CN110592101A

CN110592101A - 油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用

Info

Publication number: CN110592101A
Application number: CN201910994541.3A
Authority: CN
Inventors: 王道杰; 杨俊楠; 陈浩; 丁群英; 杨翠玲
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-10-18
Also published as: CN110592101B

Abstract

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及用于制备与木质素相关转基因植物的应用。所述油菜转录因子BnWRKY184的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列长度为645bp，氨基酸序列长度为215个氨基酸。本发明提供油菜转录因子BnWRKY184具有负调控作用，可以直接过量表达抑制植物木质素和纤维素合成基因的表达从而阻碍它们的生物合成，抑制厚壁组织发育，降低木质化程度，为后续改造油菜木质素和纤维素含量、菜用油菜、饲用油菜和绿肥油菜育种提供理论依据和相关基因。

Description

油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用。

背景技术

油菜是我国第一大油料作物，国产菜籽油占国产油料作物产油量的55％以上，发展油菜生产对维护国家食用油供给安全具有重要的战略意义。近年来，我国油菜科技工作者的大量研究充分证明了油菜的多功能利用价值。以油用为主，因地制宜地拓展饲用、肥用、菜用、花用、蜜用等功能，能够大幅提高油菜种植效益。随着“双低”油菜的大面积推广，油菜茎、叶可做为蔬菜食用。油菜菜薹是口感很好的蔬菜：研究表明十字花科蔬菜具有较好的防癌抗癌效果，油菜同属十字花科芸薹属，油菜薹作为蔬菜食用，香甜可口、营养丰富，研究表明：油菜菜薹含有大量的胡萝卜素(0.038g/kg)、维生素C(43.8mg/100g)和a-维生素E(mg/100g)等，其含糖量在9-12％之间。油菜也可以作为青饲料，现在科学家也培育出了作为青饲料的油菜品种。研究表明：饲料油菜蛋白质含量与豆科牧草相当，其他营养成分也较高。利用双低饲料油菜喂养牛，在饲喂2个月后，双低饲料油菜组较青稞秸秆组每头牛增重19-22公斤，多增重70.37-78.57％；利用青饲料喂羊也有利于育肥，羊能提早3-4个月出栏，大大降低了成本。因此，利用冬前2-3个月的农田空闲时间复种饲料油菜，青饲料收入400-500元，加上饲养增值，增收近1000元/亩。同时，复种饲料油菜使大面积裸露土地增加2-3个月的绿色覆盖期，保护水土，生态效益显著。

食用油菜、饲用油菜和肥用油菜均要求木质素和纤维素含量要低，这样一方面食口性好，另一方面易消化和降解。因此，降低食用油菜、饲用油菜和肥用油菜均木质素和纤维素含量具有非常重要的意义。

木质素是维管植物次生细胞壁的重要组分之一，具有重要的生物学功能。木质素分子与细胞壁中的纤维素、半纤维素等多糖分子相互交联，增加了植物细胞和组织的机械强度，其疏水性使植物细胞不易透水，利于水分及营养物质在植物体内的长距离运输。然而木质素的存在也给人类的生产实践带来诸多负面影响，如蔬菜中的木质素过多会影响食口性和消化性，饲草中的高木质素含量则影响牲畜的消化吸收，降低了饲草的营养价值；过高的木质素含量也影响了人类对生物质能源的发酵利用，绿肥中纤维素过多会使得降解周期加长，影响土壤的肥力效果。因此，利用基因工程改造植物木质素的含量意义重大。

WRKY家族是植物特有的转录因子，主要参与并调控植物生长发育、形态建成、代谢调控和抗逆信号转导途径建立。WRKY家族转录因子具有相同的结构特征，N端都有包含WRKYGQK七肽序列的WRKY结构域，C端则含有C2H2-或C2HC-类型的锌指结构。根据这些特点，WRKYs可以分成三个家族：第Ⅰ家族含两个WRKY结构域和两个C2H2锌指结构，第Ⅱ家族含一个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构，第Ⅲ家族含一个WRKY结构域和一个C2HC锌指结构。在拟南芥中，NAC、MYB以及WRKY类转录因子都参与了对木质素生物合成的调控。AtWRKY12可与AtNST2的启动子区结合并对其表达进行负调控；AtNST1和AtNST2在调控花药壁的次生壁的增厚中功能有冗余。研究油菜BnWRKY184基因在植物茎秆木质素中的作用，为后续改造油菜木质素和纤维素的含量具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用，BnWRKY184基因在植物中具有负调控作用，可以直接通过抑制植物木质素和纤维素合成基因的表达，从而阻碍木质素和纤维素的生物合成，导致细胞壁发育减缓且木质化程度降低。

本发明的第一个目的是提供一种油菜转录因子BnWRKY184，所述油菜转录因子BnWRKY184的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述的油菜转录因子BnWRKY184的克隆方法，其特征在于，提取油菜总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板、根据扩增引物BnWRKY184-F和BnWRKY184-R进行PCR扩增；BnWRKY184-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为5’-ATGGAAGGAGGAGGAAGAAGA-3’，BnWRKY184-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，5’-TTAAAAGGAAGAGAGAGAATC-3’。

本发明的第三个目的是提供一种所述的油菜转录因子BnWRKY184在调控植物木质素合成、纤维素合成及细胞壁发育中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种含有所述的油菜转录因子BnWRKY184的过表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种含有所述的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184的宿主细胞。

本发明的第六个目的是提供一种含有所述的油菜转录因子BnWRKY184的宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。

与现有技术相比，本发明提供的一种油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用，至少具有以下有益效果：

油菜转录因子BnWRKY184具有负调控作用，可以直接通过抑制植物木质素和纤维素合成基因的表达从而阻碍其木质素和纤维素的生物合成，抑制厚壁组织发育，降低木质化程度，该基因为完善植物木质素调控网络提供新的证据，对后续研究油菜茎秆以及作物其他关键农艺性状，如菜用和饲料用油菜、绿肥油菜、秸秆降解效率等的改良均具有重要的理论及实践意义，同时也为利用基因工程调控油菜木质素和纤维素含量提供了新的途径。

附图说明

图1是构建的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184图谱；

图2是阳性转基因拟南芥的筛选；图2A：为体式显微镜下明场视野，图2B为体式显微镜下荧光视野，图中荧光点为阳性转基因拟南芥种子；

图3是各纯合转基因株系T3代转基因植株的半定量RT-PCR检测电泳；BnActin为内参基因；

图4是本发明的BnWRKY184基因超量表达拟南芥花序茎木质素UV-B自发荧光结果；图4A为野生植株花序茎基横切面UV自发荧光，图4B为过表达转基因株系花序茎基横切面UV自发荧光，图中心的圈区代表木质素，比例尺为100μm；

图5是本发明的BnWRKY184基因超量表达拟南芥花序茎间苯三酚染色结果图；图5A、图5B分别为野生植株、过表达转基因株系花序茎基横切面间苯三酚染色，红色区域代表木质素，比例尺为100μm；图5C为野生型和转基因拟南芥茎基的直径；图5D为野生型和转基因拟南芥茎基的横切面积；图5E为野生型和转基因拟南芥茎基横切中厚壁组织所占面积；图5F为野生型和转基因拟南芥茎基横切中厚壁组织面积占总面积的比值；

图6是本发明的BnWRKY184基因超量表达拟南芥中次生细胞壁合成关键基因的表达分析图；图6A-F分别为木质素和纤维素合成相关基因CesA7、CesA8、NST2、PAL4、F5H、4CL在野生型和转基因拟南芥中的表达量；

图5-6中“*”为p<0.05的显著水平，**为p<0.01的显著水平；

图3、图5-6中，WT为野生植株、OE1、OE2、OE3和OE4为三个过表达转基因株系T3代转基因植株。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下面各实施例以及上述发明内容中未注明具体条件的试验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为甘蓝型油菜(Brassica napus L.；中国农业科学院油料作物研究所提供的中双11)和拟南芥WT(Arabidopsis thaliana，Col-0；美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司)，质粒pEarley-Gate103(美国拟南芥生物资源中心)。

实施例1甘蓝型油菜耐旱蛋白编码基因BnWRKY184序列的克隆

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)提取甘蓝型油菜幼苗总RNA，其具体方法是：收集甘蓝型油菜幼苗150mg，至于相应标记的EP管中，然后加入1mL Trizol试剂，快速混匀冰上放置10min；加入0.2mL氯仿，轻轻匀速上下颠倒30s，冰上静置8min；4℃，12000rpm离心20min；将上清转移到一个新的RNase free EP管中，加入0.5mL预冷过的异丙醇轻轻混匀，静置3-5min，4℃，12000g离心20min沉淀RNA；RNA沉淀用1mL 75％(v/v)乙醇洗涤后晾5min，溶于适量DEPC处理过的水中，-80℃保存备用。

通过RT-PCR扩增得到BnWRKY184的cDNA序列，具体方法是：

依据南京诺唯赞公司的HiScriptⅡ1st Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行后续实验：1μg总RNA和试剂盒中的部分试剂混合(4×Gdna wiper Mix 4μL,RNasefree Water to 16μL)，42℃处理2min之后，继续加入试剂混合5×HiScriptⅡqRT SuperMixⅡ4μL，混匀后，50℃处理15min；80℃处理5ses，完成反转录反应。

吸取1μL上述反转录产物，作为模板进行PCR反应：95℃5min后进入扩增程序：95℃30s、58℃30s、72℃30s，32个循环后，72℃5min。琼脂糖凝胶电泳后回收BnWRKY184基因，备用。

PCR所用引物如下：BnWRKY184-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为5’-ATGGAAGGAGGAGGAAGAAGA-3’，BnWRKY184-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，5’-TTAAAAGGAAGAGAGAGAATC-3’。

实施例1扩增得到的油菜转录因子BnWRKY184的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列长度为645bp，氨基酸序列长度为215个氨基酸。

油菜转录因子BnWRKY184的核苷酸序列：

油菜转录因子BnWRKY184的氨基酸序列：

实施例2转BnWRKY184基因植株的获得

1、甘蓝型油菜BnWRKY184基因植物过表达载体的构建：将RFP基因(红色荧光蛋白基因)重组到pEarleyGate103质粒上，得到pEarleyGate103-RFP载体，备用；以实施例1制备的反转录产物作为模板进行PCR反应、PCR程序同实施例1，PCR所用引物为BnWRKY184-F2和BnWRKY184-R2；利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的扩增得到的BnWRKY184基因通过BP反应(BP Clonase II Enzyme Mix，Invitrogen)重组到pDONR207质粒中，得到pDONR207-BnWRKY184重组载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的庆大霉素筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR Clonase II EnzymeMix，Invitrogen No.11791-020)将pDONR207-BnWRKY184的BnWRKY184基因重组到pEarleyGate103-RFP载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184，结果如图1所示。

需要说明的是，为了根据Gateway重组技术构建基因的甘蓝型油菜BnWRKY184基因植物过表达载体，通过Primer 5.0软件设计以下引物进行目的基因的克隆：

5’端引物(BnWRKY184-F2)：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAAGGAGGAGGA AGAAGAG-3’，SEQ IDNO.5；其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列；

3’端引物(BnWRKY184-R2)：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAAAGGAAGAGAGAGAATCATGG-3’，SEQ IDNO.6；其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列。

2、农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184通过电转化的方式转化农杆菌GV3101，电转化条件如下：电压2400V，电容25F，阻抗200Ω，电击杯1mm；用50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到含利福平50mg/L和卡那霉素50mg/L的YEP液体培养基中，于恒温摇床上28℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基重悬OD600＝0.8-1.2，得到侵染培养溶液；侵染培养基配方为：1/2MS，5g/100mL蔗糖，0.05g/100mL silwetL-77，pH5.7。将拟南芥Col-0倒置使花苞浸没在侵染培养溶液里30-40s，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养24h后去掉保鲜膜，正常条件25℃、16h光照、8h黑暗继续培养直至收获种子。

3、转基因株系的筛选：将收获的转基因拟南芥种子在体式显微镜下观察种皮颜色，挑选能在种皮上观察到红色荧光的阳性种子进行种植，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的BnWRKY184过表达的拟南芥T3代转基因株系。结果如图2-3所示。图2是阳性转基因拟南芥的筛选，图3是各纯合转基因株系T3代转基因植株的半定量RT-PCR检测电泳；BnActin为内参基因。

实施例3转基因拟南芥花序茎横切面染色和细胞壁厚度观察

以实施例2获得的拟南芥T3代转基因株系和野生型拟南芥为实验对象，分别取生长35d的超量表达T3代拟南芥与野生型拟南芥同位置的茎段，徒手切片，将切片进行Wiesner染色。Wiesner染色：切片用2％(v/v)间苯三酚(溶于体积分数95％乙醇)染色5min，转入15％(v/v)HCl浸泡3min后直接封片观察。由于转基因的原因，转基因植株的直径小，且次生壁发育受影响，所以我们用荧光束宽度占厚壁组织宽度的比例来体现BnWRKY184超量表达植株与野生型拟南芥的区别。图4是本发明的BnWRKY184基因超量表达拟南芥花序茎木质素UV-B自发荧光结果，木质素在UV-B照射下发出蓝色荧光，由图4可知，与野生型拟南芥相比，BnWRKY184超量表达植株花序茎中木质部和束间纤维细胞的细胞壁的厚度出现显著降低。Wiesner染色可以将木质素特异性染成紫红色。图5是本发明的BnWRKY184基因超量表达拟南芥花序茎间苯三酚染色结果图，由图5可知，BnWRKY184超量表达植株的染色区域与野生型拟南芥相比减少且着色程度较浅，这说明BnWRKY184超量表达植株的厚壁组织生长被抑制。

实施例4转基因拟南芥次生细胞壁增厚相关基因表达量检测

通过qRT-PCR对BnWRKY184超量表达(拟南芥T3代转基因株系)、野生型拟南芥中的次生细胞壁增厚关键基因的表达量进行了分析，结果参见图6。从图中可以看出，BnWRKY184超量表达拟南芥株系中的纤维素和木质素合成相关基因AtCesA7、AtCesA8、AtNST2和AtPAL4的表达量显著降低。表达模式分析结果表明BnWRKY184通过抑制木质素和纤维素合成关键基因的表达来阻碍厚壁组织的发育。

需要说明的是本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学

<120> 油菜转录因子BnWRKY184、克隆方法、载体、宿主细胞及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 1

atggaaggag gaggaagaag agtagtagtt aataattacg atctacaaca agtgacgatc 60

caagagaata tgaacttcct cattccattt gaagaaacca atgtcttaac cttcttttct 120

tcctcctctt catcttctct ctcatctcct tctttcccca tccacaactc ttcttcaacc 180

actaatacta ctcatgcacc tctagggttt cctaataatc ttcagggtgg aggacccttg 240

ggatcaaagg tgcttaatga tgatcaagat aattttagag gtggaattaa caatgatgcc 300

cattctagtt cttggtggag atcaagtagt gggagtggag agtcgaagaa caaagtgaag 360

ataaggagga agctaagaga gccaagattc tgtttccaga caaaaagcga tgtagacgtt 420

cttgacgatg gctacaaatg gcgtaaatac ggtcagaaaa tcgtcaagaa cagccttcac 480

cccaggagtt attacagatg cacacacaac aactgtaggg tgaagaagag agtggagcgg 540

ctgtcggaag attgtagaat ggtgattact acttacgaag gtcgtcacag ccacattccc 600

tctgatgaat ccacttctcc tgaccatgat tctctctctt ccttt 645

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 油菜

<400> 2

Met Glu Gly Gly Gly Arg Arg Val Val Val Asn Asn Tyr Asp Leu Gln

1 5 10 15

Gln Val Thr Ile Gln Glu Asn Met Asn Phe Leu Ile Pro Phe Glu Glu

20 25 30

Thr Asn Val Leu Thr Phe Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Pro Ser Phe Pro Ile His Asn Ser Ser Ser Thr Thr Asn Thr Thr

50 55 60

His Ala Pro Leu Gly Phe Pro Asn Asn Leu Gln Gly Gly Gly Pro Leu

65 70 75 80

Gly Ser Lys Val Leu Asn Asp Asp Gln Asp Asn Phe Arg Gly Gly Ile

85 90 95

Asn Asn Asp Ala His Ser Ser Ser Trp Trp Arg Ser Ser Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Glu Ser Lys Asn Lys Val Lys Ile Arg Arg Lys Leu Arg Glu Pro

115 120 125

Arg Phe Cys Phe Gln Thr Lys Ser Asp Val Asp Val Leu Asp Asp Gly

130 135 140

Tyr Lys Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Val Lys Asn Ser Leu His

145 150 155 160

Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr His Asn Asn Cys Arg Val Lys Lys

165 170 175

Arg Val Glu Arg Leu Ser Glu Asp Cys Arg Met Val Ile Thr Thr Tyr

180 185 190

Glu Gly Arg His Ser His Ile Pro Ser Asp Glu Ser Thr Ser Pro Asp

195 200 205

His Asp Ser Leu Ser Ser Phe

210 215

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggaaggag gaggaagaag a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttaaaaggaa gagagagaat c 21

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggaaggagg aggaagaaga g 51

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc aaaggaagag agagaatcat gg 52

Claims

1.一种油菜转录因子BnWRKY184，其特征在于，所述油菜转录因子BnWRKY184的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的油菜转录因子BnWRKY184的克隆方法，其特征在于，提取油菜总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板、根据扩增引物BnWRKY184-F和BnWRKY184-R进行PCR扩增；BnWRKY184-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，为5’-ATGGAAGGAGGAGGAAGAAGA-3’，BnWRKY184-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，5’-TTAAAAGGAAGAGAGAGAATC-3’。

3.权利要求1所述的油菜转录因子BnWRKY184在调控植物木质素合成、纤维素合成及细胞壁发育中的应用。

4.一种含有权利要求1所述的油菜转录因子BnWRKY184的过表达载体。

5.根据权利要求4所述的油菜转录因子BnWRKY184的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体为pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184，该过表达载体采用pDONR207-BnWRKY184质粒和pEarleyGate103-RFP质粒进行gateway反应构建得到；构建表达载体时，所用引物序列如下：SEQ ID NO.5所示的BnWRKY184-F2，SEQ ID NO.6所示的BnWRKY184-R2。

6.一种含有权利要求5所述的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnWRKY184的宿主细胞。

7.一种含有权利要求1所述的油菜转录因子BnWRKY184的宿主细胞。

8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为农杆菌GV3101。