CN109369789B - ZmDRR206蛋白质及其编码基因在调控植物抗病性与生长发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ZmDRR206蛋白及其编码基因在调控植物抗病性及生长发育中的应用。本发明通过转基因实验证明ZmDRR206可提高玉米对禾谷镰刀菌引起的茎腐病的抗性并降低叶片失水速率而增强幼苗的抗旱性。在玉米幼苗和籽粒生长发育过程中，ZmDRR206通过增加次生代谢产物合成并同时降低一些初生代谢产物合成而延缓生长发育和增强玉米抗病性。ZmDRR206还与玉米的百粒重性状显著相关，其表达量的增加可延缓玉米籽粒发育并显著影响玉米籽粒中各种营养成分的代谢。以上结果说明ZmDRR206及其编码基因可以调控植物抗病性和抗逆性以及生长发育，对培育抗病抗逆植物新品种具有重要的理论和现实意义。

Description

ZmDRR206蛋白质及其编码基因在调控植物抗病性与生长发育 中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及玉米抗病应答蛋白206的编码基因ZmDRR206的克隆及其功能分析，尤其涉及ZmDRR206在玉米苗期和籽粒生长发育以及应对生物和非生物逆境过程中的生物学作用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是粮饲兼用的重要粮食作物，也是重要的工业原料。玉米是世界第一大作物，我国玉米2007年种植面积超过水稻，2010年总产超过水稻，也成为我国名副其实的第一大粮食作物，在我国粮食安全保障体系中占有举足轻重的地位。由于植物不能移动，在多变的环境条件下经常接触潜在病原体，为了避免、阻止或阻滞病原物入侵与扩展，减轻发病和损失程度，维管植物进化出了复杂的防御机制来辨认外源侵染物的威胁以保护自身。植物的抗病性是指植物避免、阻止或阻滞病原物入侵与扩展，减轻发病和损失程度的可遗传的性状。这是植物与病原物长期斗争和共同进化中逐步发展并保存下来的为保持物种生存和繁衍所必须的特性。它们自身能够产生一系列防御反应来帮助抵抗或限制入侵病原物对其生长发育的不利影响。在这些防卫反应中，维管植物有一种免疫反应机制称为基础防御反应(非寄主抗病性或非小种特异性抗病性)最为常见，能保护植物抵抗病原物侵染，其中包含那些能被病原物诱导表达的多种病原相关蛋白编码基因(PR)，如一些编码植物抗毒素的抗病基因(Hadwiger，2008)。基础防御反应与其它PR基因，如编码苯丙氨酸裂解酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、DRR49、DRR276、几丁质酶、β-葡聚糖酶和防御素基因的转录激活有关，同时伴随植物抗毒素如豌豆素的积累(Hadwiger，2008)。

发明内容

本发明的一个目的是提供ZmDRR206蛋白质的新用途。

所述ZmDRR206蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有70％、具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上下表所示的标签的编码序列得到。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明提供了ZmDRR206蛋白质在如下a1)-a4)中任一种中的应用：

a1)调控植物的抗病性；

a2)调控植物的抗逆性；

a3)调控植物的生长发育；

a4)植物育种。

本发明还提供了与ZmDRR206蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与ZmDRR206蛋白质相关的生物材料在如下a1)-a4)中任一种中的应用：

a1)调控植物的抗病性；

a2)调控植物的抗逆性；

a3)调控植物的生长发育；

a4)植物育种；

所述与ZmDRR206蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码ZmDRR206蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码ZmDRR206蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmDRR206蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmDRR206的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码ZmDRR206的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmDRR206且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述应用中，所述重组载体是将上述ZmDRR206蛋白质的编码基因插入表达载体中，得到表达ZmDRR206蛋白质的重组载体。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种植物表达载体，例如Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)。构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明ZmDRR206的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是双子叶植物，如油菜、大豆、苜蓿、向日葵、拟南芥或棉花等，也可以是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控植物抗病性为提高植物抗病性，所述抗病性为对禾谷镰刀菌引起的茎腐病的抗性；具体体现在降低植物的病情指数。

所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性；所述抗逆性具体为抗旱性；提高植物抗旱性具体体现为提高植物中与抗逆有关的小分子的含量和/或提高植物在干旱处理后的存活率和/或降低植物离体叶片的失水速率。所述与抗逆有关的小分子可为胆碱(choline)和/或尿囊素(allantoin)和/或黑色素(MELANIN)。

所述调控植物生长发育具体体现在如下B1)-B7)中任一种：

B1)调控植物根长；

B2)调控植物株高；

B3)调控植物初级代谢产物的合成；

B4)调控植物次级代谢产物的合成；

B5)调控植物微量元素的吸收和代谢；

B6)调控植物果实中的营养物质成分含量；

B7)调控植物果实性状。

进一步的，所述初级代谢产物包括有机酸、氨基酸和糖；

所述次级代谢产物包括纤维素、半纤维素和木质素；

所述微量元素包括铁元素、锌元素、镁元素、钾元素、磷元素、铝元素和钠元素；

所述营养物质成分包括淀粉、蛋白质和脂肪；

所述果实性状包括籽粒的百粒重、籽粒的长度和籽粒的宽度。

更进一步的，所述调控植物根长体现在降低植物幼苗的主根长；

所述调控植物株高体现在降低植物幼苗的株高；

所述调控植物初级代谢产物的合成体现在降低植物幼苗中有机酸、氨基酸和糖的含量；

所述调控植物次级代谢产物的合成体现在提高植物幼苗中纤维素、半纤维素和木质素的含量；

所述调控植物微量元素的吸收和代谢体现在提高植物幼苗中Mg、Na、K和P的含量和/或降低植物幼苗中Al和Fe的含量和/或提高植物籽粒中Fe、Zn、Mg、K和P的含量和/或降低植物籽粒中Na的含量；

所述调控植物果实中的营养物质成分含量体现在降低植物果实(籽粒)中淀粉含量和/或提高植物果实(籽粒)中蛋白质含量和/或提高植物果实(籽粒)中脂肪含量。

所述调控植物果实性状体现在降低植物籽粒的百粒重和/或降低植物的籽粒宽度和/或降低植物的籽粒长度。

本发明还有一个目的是提供一种培育抗病性提高和/或抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗病性提高和/或抗逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmDRR206蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗病性和/或抗逆性高于所述受体植物。

本发明最后一个目的是提供一种培育生长发育延缓的转基因植物的方法。

本发明提供的培育生长发育延缓的转基因植物的方法包括提高受体植物中ZmDRR206蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的生长发育速率慢于所述受体植物。

上述方法中，所述抗病性为对禾谷镰刀菌引起的茎腐病的抗性；

所述抗逆性为抗旱性；

所述转基因植物的生长发育速率慢于所述受体植物体现在如下C1)-C7)中任一种：

C1)转基因植物苗期的主根长小于受体植物；

C2)转基因植物苗期的株高小于受体植物；

C3)转基因植物苗期的初级代谢产物含量小于受体植物；

C4)转基因植物苗期的次级代谢产物含量大于受体植物；

C5)转基因植物籽粒的百粒重小于受体植物；

C6)转基因植物的籽粒长度小于受体植物；

C7)转基因植物的籽粒宽度小于受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中ZmDRR206蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达ZmDRR206蛋白质；

所述过表达的方法为将所述ZmDRR206蛋白质的编码基因导入受体植物；在本发明的具体实施例中，所述ZmDRR206蛋白质的编码基因是通过重组载体pUbiquitin：ZmDRR206导入受体植物。所述重组载体pUbiquitin：ZmDRR206为将序列1所示的ZmDRR206插入pBXCUN载体后得到的载体。该载体含有依次由用于启动ZmDRR206表达的pUbiquitin启动子、ZmDRR206和用于终止ZmDRR206表达的Nos终止子组成的ZmDRR206表达盒。

所述ZmDRR206蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述应用或方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可以是油菜、大豆、苜蓿、向日葵、拟南芥或棉花等；所述单子叶植物可以是水稻、小麦、玉米等。在本发明的具体实施例中，所述单子叶植物具体为玉米；所述玉米的品种具体为玉米自交系B73-329。

本发明从玉米中克隆了玉米抗病应答蛋白206的编码基因ZmDRR206，并通过转基因实验证明了其在玉米生长发育、抗病性及抗逆性中所发挥的作用：1)ZmDRR206可提高玉米幼苗和田间成熟植株对禾谷镰刀菌引起的茎腐病的抗性并降低叶片失水速率而增强幼苗的抗旱性。同时，ZmDRR206表达量增加延缓玉米幼苗生长发育，幼苗中一些初级代谢产物如有机酸、氨基酸和糖的含量显著小于对照；并增加幼苗中次生代谢产物的合成如纤维素半纤维素和木质素等含量，与抗逆有关的小分子如胆碱(choline)、尿囊素(allantoin)和黑色素(MELANIN)的含量也均显著高于对照幼苗；同时幼苗中一些元素如Mg、Na、K和P的含量都显著高于对照，而Al和Fe的含量都显著低于对照；2)ZmDRR206与玉米的百粒重性状显著相关，ZmDRR206表达量增加延缓玉米籽粒发育并显著影响玉米籽粒中各种营养成分的代谢，成熟的玉米籽粒表现为籽粒变小、皱瘪并颜色暗沉，并且玉米籽粒中的粗淀粉含量显著降低，而粗蛋白质和粗脂肪含量则显著增加；3)在玉米幼苗和籽粒生长发育过程中，ZmDRR206通过增加次生代谢产物合成并同时降低一些初生代谢产物合成而延缓生长发育和增强玉米抗病性。

附图说明

图1为ZmDRR206在玉米生长发育中的时空表达情况。a为ZmDRR206在接种后的抗病材料中表达量快速显著上调。R为抗病近等基因系，S为感病近等基因系，CK为未接种，6、18和48为接种后6小时、18小时和48小时。b为ZmDRR206在玉米籽粒发育过程中，仅仅在胚周部位(ESR)、基部传递组织(BETL)和糊粉细胞(AL)表达量较高。c为转录组数据表明ZmDRR206在玉米授粉后10天(10DAP)籽粒的胚乳中表达量开始明显上升，在20DAP的籽粒胚乳中表达量达到最大。d为ZmDRR206在不同玉米组织中的表达分析。

图2为重组载体和ZmDRR206表达盒的结构示意图。

图3为转ZmDRR206玉米植株的基因型鉴定。左侧第一个为DNA分子大小标记，其余能扩增出明显条带的为转ZmDRR206玉米阳性植株，没有扩增条带的为阴性植株。

图4为不同的转ZmDRR206玉米事件子代中ZmDRR206的表达量分析。B73为转基因玉米受体，此处用作对照。DRR-1，-4和-6分别为来自不同转基因事件的不同转基因玉米株系。

图5为ZmDRR206过表达延缓玉米苗期生长发育但不影响成熟植株的生长。a为发芽后7天转ZmDRR206玉米的主根长显著小于对照(p<0.05)。b为播种后12天转ZmDRR206玉米幼苗的株高显著小于对照，字母a和b显示组间差异显著(p<0.05)。c为10叶期的转ZmDRR206玉米苗期植株的株高小于对照植株。d为转ZmDRR206玉米成熟植株(授粉结束后)株高与对照植株的株高无显著差异。

图6为ZmDRR206表达量增加减少幼苗中初级代谢产物合成但增加幼苗中次生代谢产物的合成。a为ZmDRR206过表达减少玉米幼苗中一些初级代谢产物如有机酸、氨基酸和糖的含量，但增加了一些抗逆有关的小分子如胆碱(choline)、尿囊素(allantoin)和黑色素(MELANIN)的合成。B为ZmDRR206过表达影响玉米幼苗中金属元素的吸收与代谢，一些元素如Mg、Na、K和P的含量都显著高于对照，而Al和Fe的含量都显著低于对照；c为ZmDRR206过表达增加玉米幼苗中次生代谢产物的合成，纤维素、半纤维素和木质素等含量均比对照显著增加。

图7为ZmDRR206是正调控禾谷镰刀菌茎腐病抗性的功能基因。a为对照B73-329玉米幼苗在接种禾谷镰刀菌病原孢子后6h和18h的主根中，ZmDRR206基因的表达量都是显著上调(大于未接种对照2倍以上)。b和c为苗期接种禾谷镰刀菌48h后转ZmDRR206玉米苗生长状况比对照幼苗良好，表现为转ZmDRR206玉米苗(右边)的主根长和株高显著大于对照(左边)。d为苗期接种禾谷镰刀菌48h后转ZmDRR206玉米苗的病情指数显著低于对照幼苗的病情指数。

图8为ZmDRR206的表达量增加能增强玉米田间禾谷镰刀菌引起的茎腐病的抗病性。

图9为ZmDRR206正调控玉米苗期抗旱性。a和b为ZmDRR206表达量增加能增强玉米苗期抗旱性。c为玉米幼苗全展叶片失水速率测定分析。

图10为ZmDRR206在玉米籽粒发芽中的作用。a和b为转ZmDRR206玉米与B73杂交后F2果穗上面不同籽粒的分离与表型。1为发育正常籽粒，与对照籽粒颜色一样没有皱缩但比对照正常生长的果穗上的籽粒小；2为比1小一些，颜色变浅发白略有皱缩的籽粒；3为严重皱缩颜色变暗淡并显著小的籽粒。c和d为不同表型的分离籽粒的发芽率与幼苗株高。

图11为ZmDRR206在玉米籽粒生长发育中的作用。a为成熟的转ZmDRR206玉米籽粒变小并严重皱缩。示胚的正反面都皱缩。b为籽粒横切(上图)显示硬质成分减少，籽粒沿胚中间纵切显示胚周各个部位出现的空腔。c为白光灯箱拍照显示转ZmDRR206玉米籽粒的透光度比对照小。d-f为转ZmDRR206玉米籽粒的长度、宽度和百粒重都显著小于对照籽粒。g-k为转ZmDRR206玉米籽粒的营养成分分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的玉米自交系B73-329记载于文献“刘治先等。美国玉米自交系的种质基础分析。山东农业科学，2003年第5期；曹广才、徐雨昌主编《实用玉米自交系》”中，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、玉米ZmDRR206基因的克隆及时空表达特征分析

一、玉米ZmDRR206基因的克隆

1、cDNA的获得

以玉米自交系B73-329(Reid yellow dent)幼苗为材料，使用Invitrogen公司提供的TriZol试剂提取总RNA。使用全式金公司提供的第一链cDNA的合成试剂盒并利用试剂盒中提供的通用引物来反转录得到cDNA。

2、玉米ZmDRR206基因的扩增

以步骤1获得的cDNA为模板，采用DRR-R和DRR-L引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

DRR-R：CATCCTCCCTCCTCTTTGT；

DRR-L：GTAAACCAACACTACATCCACC。

3、测序

将步骤2获得的PCR产物克隆到pEASY-T1载体(购买自北京全式金生物技术有限公司)上，选择阳性克隆测序，得到ZmDRR206基因全长cDNA的序列。

测序结果表明：ZmDRR206基因全长cDNA的序列如序列表中序列1所示，编码的ZmDRR206蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

二、ZmDRR206在玉米生长发育中的时空表达特征分析

1、ZmDRR206在抗病和感病材料中的表达分析

分别以抗病近等基因系(Resistant NIL，RCK)和感病近等基因系(SusceptibleNIL，SCK)为材料，苗期接种禾谷镰刀菌，提取接种后培养不同时间抗、感材料根的总RNA并进行转录组测序。数据分析表明：ZmDRR206基因在未接种的抗病近等基因系RCK(R)中表达量比较低，仅仅为未接种的感病近等基因系SCK(S)中的0.53倍，但在接种后表达量快速上调；在抗病近等基因系接种6h后的表达量上调3.63倍，是感病近等基因系接种6h后的表达量的2倍以上。

2、ZmDRR206在籽粒发育中的表达分析

转录组数据表明ZmDRR206在玉米授粉后10天(10DAP)籽粒的胚乳中表达量开始明显上升，在20DAP的籽粒胚乳中表达量达到最大。ZmDRR206在玉米籽粒发育过程中，仅仅在胚周部位(ESR)、基部传递组织(BETL)和糊粉细胞(AL)表达量较高(图1)。

3、ZmDRR206在不同玉米组织中的表达分析

ZmDRR206仅仅在玉米苗期的根茎叶中表达量较高，而在其它组织中的表达量很低或者不表达。由此推测该基因在玉米苗期正常生长发育中起负调控作用，而在苗期抗病反应中表达显著上调而正调控抗病反应。

上述结果表明：ZmDRR206可能与籽粒发育过程中营养物质的传递和运输有关。

实施例2、转ZmDRR206玉米的获得及其功能分析

本实施例利用ZmDRR206基因来构建过表达载体，并转化受体自交系B73-329，通过分析所获得的转基因植株的生长发育和抗性等的改变来鉴定ZmDRR206基因的功能。

一、转ZmDRR206玉米的获得

1、重组载体pUbiquitin：ZmDRR206的构建

(1)以实施例1步骤一中的1获得的cDNA为模板，采用引物ox-DRR-F和ox-DRR-R以高保真Taq酶进行PCR扩增，得到带有TA末端的ZmDRR206全长cDNA片段。引物序列如下：

ox-DRR-F：ATGGCATCCTCCCTCCTCTTTG；

ox-DRR-R：TCACCACCAGACGCCGGATC。

(2)将pCXUN-Myc载体(武汉淼灵生物科技有限公司，产品目录号为P1621)用XcmI进行酶切，酶切后产生TA末端，得到带有TA末端的线性化载体。

(3)连接步骤(1)获得的带有TA末端的ZmDRR206全长cDNA片段和步骤(2)获得的带有TA末端的线性化载体，得到重组载体pUbiquitin：ZmDRR206，并对其进行测序验证。

结果表明：重组载体pUbiquitin：ZmDRR206为将序列1所示的ZmDRR206插入pBXCUN载体后得到的载体。该载体含有依次由用于启动ZmDRR206表达的pUbiquitin启动子、ZmDRR206全长cDNA片段和用于终止ZmDRR206表达的Nos终止子组成的ZmDRR206表达盒。重组载体pUbiquitin：ZmDRR206和ZmDRR206表达盒的结构示意图如图2所示。

2、重组菌的获得

将步骤1获得的重组载体pUbiquitin：ZmDRR206导入农杆菌EHA105(北京华越洋生物有限公司，产品编号为GX0133-100s)中，得到含有重组载体pUbiquitin：ZmDRR206的农杆菌菌株。

3、转基因植物的获得

用步骤2获得的含有重组载体pUbiquitin：ZmDRR206的农杆菌菌株侵染玉米受体材料B73-329的幼胚，并将农杆菌侵染后的玉米幼胚转移到共培养培养基，用封口膜封住培养皿，在20℃条件下暗培养3天，再把幼胚转移到恢复培养基上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天，之后把所有的幼胚转移到选择培养基上面，培养两周，选择培养基含有潮霉素20mg/L，两周后再进行亚培养，潮霉素的浓度为20mg/L，浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的Ⅱ型愈伤，即获得抗性愈伤。将抗性愈伤再生成苗，将其在再生培养基I上面培养3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)。待再生成功后，转移至温室中，获得T₀代转基因植株。将T₀代转基因植株进行自交获得T₁代转基因子代，T₁代转基因子代再进行自交，得到T₂代转基因子代，T₂代转基因子代再进行自交，得到T₃代转基因子代。

4、PCR鉴定转基因玉米基因型

分别提取T₁代转基因玉米的单株叶片的基因组DNA，采用引物bar-R：GGTGGACGGCGAGGTCGCCG和bar-L：TCGGTGACGGGCAGGACCGG进行PCR鉴定。PCR扩增得到大小为357bp片段为阳性转ZmDRR206玉米(图3)。之后重复该实验继续对T₂和T₃代转基因玉米子代群体进行基因型鉴定。选择T₃代中不分离的子代用于下一步实验分析。

5、Realtime-PCR对转基因玉米幼苗中ZmDRR206表达量进行分析

利用天根的植物总RNA提取试剂盒提取步骤4中获得的T₃代转ZmDRR206玉米发芽后7天幼苗的总RNA，利用Invitrogen公司的M-MLV第一链合成系统对得到的总RNA进行反转录，得到cDNA。以cDNA作为模板，使用SYBR Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)(TAKARABIO INC.)进行RT-PCR扩增。同时以受体材料B73-329玉米为对照。选择玉米GAPDH2基因作为内参。每个样品做3个生物学重复。ZmDRR206基因特异引物和内参基因的引物如下：

RT-LP：CCTCCCTCCTCTTTGTTGTCG；

RT-RP：TCGTGCATGAAGAAGTGCAG；

GAPDH2-LP：ATCAACGGCTTCGGAAGGAT；

GAPDH2-RP：CCGTGGACGGTGTCGTACTT。

结果如图4所示：与对照B73-329玉米相比，在阳性T₃代转ZmDRR206玉米中ZmDRR206的表达量提高了三十倍以上。其中，四个转化事件的T₃代转ZmDRR206玉米幼苗中ZmDRR206表达量比对照B73-329的幼苗中增加了60倍以上(有两个事件表达量比对照增加了156和289倍)，有两个事件的T₃代转ZmDRR206玉米幼苗中ZmDRR206表达量比对照B73-329的幼苗中增加了大约30倍以上。将上述6个阳性转ZmDRR206玉米事件分别命名为DRR206-1(DRR-1)，DRR206-2(DRR-2)，DRR206-3(DRR-3)，DRR206-4(DRR-4)，DRR206-5(DRR-5)，DRR206-6(DRR-6)，然后将6个阳性转ZmDRR206玉米事件的T₀代转基因植株的种子全部种在海南三亚种植基地，再连续四代自交获得纯合的T₄代阳性转ZmDRR206玉米，并以T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系作为后续功能分析实验的材料。

二、转ZmDRR206玉米的功能分析

1、转ZmDRR206玉米在苗期和成熟期的生长发育性状分析

取T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系和对照B73-329自交系籽粒，泡水12小时后，用发芽纸卷起来垂直放入水中，水的量到达卷纸高度的一半。以此进行卷纸培养，7天后测定主根长以及拍照分析转基因苗和对照苗的主根长。同时，营养土和蛭石混合均匀，装入小盆中，播入种子后正常浇水与光照条件下培养，10天后测定苗期株高。以上实验重复3次。同时观察地里种植的转基因植株和对照植株的生长发育情况，授粉结束后测定成熟植株的株高，以测定3个小区，每个小区最少50株，分析株高变化。利用微波消解—iCAP测定发芽后10天幼苗中钠(Na)、钾(K)、镁(Mg)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)、磷(P)等元素的含量。参照“Sluiter A,Hames B,Ruiz R,Scarlata C,Sluiter J,Templeton D,and Crocker D(2012)Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass：Laboratory Analytical Procedure(LAP).Version08-03-2012)”中的方法测定发芽后10天玉米幼苗中木质素、有机酸、氨基酸和糖等代谢产物的含量。

株高和主根长的检测结果表明：转ZmDRR206玉米的幼苗株高和主根长都显著小于对照幼苗。田间种植植株生长观察结果表明：在10叶期之前，转ZmDRR206玉米的株高都显著小于对照，但成熟植株的株高与对照植株的株高之间则没有显著差异(图5)。表明ZmDRR206过表达显著延缓转基因玉米苗期根茎的生长速度，而对成熟植株的生长影响就变小。

代谢谱测定分析结果表明：ZmDRR206表达量增加延缓了玉米幼苗生长发育，转ZmDRR206幼苗中的一些初级代谢产物如有机酸、氨基酸和糖的含量显著小于对照，但一些与抗逆有关的小分子如胆碱(choline)、尿囊素(allantoin)和黑色素(MELANIN)的含量则显著高于对照苗；同时，ZmDRR206过表达增加幼苗中次生代谢产物的合成，幼苗中纤维素、半纤维素和木质素等含量均比对照显著增加。而且，ZmDRR206表达量增加对幼苗中金属元素吸收和代谢也有显著影响，转ZmDRR206幼苗中一些元素如Mg、Na、K和P等的含量都显著高于对照，而Al和Fe的含量都显著低于对照(图6)。

2、转ZmDRR206玉米苗期和成熟期的抗病性分析

(1)对照材料B73-329幼苗接种禾谷镰刀菌后ZmDRR206表达量测定

利用实时定量PCR的方法检测ZmDRR206基因在B73-329玉米幼苗的根接种禾谷镰刀菌病原孢子后的表达情况。具体步骤如下：选取对照材料B73-329玉米幼苗在接种禾谷镰刀菌病原孢子后0h、6h和18h的主根，用于提取总RNA。利用Invitrogen公司的M-MLV第一链合成系统进行反转录，得到cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)(TAKARABIO INC.)进行RT-PCR扩增对ZmDRR206表达量进行分析。

结果表明：接种禾谷镰刀菌6h到18h后，ZmDRR206基因的表达量都是显著上调(大于未接种对照2倍)(图7a)。说明在转录水平上ZmDRR206是正向调控抗病反应的，在抗禾谷镰刀菌茎腐病中是起基础防御作用的功能基因。

(2)转ZmDRR206玉米苗期和成熟期抗病性分析

A)苗期抗病率鉴定

T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系的种子发芽后5天主根长度大约为6-8cm，接种禾谷镰刀菌孢子液，与孢子液共培养1h后，取出于湿纸巾上培养。接种48小时后测定接种后幼苗主根长，对主根发病症状进行分级鉴定。玉米幼苗培养、禾谷镰刀菌孢子液制备、禾谷镰刀菌苗期接种以及接种后病症和病情指数统计分析参照文献“Jianrong Ye,YanlingGuo,Dongfeng Zhang,Nan Zhang,Chao Wang，Mingliang Xu*.2013.Cytological andMolecular Characterization of QTL-qRfg1Which Confers Resistance to GibberellaStalk-Rot Disease in Maize.Mol.Plant-Microbe Interact.December,Volume26,Number 12：1417-1428”中的方法。同时以B73-329玉米作为对照。

结果表明：转ZmDRR206玉米的主根长显著高于对照苗，病情指数显著小于对照苗，并且抗性差异都达到了极显著水平(p<0.01)(图7b-d)。说明转ZmDRR206玉米在苗期的抗病性高于对照B73-329玉米。

B)田间接种成熟植株抗病性鉴定

为了进一步确认ZmDRR206在玉米抗茎腐病中的作用，将T₃代和T₄代阳性转ZmDRR206玉米子代群体于2017年和2018年分别播种于北京上庄实验站，田间接种禾谷镰刀菌进行成熟植株抗病性检测。抗病性检测所用病原菌为禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)，是中国北方地区的主要病原菌，将禾谷镰刀菌的菌株，接种在PDA培养基上，25℃暗培养一周直至菌丝铺满整个培养基。然后将经过初扩繁的病原菌连同其培养基一起接种到已灭菌的玉米籽粒培养基上，恒温(26-28℃)暗培养15-20天获得大量禾谷镰刀菌。采用伤根土埋法人工接种禾谷镰刀菌。在玉米抽雄散粉前后进行人工接菌。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearumSchw.)、禾谷镰刀菌培养及人工接菌方法具体可参照文献“YangQ,Yin G,Guo Y,Zhang D,Chen S,Xu M:A major QTL for resistance to Gibberellastalk rot in maize.Theoretical and applied genetics.2010,121(4):673-687”中的方法。在接种后30天左右进行第一次调查，每隔一星期调查一次，共调查3次。典型的茎腐病症状表现如下：茎基部变褐变软，易倒伏，果穗倒挂，叶片青枯或黄枯，导致整个植株早衰或死亡等。最后一次调查采用劈茎法，通过观察根部和茎基部输导组织的生长状态确定抗感，并计算抗病率和病情指数。同时以B73-329玉米植株为对照。转ZmDRR206玉米子代群体和对照B73-329玉米每年各种3-6个重复小区、每个重复小区种植50株以上，结果取各个重复所计算得到的病情指数DSI(％)的平均值并以此计算p-value大小。病情指数(DSI)(％)＝Σ(级别×该级别的植株数量)×100/(6×总的植株数量)(Robertson-Hoyt LA,JinesMP,Balintkurti JP,Kleinschmidt CE,White DG(2006)QTL mapping for fusarium ear rotand fumonisin contamination resistance in two maize populations.Crop Sci 46:1734-1743.)。

2017年种植的成熟期T₃代转ZmDRR206玉米子代群体田间接种检测结果表明：T₃代转ZmDRR206玉米的抗病性均高于对照B73-329玉米植株，其病情指数显著小于对照B73-329玉米植株。2018年种植的成熟期T₄代转ZmDRR206玉米子代群体检测结果表明：与T₃代结果一样，转ZmDRR206玉米的抗病性均显著高于对照B73-329玉米植株，其病情指数显著小于对照B73-329玉米植株。并且各个转基因事件的抗性与对照之间的差异都达到了极显著水平(p<0.01)(图8)。这进一步证明ZmDRR206基因可提高玉米对茎腐病的抗病性，该基因正调控玉米抗病性。

3、转基因玉米苗期抗旱性分析

(1)抗旱性分析

因为植株大小会由于蒸腾叶面积不一样，而影响失水速率，进而影响抗旱性，为了分析ZmDRR206在玉米苗期抗旱性中的作用，选择表达水平增加倍数最小的两个事件的T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系(T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系DDR-5和DDR-6)的转基因玉米子代(两个事件的玉米幼苗株高大小等性状与对照苗没有显著差异)作为实验材料用于抗旱性分析。具体步骤如下：将转ZmDRR206玉米籽粒和对照B73-329玉米籽粒同时播种于同样土壤以及同样环境条件下。播种一周后停止浇水，播种三周后对照苗全部出现严重萎蔫，在清晨叶片都是萎蔫的时候浇水复水。复水后一周统计苗的存活率。实验重复3次以上，每次实验组和对照组都播种50株统计。

结果表明：对照苗全部萎蔫，而转ZmDRR206玉米苗则生长状况仍然良好，叶片仅仅表现出轻度失水状态，复水后对照苗的存活率不足40％，而转ZmDRR206玉米苗的存活率均在95％以上(图9a和图9b)。

(2)离体叶片失水速率分析

取生长状态良好的播种后约15-20天的转ZmDRR206玉米苗全展叶(第三、四叶)剪下，展开并排放置，3-5片为一组，离体放置在同一大托盘里，室温下，每隔2h测定一次叶片重量，测定相同时间内的失水率(水分丢失速率)。每次实验至少做3个重复。以此作为ZmDRR206表达量增加对玉米苗期抗旱性作用的另一个依据。

结果表明：转ZmDRR206玉米叶片在相同条件下在每一个时间点上都比同期的对照叶片失水速率小(图9c)。说明ZmDRR206在玉米苗期抗旱性中确实起着正调控作用，ZmDRR206表达量增加会增强玉米苗期抗旱性。

4、玉米籽粒各营养性状以及各种元素含量的测定

(1)ZmDRR206在玉米籽粒发芽中的作用

利用转ZmDRR206玉米和对照材料杂交F2果穗分离群体测定ZmDRR206过表达对籽粒发芽率的影响。种子于土中播种7天后统计发芽率，种子发芽率参照国标方法(国家标准GB 4401.1—1996)。

结果表明：ZmDRR206过表达影响籽粒的胚乳发育，但是对胚的发育没有影响，各种分离表型的籽粒的发芽率之间没有显著差异(图10)。

(2)ZmDRR206在玉米籽粒生长发育中的作用

取T₄代阳性转ZmDRR206玉米纯合株系和对照B73-329玉米的成熟干籽粒，拍照其表型特征并测定其长宽大小及其百粒重。种子于土中播种7天后统计发芽率，种子发芽率参照国标方法(国家标准GB 4401.1—1996)。利用微波消解—iCAP测定玉米籽粒中钠(Na)、钾(K)、镁(Mg)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)、磷(P)的含量，具体如下：微波消解法消解植物材料，释放植物中的金属离子，然后用电感耦合双向观测等离子发射光谱仪测定金属元素含量。参照近红外光谱透射技术进行整粒谷物分析，方法如下：搜集300多份玉米品质中主要成分含量变幅较大的自交系材料，包括普通自交系品种、高蛋白品种和高油玉米品种玉米，建立NIRS光谱校正模型，用于测定玉米籽粒中蛋白质、脂肪和淀粉含量测定，具体步骤参照文献“孟兆芳等。近红外光谱法测定玉米品质指标的研究。华北农学报，2008,23(2):147-150.林家永。近红外光谱分析技术在玉米品质分析中的应用。2008，中国粮油学会学术年会”中的方法。同时用化学测定方法进行验证。化学方法测定粗淀粉含量采用国家标准“GB5006-1985谷物籽粒中粗淀粉的测定”，测定粗蛋白含量参照国家标准“GB5511-1985粮食、油料中粗蛋白质的测定”，测定粗脂肪含量采用“GB5512-1985粮食、油料中粗脂肪的测定”。

表型测定结果表明：在六个转ZmDRR206玉米事件中，与金黄色的对照B73-329籽粒相比，有四个转ZmDRR206玉米事件的籽粒都表现出颜色暗淡，皱缩严重，籽粒明显变小，胚尖部位有花青素积累等发育异常特征。籽粒顶部横切，转ZmDRR206玉米籽粒的硬质成分比对照籽粒减少，籽粒更脆易碎。籽粒沿胚部位中间纵切，转ZmDRR206玉米籽粒的胚周，如胚顶尖，胚中间部位以及胚底部等都能出现较大的空腔。灯箱拍照，转ZmDRR206玉米籽粒的透光度比对照籽粒降低。转ZmDRR206玉米籽粒的百粒重、籽粒长度和籽粒宽度等性状都比对照籽粒显著减小。

营养成分测定结果表明：转ZmDRR206玉米籽粒的粗蛋白、粗淀粉和粗脂肪含量变幅分别为8.535-15.15％、62.745-74.04％、2.235-6.38％，转ZmDRR206玉米籽粒的粗淀粉含量极显著低于对照籽粒，而转ZmDRR206玉米籽粒的粗蛋白质含量和粗脂肪含量均都显著高于对照籽粒。转ZmDRR206玉米籽粒中的Fe、Zn、Mg、K和P等含量都显著高于对照籽粒中的含量，只有Na含量低于对照籽粒中的含量。这些结果表明，ZmDRR206在玉米籽粒生长发育中的营养物质积累等过程中起着重要调控作用。

序列表

<110>中国农业大学

<120>ZmDRR206蛋白及其编码基因在调控植物抗病性及生长发育中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>666

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgatggcat cctccctcct ctttgttgtc gtcctcctcg cagcgctgtc atcgccgccg 60

ccgtcagccg tcctggcggc ggacgacgac ggcaccacgc acctgcactt cttcatgcac 120

gacgtggtga ccgggagcaa cccgacggcg gtgcaggtga tcaagggcgc ggggtcgtcg 180

gtcgtcccgg ggctggcgtt cggcgacacc acggtgatcg acgacgcgct gacggagacg 240

tcgtcgccca cgtccgccgc cgtgggccgc gctcagggct tctacatgat gtcgtcgcag 300

tcgggcatcg tgctcatggt gtgcgccaac ctgctgctca ccgcggggga ccacaacggc 360

agcacgctcg cggtggtggg ccgggacgac gtcgcggcgg acgtgcggga gctctccgtc 420

gtcggcggca cgggccggtt caggatggcc accggctacg tgctgtggaa gacgtccagc 480

atgaacgggc ctgacgctac cgtcgagctc gacgtgcacg tgaggacggc cacaaccgcc 540

gccacgggta gcggcaccac tggtgccttc tcgggcgccg ctgccaagcg ggtcggagca 600

gggtgggtca ttgcgtgcgc cgtcgccgtc gttggggcgg tggttggatc cggcgtctgg 660

tggtga 666

<210>2

<211>221

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Met Ala Ser Ser Leu Leu Phe Val Val Val Leu Leu Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Ser Pro Pro Pro Ser Ala Val Leu Ala Ala Asp Asp Asp Gly Thr

20 25 30

Thr His Leu His Phe Phe Met His Asp Val Val Thr Gly Ser Asn Pro

35 40 45

Thr Ala Val Gln Val Ile Lys Gly Ala Gly Ser Ser Val Val Pro Gly

50 55 60

Leu Ala Phe Gly Asp Thr Thr Val Ile Asp Asp Ala Leu Thr Glu Thr

65 70 75 80

Ser Ser Pro Thr Ser Ala Ala Val Gly Arg Ala Gln Gly Phe Tyr Met

85 90 95

Met Ser Ser Gln Ser Gly Ile Val Leu Met Val Cys Ala Asn Leu Leu

100 105 110

Leu Thr Ala Gly Asp His Asn Gly Ser Thr Leu Ala Val Val Gly Arg

115 120 125

Asp Asp Val Ala Ala Asp Val Arg Glu Leu Ser Val Val Gly Gly Thr

130 135 140

Gly Arg Phe Arg Met Ala Thr Gly Tyr Val Leu Trp Lys Thr Ser Ser

145 150 155 160

Met Asn Gly Pro Asp Ala Thr Val Glu Leu Asp Val His Val Arg Thr

165 170 175

Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ser Gly Thr Thr Gly Ala Phe Ser Gly

180 185 190

Ala Ala Ala Lys Arg Val Gly Ala Gly Trp Val Ile Ala Cys Ala Val

195 200 205

Ala Val Val Gly Ala Val Val Gly Ser Gly Val Trp Trp

210 215 220

Claims (3)

1. ZmDRR206蛋白质在如下a1）-a3）中任一种中的应用：

a1）提高植物籽粒中Fe、Zn、Mg、K和P的含量；

a2）降低植物籽粒中Na的含量；

a3）提高植物籽粒中蛋白质含量和/或脂肪含量；

所述ZmDRR206蛋白质是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与ZmDRR206蛋白质相关的生物材料在如下a1）-a3）中任一种中的应用：

a1）提高植物籽粒中Fe、Zn、Mg、K和P的含量；

a2）降低植物籽粒中Na的含量；

a3）提高植物籽粒中蛋白质含量和/或脂肪含量；

所述与ZmDRR206蛋白质相关的生物材料为下述A1）至A12）中的任一种：

A1）编码ZmDRR206蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系；

所述ZmDRR206蛋白质是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为其编码序列是序列1的cDNA分子或DNA分子。

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