b.套式PCR反应：先以外测的特异性引物GSP1与3’RACE Outer Primer【见实施例1中1(简并引物的设计)】，进行PCR反应，再以内测的特异性引物GSP2与3’RACE Innerer引物见【见实施例1中1(简并引物的设计)】进行PCR反应。

电泳结果显示，扩增的片段长1.1kb左右。

电泳回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化，菌落PCR鉴定、测序。测序结果见SEQ ID No：6。序列中显示出Inner Primer与4.5GSP2 Primer的位置。序列中有效序列长1091bp。

实施例4：序列的拼接及其泡桐4CL全长mRNA的获得

将前述获得的三个泡桐4CLmRNA部分序列，即以(1)5’RACE、(2)以简并引物RT-PCR、(3)3‘RACE分别获得的泡桐4CLmRNA部分序列进行拼接，获得的了泡桐4CLmRNA全长序列，见SEQ ID No：2。

一个优选方案是，以3’RACE RT-PCR反转录反应液(产物)为模板，4CL mRNA5’顶端部分序列作引物(5’-TGGATCCGAAAAGGTTCAACTCTAGCA-3’)与3’RACE的Inner primer PCR获得的片段，插入pMD-19 Vector，经转化、挑单克隆，菌落PCR鉴定、测序，获得了携带泡桐4CLmRNA全长序列的cDNA的质粒pUC19-4CL。

二、关于克隆的泡桐4CL基因编码序列的功能鉴定：

1、泡桐4CL反义基因及其表达载体的构建：

为验证克隆的4CL基因的功能，构建了4CL基因的反义基因。反义基因的启动子为CaMV35S；反义片段长502bp，位于泡桐编码序列的414-915bp处，片段5’端酶切位点为Sac1，3’端酶切位点为BamHI。终止子为NOS-Ter。实际上这一反义基因是直接将这一4CL片段反向插入植物表达载体pBI1(GenBanK：AF502128)的相应位点，即取代GUS编码序列而完成的。该基因构建完成后，以HindIII、EcoRI将其切出，插入植物表达载体pCAMBIA3301质粒相应位点，构建成该基因的表达载体。

2、4CL反义基因转化：转化材料，烟草(K326)；转化方法采用农杆菌介导法

3、4CL反义基因转化泡桐株系的分子鉴定：以转化植株总DNA为模板，检测引物正、反向引物分别设计在启动子CaMV35S、终止子Nos-Ter区(引物4ceF、4ceR序列【见实施例1中1(简并引物的设计)】)，PCR。扩增片段长871bp。

4、4CL基因RNA干扰体转化泡桐株系木质素、纤维素的变化：

(1)材料及处理：选取移栽后生长正常、株高20-30厘米的转基因烟草5株及对照(非转基因烟草)，分别剪取3(第3-4)叶片，100℃、4小时烘至恒重。

(2)纤维素含量分析：精确称取干燥后的样品10mg，加入250μL72％H₂SO₄，30℃1h，加水4.5mL，120℃第2次消化1h，然后取0.75mL上清，稀释成3mL，加入2mL斐林试剂混合后，沸水浴煮沸15min后流水冷却，1500r/min5min，取上清测OD590，根据标准曲线，读取样品溶液的浓度，从而算出样品中的纤维素含量。

(3)木质素含量分析：精确称取干燥后的样品100mg，样品处理同纤维素含量测定方法.第2次消化后，将热溶液通过砂心漏斗过滤，并用热水冲洗，残渣于干燥的纸上60℃烘干4h，作为木质素含量值。分析结果见表1。

表1转基因烟草纤维素、木质素分析结果(样品量：100mg)

样品纤维素纤维素纤维纤维木质木质素木质木质素平纤维素+

重重/ 素增素平素重重/ 素增均增减(％) 木质素

(mg) 干重减(％) 均增干重减(％)

(％) 减(％) (％)

1 23.8 23.8 +7 +5.26 2.08 2.08 -41.8 -37.78 25.88

2 23.5 23.5 +5.3 2.28 2.28 -35.2 25.78

3 23.6 23.6 +6.0 2.16 2.16 -39.1 25.76

4 23.28 23.28 +4.5 2.08 2.08 -41.3 25.36

5 23.1 23.1 +3.5 2.29 2.29 -31.5 25.39

对照 22.28 22.28 0 0 3.55 3.55 0 0 25.83

对转泡桐4CL反义基因烟草纤维素、木质素含量与比率的测定结果显示：转化的泡桐4CL基因对烟草的纤维素的含量升高了3.5～7％，平均升高了5.26％；木质素降低31.5mL41.8％，平均降低了37.4％。纤维素与木质素二者间差异不显著。这些结果表明，克隆的泡桐4CL基因是有活性的，可以严重影响木质素的合成，改变其在植物中的含量与比率，同时也会对纤维素的合成构成影响。

三、关于本基因的应用说明：

1、关于相关基因的构建：

由于本发明的公开，本领域的技术人员可以利用其公知的技术，构建成多种不同的基因与具有特殊功能的构建体，例如：

植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的4Cl基因。

植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的反义基因。

植物组织器官、发育阶段特异或者非特异表达的4Cl基因的RNA干扰体。

当然，4CL基因可以构建的功能基因(或功能体)包括，但不限于这些。

2、表达载体的构建及其应用：

这些构建好的功能基因到其功能的实现，即将功能基因转入植物，到转建立已是常规技术，其程序包括四个部分：

(1)表达载体的构建：以HindIII、EcoRI酶将构建好的功能基因表达盒切出，插入植物表达载体pCAMBIA3301等质粒相应的酶切位点，构建成这些功能基因的表达载体。

(2)将携带功能基因的表达载体以液氮冻融法转入根瘤农杆菌LBA4404。

(3)利用农杆菌介导法将功能基因转化植物材料。

(4)转化体选择与鉴定：包括抗性选择；组织化学、DNA、RNA及蛋白质水平的系统鉴定；生长特性、遗传稳定性、生物安全性及生产特性鉴定等，最终实现改良植物，建立具有目的性状或特性的新型植物。

这些规程与技术已是本领域技术人员公知的，可以利用公知的技术完成、应用。

序列表

<110>河南省绿士达林业新技术研究所

<120>4-香豆酸：辅酶A连接酶基因及其应用

<160>4

<210>1

<211>543

<212>PRT

<213>泡桐(Paulownia)

<221>BINDING

<222>(188)...(199)

<221>DOMAIN

<222>(387)...(393)

<400>1

MET Glu Thr Thr Ile Thr Lys Gln Glu Asp Ile Ile Phe Arg Ser

1 5 10 15

Lys Leu Pro Asp Ile Tyr Ile Pro Lys His Leu Pro Leu His Ser

20 25 30

Tyr Cys Phe Glu Asn Ile Ser Lys Phe Ser Thr Arg Pro Cys Leu

35 40 45

Ile Asn Gly Ala Thr Asn Glu Val Tyr Thr Tyr Glu Glu Val Glu

50 55 60

Leu Ile Ala Arg Lys Val Ala Thr Gly Leu Ser Lys Leu Gly Ile

65 70 75

Gln Gln Gly Asp Thr Ile Leu Leu Leu Leu Pro Asn Ser Pro Glu

80 85 90

Tyr Val Phe Ala Phe Leu Gly Ala Ser Tyr Ile Gly Ala Ile Ser

95 100 105

Thr MET Ala Asn Pro Phe Phe Thr Pro Ala Glu Val Ile Lys Gln

110 115 120

Ala Lys Ala Ser Asn Ala Lys Leu Ile Ile Thr Gln Ala Cys Tyr

125 130 135

Val Glu Lys Val Arg Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Gly Val Lys Val

140 145 150

MET Cys Ile Asp Ala Pro Ser Ala Asp Cys Leu Gln Phe Ser Glu

155 160 165

Leu Thr Ser Ala Asp Glu Arg Asp MET Pro Ala Val Lys Ile His

170 175 180

Pro Asp Asp Val Val Ala Leu

186 190 195

Val MET Leu Thr His Lys Gly Leu Val Thr Ser

200 205 210

Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu Asn Pro Asn Leu Tyr Ile His

215 220 225

Ser Glu Asp Val MET Leu Cys Val Leu Pro Leu Phe His Ile Tyr

230 235 240

Ser Leu Asn Ser Val Leu Leu Cys Gly Leu Arg Val Gly Ala Ala

245 250 255

Ile Leu Ile MET Gln Lys Phe Asp Ile Val Pro Phe Leu Glu Leu

260 265 270

Ile Gln Lys Tyr Lys Val Thr Ile Gly Pro Phe Val Pro Pro Ile

275 280 285

Val Leu Ala Ile Val Lys Ser Pro Val Val Asp Lys Tyr Asp Leu

290 295 300

Ser Ser Val Arg Thr Val MET Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys

305 310 315

Glu Leu Glu Asp Ala Val Arg Ile Lys Phe Pro Asn Ala Lys Leu

320 325 330

Gly Gln Gly Tyr Gly MET Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala MET

335 340 345

Cys Leu Ala Phe Ala Lys Glu Pro Phe Glu Ile Lys Ser Gly Ala

350 355 360

Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala Glu MET Lys Ile Val Asp Ile

365 370 375

Glu Thr Gly Ala Ser Leu Gly Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys

380 385 390

Ile Arg Gly Asp Gln Ile MET Lys Gly Tyr Leu Asn Asp Leu Glu

395 400 405

Ser Thr Glu Gly Thr Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Thr Gly

410 415 420

Asp Ile Gly Phe Ile Asp Thr Asp Asp Glu Leu Phe Ile Val Asp

425 430 435

Arg Leu Lys Glu Ile Ile Lys Tyr Lys Gly Phe Gln Val Ala Pro

440 445 450

Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Leu Asn His Pro Tyr Ile Ser Asp

455 460 465

Ala Ala Val Val Pro MET Lys Asp Glu Gln Ala Gly Glu Val Pro

470 475 480

Val Ala Phe Val Val Arg Ser Asn Gly Ser Thr Ile Thr Glu Asp

485 490 495

Glu Ile Lys Gln Phe Ile Ser Lys Gln Val Val Phe Tyr Lys Arg

500 505 510

Ile Asn Arg Val Phe Phe Ile Asp Ala Ile Pro Lys Ser Pro Ser

515 520 525

Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Arg Leu Ala Ala Gly

530 535 540

Val Pro Asn ＊＊＊

543

<210>2

<211>2026

<212>DNA

<213>泡桐(Paulownia)

<220>

<221>cds

<222>(98)...(1729)

<400>2

gaaaaggttc aactctagca aataaagttg atacccaata ttttcccatc tctctccaca 60

attctgcttc actcgtccaa caatcaaatc attacctatg gagacgacga taacaaaaca 120

agaagacatc atattccgat cgaagctccc cgacatctac atcccaaaac acctcccctt 180

gcattcctat tgtttcgaaa atatttccaa atttagtacc cgaccatgct tgataaatgg 240

tgcgaccaac gaggtttata cctacgagga ggtcgaactg attgcacgaa aagttgcgac 300

gggcctaagt aagctcggga tccaacaagg tgacaccatt ttgctactcc tccccaactc 360

ccccgagtac gtatttgcgt tcctcggtgc atcgtatatc ggcgcgattt ctacgatggc 420

aaatcccttt tttacccctg ctgaggtcat aaagcaagcc aaggcctcca acgccaagct 480

tattattaca caagcatgct acgtggaaaa agtgagggac tacgcattgg agaagggcgt 540

caaggtgatg tgcatcgacg cgccgtcggc ggattgcctg caattctcgg agctgacttc 600

ggccgacgag cgcgacatgc cggcggtgaa aatacaccct gacgatgtgg tggcgctgcc 660

gtactcctcc ggcacgacgg ggctgcccaa gggagtgatg ctaacgcaca aggggctggt 720

gacaagcgtg gcccagcagg tcgatgggga aaacccgaat ttgtatatcc acagtgaaga 780

tgtgatgctg tgcgttttgc ctttgttcca catctactcg ttgaactccg ttttgctatg 840

cgggctgcgg gtcggggcgg cgatcctgat catgcagaaa ttcgatattg ttccgtttct 900

ggagctgata caaaaatata aagtgacgat tgggcccttc gtgccgccga ttgttttggc 960

cattgtgaag agcccggtgg tggacaaata tgacctttca tctgtgcgga cggttatgtc 1020

cggcgctgcg ccacttggga aggagctgga ggatgctgtg agaattaagt ttccaaatgc 1080

aaaacttggc cagggttatg gaatgacaga agctgggcca gtgctggcaa tgtgtttggc 1140

atttgccaaa gagccatttg agataaaatc aggtgcatgc gggactgtgg ttaggaatgc 1200

tgaaatgaaa attgttgaca tcgaaactgg tgcttctcta ggccgtaacc agcctggaga 1260

aatctgtatt agaggtgacc agattatgaa aggttatttg aatgatttag agtcgacaga 1320

gggtacaata gacaaagatg ggtggttaca caccggcgac atagggttca ttgatactga 1380

cgacgagctc ttcatcgttg atcgattgaa ggaaataatc aagtacaaag gattccaagt 1440

tgcaccggct gaactcgaag ccctcctcct caaccacccc tacatctctg atgcagcagt 1500

tgtacccatg aaagatgagc aagctggaga agtaccagtt gcttttgttg taagatcaaa 1560

tggttccacc atcactgagg atgaaatcaa gcaatttatt tccaagcagg tggtcttcta 1620

caagagaata aatcgtgtgt ttttcattga tgccattccc aagtctccat caggcaaaat 1680

attgagaaag gatttgagag caagattagc agctggtgtt ccaaattaaa aatctaaatc 1740

acatataatt tctgtctaga attttttttt tttttttaaa ttactcaatt tggaaattca 1800

aggacaaatg ttgcttgtaa attaattata tgtgtaaggt tttaaattct ggaagacaag 1860

tttggagcaa tatcttggta atcctacaat gttaggagca atatatgtaa tttttttttt 1920

ttatattttt tggttttttc ccctctttgt atcctaattt tttactgcaa aattaaagac 1980

caaagtattt gttgtttata tgtactttct ttttctcaaa aaaaaa 2026

Claims

1.一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶编码蛋白，其氨基酸残基序列如SEQ IDNo：1所示。

2.一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶编码基因，其碱基序列如SEQ ID No：2所示。

3.根据权利要求1所述的一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶的编码基因。

4.含有权利要求3所述的一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶的编码基因的表达载体。

5.含有权利要求3所述的一种泡桐4-香豆酸：辅酶A连接酶的编码基因的宿主菌。

6.权利要求3所述的一种4-香豆酸：辅酶A连接酶的编码基因在种子植物材质改良中的应用。

7.权利要求6所述的一种4-香豆酸：辅酶A连接酶的编码基因在泡桐材质改良中的应用。