CN106191075A

CN106191075A - 一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN106191075A
Application number: CN201610581723.4A
Authority: CN
Inventors: 李少锋; 苏晓华; 张冰玉; 褚延广; 刘学; 孙丽芳; 莫文娟; 边星辰; 高旭
Original assignee: FORESTRY EXPERIMENTAL CENTER CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: FORESTRY EXPERIMENTAL CENTER CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2016-12-07

Abstract

本发明提供了一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用PdEXT基因和植物维管组织特异启动子proNAC068载体构建了融合表达载体，获得了转基因植物。针对其木材品质性状的测试表明，该基因的转入可以有效改良树木的材性。

Description

一种美洲黑杨伸展蛋白基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种来源于速生且木材品质优良的美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)的伸展蛋白基因，命名为PdEXT。本发明还涉及PdEXT基因编码的蛋白，利用PdEXT基因和植物维管组织特异启动子proNAC068载体构建的融合表达载体，以及利用该基因培育优良木材品质的转基因杨树的方法。

背景技术

杨树在我国是一个栽培历史悠久、种类繁多、分布广泛的重要经济树种以及重要的短轮伐期工业用材树种之一，杨树材性的育种一直是林木育种工作的重点。2002年毛果杨基因组测序工作的顺利完成，促进了树木基因分离和应用的研究。一些与木材性状相关基因的陆续被发现、克隆和验证，为从基因水平上改善林木材性提供了基础。

伸展蛋白(Extensin)是第一个被鉴定作为细胞壁的疏松蛋白，参与胞壁多聚糖的伸展作用，具有能在植物体外诱导细胞壁扩展，导致细胞壁松弛、细胞膨大的功能。伸展蛋白或细胞壁松弛蛋白是植物细胞壁的重要的糖蛋白，其羟脯氨酸(Hyp)含量比例高，两者呈正相关关系。根据结构和功能分析，细胞壁松弛蛋白expansin可分为α、β、γ和δ四个亚家族，它们可能来源于共同的祖先。过量表达和反义RNA干涉试验表明，通过内源导入expansin基因与外源施用expansin蛋白导致细胞壁变化和细胞的生长趋势类似。已有研究表明，expansin的表达具有细胞、组织和器官的特异性，expansin在次生木质部有高丰度的表达，expansin基因与营养生长、根系发生、果实成熟、授粉受精等生理活动密切相关，调节植物细胞生长和发育。由上可知，研究伸展蛋白对改善杨树木材性状具有重要的意义。然而，目前对美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)伸展蛋白基因还未见相关的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种具有有效改良树木材性的基因美洲黑杨伸展蛋白基因-PdEXT。通过对该基因的应用，有利于改良木材的品质，提高以该木材为原料生产的产品的质量。

本发明提供了一种美洲黑杨伸展蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种基于上述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明还提供了一种表达载体，包含上述美洲黑杨伸展蛋白基因。

优选地，所述表达载体包含维管组织特异启动子proNAC068。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含上述表达载体的细胞。

优选地，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或农杆菌细胞。

本发明还提供了一种包含上述美洲黑杨伸展蛋白基因的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A、克隆美洲黑杨伸展蛋白基因；

B、将步骤A所述的基因连接到pGEM-T Easy载体中，得到连接产物PGEM-PdEXT；

C、将步骤B所得的连接产物PGEM-PdEXT和维管组织特异启动子proNAC068载体分别进行Xba I和Sac I双酶切后，连接得到一个双元表达载体；

D、将所述双元表达载体转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。

本发明还提供了一种利用美洲黑杨伸展蛋白基因获得转基因山新杨植株的方法，包括以下步骤：

构建包含权利要求1所述基因的表达载体；

用所述构建的表达载体转化山新杨细胞；

将所述转化的山新杨细胞培育成转基因山新杨植株。

本发明还提供了一种基于美洲黑杨伸展蛋白基因转化植物获得转基因植物的应用，其特征在于，当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麦、玉米、牧草；

当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：杨树、拟南芥、烟草、油菜。

综上所述，本发明提供一种具有有效改良树木材性的基因PdEXT。通过对该基因的应用，有利于增强木材的强度，提高以该木材为原料生产的产品的质量。

附图说明

图1.PdEXT植物表达载体pBI121-proNAC068-PdEXT构建图；

图2.农杆菌转染PdEXT的杨树分化出的丛生芽；

图3.转入生根培养基的PdEXT转基因杨树植株；

图4.移栽的PdEXT转基因山新杨植株和对照植株；

图5.PdEXT转基因山新杨植株的PCR检测；

图6.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的PdEXT和木材微纤丝角相关基因的荧光实时定量PCR分析；

图7.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的茎横切面解剖特征和微纤丝角汇总图；

图8.PdEXT转基因山新杨及其对照植株的茎横切面解剖结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例中所用试剂如下：

RQ-Dnase(Promega，美国)、RNase Inhibitor(Promega，美国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、dNTP(天根，中国)、Plant TotalRNA Isolation Kit(Autolabtech，中国)、MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)试剂盒、pGEM-T Easy试剂盒(Promega，美国)、水饱和酚(Autolabtech，中国)、氯仿(北京化工，中国)。

以下，对本文的实施方式进行具体说明。

实施例1、美洲黑杨PdEXT基因的克隆

从中国林科院的美洲黑杨未成熟木质部和木质部组织中提取总RNA。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，上海)处理15分钟，酚/氯仿抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行cDNA的反转录。

选择树干通直、生长旺盛的15年生美洲黑杨成年树木，用钻子、斧头去除胸径处树皮，暴露韧皮部组织，形成层和未成熟木质部等组织，用刮纸刀刮取未成熟木质部和木质部于液氮速冻后，保存于-80℃超低温冰箱。总RNA的提取采用奥莱博生物技术有限公司(Autolabtech，中国)生产的植物总RNA提取试剂盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具体操作过程参照其说明书。总RNA提取后，用RNase-free DNase(Promega，美国)处理15min，氯仿/酚抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。以带Oligo(dT)₁₅的引物，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega，美国)进行反转录获得cDNA。

Oligo(dT)₁₅引物序列如下：

TTTTTTTTTTTTTTT

反转录反应如下

1、RNA样品2～6μl(0.05～1μl)，加入CDS PrimerⅡA Oligo(dT)15-30 2μl，加水补足到总体积10μl，混合并短暂离心。

2、72℃温育2min，立即置于冰上2min，并短暂离心。

用PCR仪72℃温育2.5min。

3、加入下列成份：

4μl 5×First-Strand Buffer；

2μl DTT(20mM)；

2μl dNTP Mix(10mM of each dNTP)；

2μl Reverse Transcriptase。

4、轻轻混匀并短暂离心，42℃温育1.5h。

5、将离心管放于冰上终止反应，－20℃保存。

取适量上述反转录产物以进行PCR扩增分离基因。

正向引物(含Xba I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCCTCTAGAATGGCTCCCAAAAGAACC-3'

反向引物(含Sac I位点，其识别序列以下划线表示)：

5'-GGCGAGCTCTTAAGGACATTGGAAGTCTT-3'

PCR条件

以反转录合成的第1链cDNA为模板，经94℃预变性3分钟后采用94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟的反应条件进行35个循环扩增，并于72℃延伸7分钟后置于4℃冰箱中备用。

PCR产物连接到pGEM-T Easy(Promega，美国)载体上用于测序，并在NCBI数据库中进行BLASTN核酸序列的同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝MegaBlast&PROGRAM＝bla stn&BLAST_PROGR)，确定通过上述PCR反应克隆到的是EXT的同源基因。

该基因含有一个完整的开放阅读框架，全长为423bp，见SEQ ID NO：1，该基因编码的蛋白的氨基酸序列，见SEQ ID NO：2。我们将这个来源于美洲黑杨的EXT的同源基因命名为PdEXT。

实施例2、用于转化的植物表达载体的构建

利用上述的正向引物和反向引物，以克隆在pGEM-T Easy载体上的PGEM-PdEXT质粒为模板，扩增出特异的PCR产物，将PCR产物纯化回收后，与毛白杨(Popuplus tomentosaCarr.)维管组织特异启动子

proNAC068载体分别进行Xba I和Sac I双酶切后，连接得到一个双元表达载体，其图谱如图1所示，经测序鉴定插入片段无误后，转化农杆菌GV3101感受态细胞。PCR筛选阳性克隆，提质粒进行限制性酶切验证后，证明成功转化入农杆菌中，该表达载体可直接用于植物，如杨树、拟南芥、烟草等植物的转化。维管组织特异启动子proNAC068序列为880bp，见SEQ ID NO：3。

其中，本实施例可以使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如Pbin19、pBI121、pBI 221，以及用于单子叶植物微弹轰击的植物表达载体。本实施例的载体也可含有适当的启动子。在实施例中可使用任何一种强启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin和Actin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。可使用的选择性标记包括对抗生素抗性的酶，抗生素包括卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等。同样，可使用产生通过颜色变化(例如GUS)或发光(例如荧光酶或GFP)来识别化合物的酶，或抗化学试剂(例如除萎剂)。另外，也可不用任何筛选标记。

本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接的DNA转化，微注射，基因枪等导入植物细胞。

实施例3、PdEXT基因的杨树遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘转化法对山新杨组培苗进行PdEXT基因的遗传转化，具体操作步骤如下：

(1)在超净台中，从培养瓶中取出健壮生长的山新杨组培苗，用手术刀片沿与主脉垂直每隔5mm左右划刀口，使叶片产生伤口。

(2)将叶片在含目的基因表达载体的农杆菌菌液中浸泡10-15min，立即用无菌灭菌水冲洗一遍；将接菌后的叶片平铺于1/2MS固体培养基表面，室温暗共培养2-4d。

(3)将共培养叶片转移至含头孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS分化培养基中，如图2所示，其中a表示：转基因杨树植株分化培养30天；b表示：转基因杨树植株分化培养45天，将其在光照周期16h/8h，25℃条件下进行选择培养。

(4)继代选择培养：每2-3周后，外植体更换一次选择培养基使其诱导分化。

(5)待不定芽长到1cm以上时，将其切下并插入含头孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的生根培养基上进行生根培养，如图3所示，其中，a表示：转基因杨树植株生根培养20天；b表示：转基因杨树植株生根培养30天，获得转基因植株。

分化培养基组成：

含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.05mg/L，头孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS培养基。

生根培养基组成：

含IBA 0.05mg/L，NAA 0.02mg/L，头孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的1/2MS培养基。

实施例4、PdEXT转基因山新杨植株的PCR检测

如图4所示，为将在生根培养基上正常生长的转基因植株移栽到温室，正常水肥管理，4个月后的培养结果，比例标尺Scale bar为12.42cm。其中a为非转基因杨树对照植株，b为转基因杨树植株。转基因山新杨植株的DNA提取采用CTAB法(王关林和方宏筠，2002)。根据pBI121载体上的NPTII序列设计引物，对遗传转化后的再生植株进行PCR检测。引物序列为:

正向引物：

5'-ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT-3'

反向引物：

5'-GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'

PCR结果如图5所示，可见在所检测的抗卡那霉素的100株山新杨中，14株扩增出约0.7kb的DNA片段，从而可以初步推断这些植株为PdEXT基因的阳性转化植株。M为DL2000Marker；1-14:PdEXT转基因杨树植株；CK-:非转基因杨树植株。

实施例5、PdEXT转基因山新杨及其对照植株的PdEXT和木材微纤丝角相关基因的荧光实时定量PCR分析

转基因山新杨植株的RNA提取按照实施例1描述的方法进行，利用MM-LV反转录试剂盒(Promega,美国)进行cDNA的反转录。利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计荧光实时定量PCR引物，根据PdEXT、PtrFRA1(易脆纤维基因)、PtrTUB7(微管蛋白基因)、PtrSuS1(蔗糖合成酶基因)、PtrC4H1(肉桂酸4-羟基化酶基因)、PtrCAD10(肉桂醇脱氢酶基因)、PtrCCR7(肉桂酰辅酶A还原酶基因)的编码区序列，设计1对能够扩增200bp左右片段的引物，并以微管蛋白基因Tubulin作为内参基因。PdEXT基因、内参基因和微纤丝角相关基因的荧光实时定量PCR引物序列如下：

PdEXT正向引物：

5'-CGAGGCTGCTATTTGTCT-3'

PdEXT反向引物：

5'-TTGGAAGTCTTTGGGAAC-3'

Tubulin正向引物：

5'-CTGCCCGTTGCTCTGATGATTCA-3'

Tubulin反向引物：

5'-CCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3'

PtrFRA1正向引物：

5'-CAGCAGAACTGTTATGATAGC-3'

PtrFRA1反向引物:

5'-TGTTGCGGGCACGATTTG-3'

PtrTUB7正向引物:

5'-TTGAGCCATACAACGCCAC-3'

PtrTUB7反向引物:

5'-CGGAAGCAGATGTCATACAAA-3'

PtrSuS1正向引物:

5'-TTTCCCTCGCCCAACTCTT-3'

PtrSuS1反向引物:

5'-GATGCAGGCTTTCCTTGTCA-3'

PtrC4H1正向引物：

5'-CCCTCTTGGGTTCTTTCGTT-3'

PtrC4H1反向引物:

5'-CAAACACGGGGACAGGTATA-3'

PtrCAD10正向引物:

5'-CAGCACTTTGTACTCCGTATTCC-3'

PtrCAD10反向引物:

5'-TGCTTCCCTGGTTCTGTCATT-3'

PtrCCR7正向引物:

5'-GGCTAAGGAGAAAGGGGTGG-3'

PtrCCR7反向引物:

5'-GCCGGTGAGGTACTTGAGGA-3'

PCR反应按照SYBR Premix Ex Taq^TM(TaKaRa，日本)试剂盒提供的方法进行：在PCR8连管中依次加入10μL SYBR Premix Ex Taq^TM、0.4μL PCR Forward primer、0.4μL PCRReverse primer、0.4μL ROX Reference dye II、2μL cDNA和6.8μL灭菌蒸馏水，终体积为20μL，轻微离心，收集到管底。PCR反应在ABI 7500Real-time PCR仪上按照下列程序进行：95℃10秒；然后95℃5秒，59℃34秒，共40个循环。

PCR结束后，制作熔解曲线检查是否有非特异扩增，然后应用ABI sequencedetection system分析软件分析定量PCR结果。

结果见图6，PdEXT转基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3中木材微纤丝角相关基因如易脆纤维基因PtrFRA1、微管蛋白基因PtrTUB7、蔗糖合成酶基因PtrSuS1、肉桂酸4-羟基化酶基因PtrC4H1、肉桂醇脱氢酶基因PtrCAD10和肉桂酰辅酶A还原酶基因PtrCCR7的表达水平，与对照相比提高了2.22-7.31倍，表明PdEXT调控木材微纤丝角相关基因的表达。图6的对照为非转基因植株；PdEXT1、PdEXT2、PdEXT3分别为转基因杨树的3个植株。

实施例6、PdEXT转基因山新杨植株的解剖结构分析和微纤丝角测定

采用石蜡切片技术进行茎横切面解剖并制作切片，以观察韧皮部、形成层和木质部的细胞层数、数目变化及次生生长情况。微纤丝角的测定采用偏光显微镜方法，将20μm厚的弦切面切片，经脱木素、染色和固定处理，使用偏光显微镜测量2–3个切片，随机测量25根纤维的微纤丝角，取平均值，得出样品的微纤丝角数据，并采用SPSS软件(IBM公司)对测定的解剖特征指标分别进行单因素方差分析(One-Way Anova)。

对茎横切面进行组织切片，解剖特征进行汇总分析。如图7所示，其中的图a-c分别示出了非转基因对照植株、转基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木质部、韧皮部和形成层的宽度和层数。其中，转基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木质部、韧皮部和形成层的宽度相比对照分别提高了36.55％-51.71％、22.81％-29.68％和22.72％-35.16％。单因素方差分析结果表明，转基因植株的木质部、韧皮部和形成层的宽度与对照相比均有显著性差异，具体的，sig值分别为0.003、0.001和0.006，如图7d，示出了转基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其对照的节间均长和木质部宽度/韧皮部宽度比值。其中，转基因植株PdEXT3的木质部宽度/韧皮部宽度比值最高，达到2.11。如图8，示出了转基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其对照植株的茎横切面解剖结构。其中，图a、b分别示出了非转基因对照植株和转基因杨树植株的韧皮部和形成层的解剖结构。其中，X、CZ、P分别指木质部、形成层、韧皮部。图c、d分别示出了非转基因对照植株和转基因杨树植株的木质部和形成层的解剖结构，标尺Scale bar为70μm。

微纤丝角是指木材细胞壁S2层中微纤丝方向与细胞主轴之间的夹角，或者可以理解为细胞壁中纤维素链的螺旋卷锁与纤维轴之间的夹角。如图7e所示，为转基因植株PdEXT1、PdEXT2、PdEXT3及其对照植株的微纤丝角进行测定的结果，发现两者差异明显。与对照株相比，转基因植株的微纤丝角下降了12.48％-15.86％(sig＝0.001)。本发明中转基因植株的微纤丝角相比对照明显下降，表明PdEXT转基因植株的纤维弹性模量和强度增强，木材强度大，纵向收缩小，利用该原料制出理想纸品的潜力较大。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种美洲黑杨伸展蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种基于权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含维管组织特异启动子proNAC068。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞为将宿主细胞转化后的包含权利要求3所述的表达载体的细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括但不限于：大肠杆菌或农杆菌细胞。

7.一种基于权利要求4所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A、制备如权利要求1所述的基因；

D、将所述双元表达载体转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。

8.一种利用权利要求1所述基因的获得转基因山新杨植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建包含权利要求1所述基因的表达载体；

用所述构建的表达载体转化山新杨细胞；

将所述转化的山新杨细胞培育成转基因山新杨植株。

9.一种基于权利要求1所述的基因以转化植物获得转基因植物的应用，其特征在于，当所述植物为单子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麦、玉米及牧草；

当所述植物为双子叶植物时，所述植物至少包括但不限于以下其一：杨树、拟南芥、烟草及油菜。