CN107937411A

CN107937411A - 毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用

Info

Publication number: CN107937411A
Application number: CN201711104676.5A
Authority: CN
Inventors: 李少锋; 卢孟柱; 胡建军; 赵树堂; 辛学兵; 夏永秀; 李建波; 孙丽芳; 高旭; 刘学; 王然; 褚洋; 刘亮
Original assignee: FORESTRY EXPERIMENTAL CENTER CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: FORESTRY EXPERIMENTAL CENTER CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-11-10
Also published as: CN107937411B

Abstract

本发明提供了毛白杨PtoWRKY40基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用PtoWRKY40基因、植物表达载体以及RNAi中间载体构建了融合表达载体，获得了转基因植物。针对其木材品质性状的测试表明，该基因的转入可以有效改良树木的材性。

Description

毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种来源于速生且木材品质优良的毛白杨(Populus tomentosa Carr.)的WRKY转录因子基因，命名为PtoWRKY40。本发明还涉及PtoWRKY40基因编码的蛋白，利用PtoWRKY40基因和植物表达载体pBI121以及RNAi中间载体pCR2.1构建的融合表达载体，以及利用该基因培育优良木材品质的转基因植物的方法。

背景技术

杨树树形高大、生长周期短，具有重要的经济价值和生态价值，在我国是一个重要的短轮伐期工业用材树种之一，杨树木材品质性状的育种一直是林木育种工作的重点。2002年毛果杨基因组测序工作的顺利完成，加快了树木基因分离和应用的研究。一些与木材性状相关基因的陆续被发现、克隆和功能验证，为从基因水平上改善林木材性奠定了基础。然而，目前对于如何通过基因工程手段从基因水平上改善林木特别是杨树的材性仍然是一个亟需解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种能够有效改良树木材性的毛白杨PtoWRKY40基因。通过对该基因的应用，有利于改良杨树木材的品质，提高以该木材为原料生产的产品的质量。

本发明提供了一种毛白杨(Populus tomentosa Carr.)PtoWRKY40基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种基于上述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述毛白杨PtoWRKY40基因。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含上述表达载体的细胞。

本发明还提供了一种包含上述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A、分离和克隆毛白杨PtoWRKY40基因；

B、将步骤A所述的毛白杨PtoWRKY40基因连接到pGEM-T Easy载体中，得到连接产物PGEM-PtoWRKY40；

C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PtoWRKY40用特异的正向、反向引物进行扩增，对扩增产物和RNAi中间载体pCR2.1分别进行XbaI/XhoI和SpeI/SacI双酶切后，连接得到RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40,对所述RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40与植物表达载体pBI121分别进行XbaI/SacI双酶切后，连接得到双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40；以及

D、将所述双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。

本发明还提供了一种利用上述毛白杨PtoWRKY40基因获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建包含上述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体；

B、用构建的所述表达载体转化植物细胞；以及

C、将被转化的所述植物细胞培育成转基因植物。

本发明还提供了一种上述毛白杨PtoWRKY40基因在改良树木材性方面的应用。

基于此，本发明的突出优点在于：

本发明提供一种能够有效改良树木材性的基因PtoWRKY40。通过对该基因的应用，有利于增加转基因植株的木质部、韧皮部和形成层的宽度，增加节间均长，并且提高木质素含量、木材密度以及生物量，改善以该木材为原料生产的产品的质量。

附图说明

图1.RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40构建图；

图2.RNAi表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40构建图；

图3.转入生根培养基的PtoWRKY40转基因杨树植株；

图4.移栽的PtoWRKY40转基因84K银腺杨植株和对照植株；

图5.PtoWRKY40转基因84K银腺杨植株的PCR检测；

图6.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的PtoWRKY40和木材次生壁发育相关基因的荧光实时定量PCR分析；

图7.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的茎横切面解剖特征汇总图；

图8.PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的茎横切面解剖结构。

具体实施方式

本发明提供了一种来源于毛白杨的WRKY的同源基因PtoWRKY40基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

WRKY是一类重要的转录因子，参与抗病、响应低温和干旱胁迫、ABA信号转导、叶片衰老以及毛状体和种子发育等反应(Xu et al.,2016；Song et al.,2016；Sarris et al.,2015；Logemann et al.,2013；Birkenbihl et al.,2012)。

优选地，所述表达载体包含RNAi中间载体和植物表达载体；优选地，所述RNAi中间载体为pCR2.1，所述植物表达载体为农杆菌载体或用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体，更优选地，所述植物表达载体为pBI121、pBI 221或pCAMBIA3301。

优选地，所述表达载体还包含启动子，所述启动子至少包括以下其一：花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Actin和Ubiqutin启动子，所述启动子单独或与其它植物启动子结合使用。

优选地，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

A、分离和克隆毛白杨PtoWRKY40基因；

A、构建包含所述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体；

B、用构建的所述表达载体转化植物细胞；以及

C、将被转化的所述植物细胞培育成转基因植物。

优选地,当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麦、牧草及玉米；

当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：杨树、拟南芥、油菜及烟草。

优选地,所述植物细胞为84K银腺杨细胞。

优选地，所述表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、基因枪的方式导入所述植物细胞。

优选地,所述树木为杨树。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例中所用试剂如下：

RQ-Dnase(Promega，美国)、RNase Inhibitor(Promega，美国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、dNTP(天根，中国)、Plant TotalRNA Isolation Kit(Autolabtech，中国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)试剂盒、pGEM-T Easy试剂盒(Promega，美国)、水饱和酚(Autolabtech，中国)、氯仿(北京化工，中国)。

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

实施例1、毛白杨PtoWRKY40基因的克隆

从中国林科院华北林业实验中心的毛白杨未成熟木质部和形成层组织中提取总RNA。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，上海)处理15分钟，酚/氯仿抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行cDNA的反转录。

选择树干通直、生长旺盛的20年生毛白杨成年树木，用钻子、斧头去除胸径处树皮，暴露韧皮部组织，形成层和未成熟木质部等组织，用刮纸刀刮取未成熟木质部和形成层组织于液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，美国)处理15min，氯仿/酚抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。以带Oligo(dT)₁₅的引物，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行反转录获得cDNA。

Oligo(dT)₁₅引物序列如下：

TTTTTTTTTTTTTTT

反转录反应如下

1、RNA样品2～6μl(0.05～1μl)，加入CDS PrimerⅡA Oligo(dT)15-30 2μl，加水补足到总体积10μl，混合并短暂离心。

2、72℃温育2min，立即置于冰上2min，并短暂离心。

用PCR仪72℃温育2.5min。

3、加入下列成份：

4μl 5×First-Strand Buffer；

2μl DTT(20mM)；

2μl dNTP Mix(10mM of each dNTP)；

2μl Reverse Transcriptase。

4、轻轻混匀并短暂离心，42℃温育1.5h。

5、将离心管放于冰上终止反应，－20℃保存。

取适量上述反转录产物以进行PCR扩增分离基因。

正向引物：

5'-ATGGATAACTCATCCTGGGTT-3'

反向引物：

5'-TCACCACTTTGTGTGATTTTGC-3'

PCR条件

以反转录合成的第1链cDNA为模板，经94℃预变性3分钟后采用94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟的反应条件进行35个循环扩增，并于72℃延伸7分钟后置于4℃冰箱中备用。

PCR产物连接到pGEM-T Easy(Promega，美国)载体上用于测序，并在NCBI数据库中进行BLASTN核酸序列的同源性分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，确定通过上述PCR反应克隆到的是WRKY的同源基因。

该基因含有一个完整的开放阅读框架，全长为957bp，见SEQ ID NO：1，该基因编码的蛋白的氨基酸序列，见SEQ ID NO：2。将这个来源于毛白杨的WRKY同源基因命名为PtoWRKY40。

实施例2、用于转化的植物表达载体的构建

利用下述的正向引物和反向引物，以克隆在pGEM-T Easy载体上的PGEM-PtoWRKY40质粒为模板，扩增出特异的PCR产物，该PCR扩增产物的序列，见SEQ ID NO：3。

正向片段正向引物(含Sal I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCGTCGACGGAATTGAACCGAGTGAGC-3'

正向片段反向引物(含Xba I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCCTCTAGAGAAGCTCCTTTTCTCCATTC-3'

反向片段正向引物(含Spe I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCCACTAGT GGAATTGAACCGAGTGAGC-3'

反向片段反向引物(含Sac I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCGAGCTCGAAGCTCCTTTTCTCCATTC-3'

将PCR产物分别纯化回收后，与RNAi中间载体pCR2.1分别进行Spe I/Sac I和SalI/Xba I双酶切后，连接得到一个RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40，其图谱如图1所示。该载体进一步与植物pBI121表达载体分别进行XbaI/SacI双酶切后，连接得到一个双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40，其图谱如图2所示，经测序鉴定插入片段无误后，转化农杆菌GV3101感受态细胞。PCR筛选阳性克隆，提质粒进行限制性酶切验证后，证明成功转化入农杆菌中，该表达载体可直接用于植物，如杨树、拟南芥、烟草等植物的转化。

其中，本实施例可以使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBI121、pBI 221、pCAMBIA3301，以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。本实施例的载体也可含有适当的启动子。在实施例中可使用任何一种强启动子。这些启动子至少包括但不限于以下其一：花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Actin和Ubiqutin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括卡那霉素、庆大霉素、潮霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如GFP或荧光酶)来识别化合物的酶，或抗化学试剂(例如除萎剂)。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，基因枪等导入植物细胞。

实施例3、PtoWRKY40基因的杨树遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘转化法对84K银腺杨组培苗进行PtoWRKY40基因的遗传转化，具体操作步骤如下：

(1)在超净台中，从培养瓶中取出健壮生长的84K银腺杨组培苗，用手术刀片沿与主脉垂直每隔5mm左右划刀口，使叶片产生伤口。

(2)将叶片在含目的基因表达载体的农杆菌菌液中浸泡10-15min，立即用无菌灭菌水冲洗一遍；将接菌后的叶片平铺于1/2MS固体培养基表面，室温暗共培养2-4d。

(3)将共培养叶片转移至含特美汀(200mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS分化培养基中。

(4)继代选择培养：每2-3周后，外植体更换一次选择培养基使其诱导分化。

(5)待不定芽长到1cm以上时，将其切下并插入含特美汀(200mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的生根培养基上进行生根培养，如图3所示，转基因杨树植株生根培养20天，获得转基因植株。

分化培养基组成：

含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.05mg/L，特美汀(200mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS培养基。

生根培养基组成：

含IBA 0.05mg/L，NAA 0.02mg/L，特美汀(200mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的1/2MS培养基。

实施例4、PtoWRKY40转基因84K银腺杨植株的PCR检测

如图4所示，为将在生根培养基上正常生长的转基因植株移栽到温室，正常水肥管理，5个月后的培养结果，比例标尺Scale bar为39.82cm。其中a，b，c为RNAi空载体转基因杨树对照植株，d，e，f为RNAi表达载体转基因杨树植株。对照和转基因84K银腺杨植株的DNA提取采用CTAB法(王关林和方宏筠，2002)。根据pBI121载体上的NPTII序列设计引物，对遗传转化后的再生植株进行PCR检测。引物序列为:

正向引物：

5'-ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT-3'

反向引物：

5'-GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'

PCR结果如图5所示，可见在所检测的抗卡那霉素的100株84K银腺杨中，12株扩增出约0.7kb的DNA片段，从而可以初步推断这些植株为PtoWRKY40基因的阳性转化植株或者空载体转基因杨树植株。M为DL2000 Marker；1-10:RNAi表达载体转基因杨树植株；11-12:RNAi空载体转基因杨树对照植株；CK+:阳性对照质粒；CK-:非转基因杨树植株。

实施例5、PtoWRKY40转基因84K银腺杨及其对照植株的PtoWRKY40和木材次生壁发育相关基因的荧光实时定量PCR分析

转基因山新杨植株的RNA提取按照实施例1描述的方法进行，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega,美国)进行cDNA的反转录。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计荧光实时定量PCR引物，根据PtoWRKY40、Pto4CL3(4-香豆酰-CoA连接酶基因)、PtoPAL2(苯丙氨酸解氨酶基因)、PtoCCoAOMT1(咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因)、PtoC4H1(肉桂酸4-羟基化酶基因)、PtoCCR1(肉桂酰辅酶A还原酶基因)的编码区序列，设计1对能够扩增200bp左右片段的引物，并以微管蛋白基因Tubulin作为内参基因。PtoWRKY40基因、内参基因和次生壁发育相关基因的荧光实时定量PCR引物序列如下：

PtoWRKY40正向引物：

5'-CTGGTGGCAACTTATGAA-3'

PtoWRKY40反向引物：

5'-GCTGCTGTGAAATTGGGA-3'

Tubulin正向引物：

5'-CTGCCCGTTGCTCTGATGATTCA-3'

Tubulin反向引物：

5'-CCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3'

Pto4CL3正向引物：

ACTAGCCCATCCAGAGATATCCGA

Pto4CL3反向引物：

TCATCTTCGGTGGCCTGAGACTTT

PtoPAL2正向引物：

CCTAGAAGCCATCACCAAGTTGCTC

PtoPAL2反向引物：

GTTTCTCCATTGGGTCCCACG

PtoCCoAOMT1正向引物：

TTGGTGGGCTGATTGGGTA

PtoCCoAOMT1反向引物：

GCTCCAAAACAAAGTCCCTGT

PtoC4H1正向引物：

5'-CCCTCTTGGGTTCTTTCGTT-3'

PtoC4H1反向引物：

5'-CAAACACGGGGACAGGTATA-3'

PtoCCR1正向引物：

5'-GGCTAAGGAGAAAGGGGTGG-3'

PtoCCR1反向引物：

5'-GCCGGTGAGGTACTTGAGGA-3'

PCR反应按照SYBR Premix Ex Taq^TM(TaKaRa，日本)试剂盒提供的方法进行：在PCR8连管中依次加入10μL SYBR Premix Ex Taq^TM、0.4μL PCR Forward primer、0.4μL PCRReverse primer、0.4μL ROX Reference dye II、2μL cDNA和6.8μL灭菌蒸馏水，终体积为20μL，轻微离心，收集到管底。PCR反应在ABI 7500Real-time PCR仪上按照下列程序进行：95℃10秒；然后95℃5秒，59℃34秒，共40个循环。

PCR结束后，制作熔解曲线检查是否有非特异扩增，然后应用ABI sequencedetection system分析软件分析定量PCR结果。

结果见图6，PtoWRKY40转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403中木材次生壁发育相关基因如苯丙氨酸解氨酶基因PtoPAL2、肉桂酸4-羟基化酶基因PtoC4H1、肉桂酰辅酶A还原酶基因PtoCCR1、4-香豆酰-CoA连接酶基因Pto4CL3和咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因PtoCCoAOMT1的表达水平，与对照相比提高了1.152-3.317倍，表明PtoWRKY40调控木材次生壁发育相关基因的表达。图6的对照为RNAi空载体转基因杨树植株；PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403分别为RNAi表达载体转基因杨树的3个植株。

实施例6、PtoWRKY40转基因山新杨植株的解剖结构分析和木质素、木材密度以及生物量测定

采用石蜡切片技术进行茎横切面解剖并制作切片，以观察韧皮部、形成层和木质部的细胞层数、数目变化及次生生长情况。并采用SPSS软件(IBM公司)对测定的解剖特征指标分别进行单因素方差分析(One-Way Anova)。如图7所示，其中的图a-c分别示出了RNAi空载体转基因对照植株、转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403的木质部、韧皮部和形成层的宽度和层数。其中，转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403的木质部、韧皮部和形成层的宽度相比RNAi空载体转基因对照分别提高了36.55％-51.71％、13.40％-21.78％和10.69％-15.27％。单因素方差分析结果表明，转基因植株的木质部、韧皮部和形成层的宽度与对照相比均有显著性差异，具体的sig值分别为0.003、0.001和0.004，图7d示出了转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403及其对照的节间均长和木质部宽度/韧皮部宽度比值。其中，转基因植株PtoWRKY401的节间均长最长，达到2.12cm。图8示出了转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403及其对照植株的茎横切面解剖结构。其中，图a、b分别示出了RNAi空载体转基因对照植株和RNAi表达载体转基因杨树植株的韧皮部和形成层的解剖结构。其中，xy、cz、ph分别指木质部、形成层、韧皮部。图c、d分别示出了RNAi空载体转基因对照植株和RNAi表达载体转基因杨树植株的木质部、韧皮部和形成层的解剖结构，标尺Scale bar为35μm。

木质素是构成植物细胞壁的主要成分之一，是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。木质素具有高热能，其分子中的碳氢含量高达70％-80％，是植物各组分中蕴藏太阳能最高的组分。如图7e所示，为转基因植株PtoWRKY401、PtoWRKY402和PtoWRKY403及其RNAi空载体转基因对照植株的木质素含量进行测定的结果，发现两者差异明显。与对照株相比，PtoWRKY40转基因植株的木质素含量提高了20.89％-31.75％(sig＝0.013)。高木质素含量的PtoWRKY40转基因杨树可应用到化工和木材加工领域，用来制作混凝土减水剂、阻燃材料、冶炼矿粉粘结剂等。

木材密度是是木材性质的一个重要指标，通过木材密度可以推断木材的工艺性质和木材的干缩、膨胀、硬度、强度等木材物理力学等性质。如图7e所示，PtoWRKY40转基因植株的木材密度相比对照株提高了30.77％-39.74％(sig＝0.008)，表明PtoWRKY40转基因植株的木材强度增强，硬度增大，力学性质得到改良，可以用来制造中、高密度纤维板。

我国木材消耗量大，木材短缺和森林资源不足制约了国民经济的发展。本发明中转基因杨树植株的总生物量相比对照明显提高，如图7f所示，与RNAi空载体转基因对照株相比，PtoWRKY40转基因杨树植株的生物量提高了81.83％-92.38％(sig＝0.003)，表明利用转基因技术来操纵杨树PtoWRKY40基因的表达对提高杨树产量有明显的影响，为培育新型高产转基因杨树提供了重要参考。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国林业科学研究院华北林业实验中心

<120> 毛白杨PtoWRKY40基因、其表达载体和构建方法以及应用

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> Populus tomentosa Carr.

<400> 1

atggataact catcctgggt tgatacttct ttggatctta atattaatcc tccaagagtg 60

aaaagtgatg ctccagttga tgcagaaagt ttcggggtac caagaaaaat gaaacccact 120

ttcatgttcc agaccaagcc ttcagcgaaa gaagagactg gagccataga agaggaattg 180

aaccgagtga gcgaagaaaa caggaagctc actgaaatgc taactgtgat gtgtgagaac 240

tacaatgctt taagaaacca gttgatggat tgcatgtgca agaatggaga aaaggagctt 300

tatggcccat caaagaaaag aaagtctgca agcagcaaca acaacgataa taacattgca 360

atgaatggga actctgagag tagctcaacc gatgaagaat tgtccaagaa accaagggaa 420

gaagtcatca aagctaagac ttccagggct tatgtcagga ctgaagcggg tgataaaagc 480

cttatcgtga aagatggata tcaatggagg aaatatggcc aaaaggtcac aagagataac 540

ccttctccaa gagcttactt caaatgctct tttgctccaa gctgccctgt caagaagaag 600

gttcaaagga gcattgacga ccaatctgtt ctggtggcaa cttatgaagg agagcacaac 660

catccacacc cgccaatgga ggcaacatct ggttcaagcc atggtctaac actcggttca 720

gtaccctgct ccgcttctct agcctcatct gggaaaacca atattactct tgatctcaca 780

aaatctaagt ccagcaatga tgccaaaagt tcaaaaccaa aaactgatgc acctgaagtc 840

cggcaattct tggtggaaca gatggcctct tcgttgacga aagatcccaa tttcacagca 900

gcactggccg cagcaacctc aggaagaatg ttgcagcaaa atcacacaaa gtggtga 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> Populus tomentosa Carr.

<400> 2

Met Asp Asn Ser Ser Trp Val Asp Thr Ser Leu Asp Leu Asn Ile Asn

1 5 10 15

Pro Pro Arg Val Lys Ser Asp Ala Pro Val Asp Ala Glu Ser Phe Gly

20 25 30

Val Pro Arg Lys Met Lys Pro Thr Phe Met Phe Gln Thr Lys Pro Ser

35 40 45

Ala Lys Glu Glu Thr Gln Ala Val Glu Glu Glu Leu Asn Arg Val Ser

50 55 60

Glu Glu Asn Arg Lys Leu Thr Glu Met Leu Thr Val Met Cys Glu Asn

65 70 75 80

Tyr Asn Ala Leu Arg Asn Gln Leu Met Asp Cys Met Cys Lys Asn Gly

85 90 95

Glu Lys Glu Leu His Gly Pro Thr Lys Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser

100 105 110

Asn Asn Asn Asp Asn Asn Ile Ala Leu Asn Gly Asn Ser Glu Ser Ser

115 120 125

Ser Thr Asp Glu Glu Leu Ser Lys Lys Pro Arg Glu Glu Val Ile Lys

130 135 140

Ala Lys Thr Ser Arg Ala Tyr Val Arg Thr Glu Ala Gly Asp Lys Ser

145 150 155 160

Leu Ile Val Lys Asp Gly Tyr Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val

165 170 175

Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg Ala Tyr Phe Lys Cys Ser Phe Ala

180 185 190

Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys Val Gln Arg Ser Ile Glu Asp Gln

195 200 205

Ser Val Leu Val Ala Thr Tyr Glu Gly Glu His Asn His Pro His Pro

210 215 220

Ser Met Glu Ala Thr Ser Gly Ser Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Ser

225 230 235 240

Val Pro Cys Ser Ala Ser Leu Ala Ser Ser Gly Lys Thr Asn Ile Ala

245 250 255

Leu Asp Leu Thr Lys Ser Lys Ser Ser Asn Asp Ala Lys Ser Ser Lys

260 265 270

Pro Lys Tyr Asp Ala Pro Glu Val Arg Gln Phe Leu Val Glu Gln Met

275 280 285

Ala Ser Ser Leu Thr Lys Asp Pro Asn Phe Thr Ala Ala Leu Ala Ala

290 295 300

Ala Ile Ser Gly Arg Met Leu Gln Gln Asn Asp Thr Lys Trp

305 310 315

<210> 3

<211> 128

<212> DNA

<213> Populus tomentosa Carr.

<400> 3

ggaattgaac cgagtgagcg aagaaaacag gaagctcact gaaatgctaa ctgtgatgtg 60

tgagaactac aatgctttaa gaaaccagtt gatggattgc atgtgcaaga atggagaaaa 120

ggagcttc 128

Claims

1.一种毛白杨(Populus tomentosa Carr.)PtoWRKY40基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种基于权利要求1所述毛白杨PtoWRKY40基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含RNAi中间载体和植物表达载体pBI121；优选地，所述RNAi中间载体为pCR2.1，所述植物表达载体为农杆菌载体或用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体，更优选地，所述植物表达载体为pBI121、pBI 221或pCAMBIA3301；

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含权利要求3所述的表达载体的细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌或农杆菌细胞。

7.一种权利要求4所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A、分离和克隆如权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因；

C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PtoWRKY40用特异的正向、反向引物进行扩增，对扩增产物和RNAi中间载体pCR2.1分别进行Spe I/Sac I和Sal I/Xba I双酶切后，连接得到RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40；对所述RNAi中间载体pCR2.1-PtoWRKY40与植物表达载体pBI121分别进行XbaI/SacI双酶切后，连接得到双元表达载体pBI121-pCR2.1-PtoWRKY40；以及

8.一种利用权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建包含权利要求1所述毛白杨PtoWRKY40基因的表达载体；

B、用构建的所述表达载体转化植物细胞；以及

C、将被转化的所述植物细胞培育成转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括以下其一：水稻、小麦、牧草及玉米；

当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括以下其一：杨树、拟南芥、油菜及烟草；优选地，所述植物细胞为84K银腺杨细胞；优选地，所述表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、基因枪的方式导入所述植物细胞。

10.一种根据权利要求1所述的毛白杨PtoWRKY40基因在改良树木材性方面的应用。