CN116254290B - PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用 - Google Patents

PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116254290B
CN116254290B CN202210926763.3A CN202210926763A CN116254290B CN 116254290 B CN116254290 B CN 116254290B CN 202210926763 A CN202210926763 A CN 202210926763A CN 116254290 B CN116254290 B CN 116254290B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ptoplt
gene
seq
aspen
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210926763.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116254290A (zh
Inventor
罗克明
许长征
付小康
刘帅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Western Chongqing Science City Germplasm Creation Science Center
Southwest University
Original Assignee
Western Chongqing Science City Germplasm Creation Science Center
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Western Chongqing Science City Germplasm Creation Science Center, Southwest University filed Critical Western Chongqing Science City Germplasm Creation Science Center
Priority to CN202210926763.3A priority Critical patent/CN116254290B/zh
Publication of CN116254290A publication Critical patent/CN116254290A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116254290B publication Critical patent/CN116254290B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用。通过构建自身启动子过表达载体，经根癌农杆菌侵染法转化野生型毛白杨后获得PtoPLT5a过表达转基因植株，经后续阳性鉴定筛选出表达量较高的植株进行表型观察。结果发现，与同时期野生型相比，过表达PtoPLT5a的转基因植株，株高增加，茎杆变粗，地上生物量显著提高。节间长度显著增加，使用Franklin溶液浸泡解离出单条纤维细胞，经染色拍照统计发现，转基因植株纤维细胞长度显著增加。本发明提供的培育技术方法，培育出了高生物量及纤维长度增加的优质杨树品种。

Description

PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及毛白杨PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度中的应用。
背景技术
随着经济日益快速发展，人们的生活水平不断得到改善，对纸种类、质量及数量的需求也越来越多样化。但我国造纸原料(木材)严重短缺，木材供应缺口仍在不断扩大，一些大型公司利用杨树适应性强、繁殖快速、生长周期较短等优势，已经开展并建立了杨树人工林场，来作为企业的纸浆原料提供基地。与此同时人工林已经成为了世界木材加工和利用的主要来源，大力发展人工林是林学未来的发展趋势，也是森林资源结构和木材供应变化的必然结果。提高木材产量、改良木材的材性已经成为当前林木遗传育种的主要目标。
杨树(Populus L.)，是世界上分布最广、生存能力较强的树种之一。随着生命科学的不断进步，利用生物技术手段改良得到的树种越来越多，这也极大地丰富了杨树的优良品种。在倡导绿色和可持续发展的社会背景下，杨树作为我国重要的林木资源，因其重要的生态、经济价值被人们广泛关注。杨树根系十分发达，成熟杨树可达十几米高，其树冠繁茂，能够起到防风固沙，减少水土流失的作用。2015年我国杨树人工林面积已超1亿亩居世界之首，在我国西北常被用作防护林的树种(张津林等，2006)。在人们日常生活中，杨树也具有十分广泛的用途，包括造纸、建筑材料、日用品加工家具、胶合板等(王嘉楠等，2006)。因此进一步创新改良杨树的性状品质，对日常生产生活意义重大，有助于人们更好的利用优势林木资源。
木材纤维细胞的形态大小对木浆造纸的质量十分重要，可以说纸张的质量由木浆的质量决定，而木浆质量的好坏最重要的指标之一就是纤维细胞长度。根据目前研究结果，杨树木质部和韧皮部纤维细胞的纵向生长方式是通过顶端侵入生长伸长，其中纤维的中间部分保持与相邻细胞接触并且不伸长，而它们的尖端形成新的细胞壁材料并侵入相邻细胞之间的空间(Sinnott&Bloch,1939；Esau,1953；Larson,1994；Lev-Yadun,2001，MateuszMajda，2021)。但是目前仅有少量纤维细胞生长作用机制的相关报道。
AIL/PLT属于AP2/EREBP类转录因子家族，这类转录因子在广泛存在于各种植物群体中，包括苔藓，藻类，裸子植物等，参与调控植物体生长发育的各个阶段。AIL/PLT基因具有保守的AP2结合元件且具有DNA结合活性，主要参与维持干细胞生态位、分生组织的稳定以及器官发生等发育过程。根据前期研究发现，杨树中AIL/PLT转录因子对次生维管发育过程中起到了十分关键的调控作用，尤其对纤维次生壁沉积具有抑制作用。目前已知纤维细胞生长与纤维细胞次生壁沉积呈现负相关，因此探究AIL/PLT转录因子、纤维细胞次生壁沉积及纤维细胞伸长三者之间的关系，对解析纤维长度变化机理至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种毛白杨PtoPLT5a基因的新的用途。
本发明的技术方案为：毛白杨PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度中的应用，所述毛白杨PtoPLT5a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述应用为在毛白杨中超表达毛白杨PtoPLT5a基因，从而提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度。
一种表达载体，含有权利SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因。
进一步地，还含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的启动子。
进一步地，该表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
上述所述的表达载体在提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度中的应用。
一种提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度的方法，包括如下步骤：
(1)构建植物表达载体：扩增毛白杨基因PtoPLT5a及上游启动子，将其与载体相连接，然后转化农杆菌；
(2)毛白杨的遗传转化：转化材料为野生型毛白杨叶片，采用农杆菌介导的叶盘法；
(3)转基因植株分子检测：以转基因植株的基因组DNA为模板，通过扩增潮霉素抗性标记基因Hyg进行阳性植株筛选，筛选出高生物量的白杨。
进一步地，所述毛白杨基因PtoPLT5a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，上游启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，扩增毛白杨基因PtoPLT5a的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID No.5。
进一步地，扩增上游启动子proPLT5a的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID No.7。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在毛白杨中超表达PtoPLT5a，不但在转录水平上大幅度提高了生物量，而且其纤维细胞长度显著增加，纤维细胞长度既决定木材的材性，又决定后续木浆造纸的质量，从而培育并获得了优质杨树品种。
附图说明
图1：转基因植株PCR检测(DNA检测)
以野生型株系和转基因株系proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP的DNA为模板，用测序引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR检测；其中M代表Marker DL5000；-为非转基因野生型植株；
图2：转基因植株表达量分析(RNA检测)
WT为野生型毛白杨，proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP-L1、proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP-L2、proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP-L3、proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP-L5分别代表PtoPLT5a转基因植株的不同株系，其中株系L1表达量最高；
图3：过表达转基因植株生物量分析
A是野生型毛白杨和超表达植株地上整体表型；B是野生型植株和超表达植株地上部分干重和鲜重测定；C是野生型毛白杨和超表达植株地下整体表型；D野生型植株和超表达植株地下部分干重和鲜重测定；E是野生型毛白杨和超表达植株株高；F是野生型毛白杨和超表达植株节间数；G是野生型毛白杨和超表达植株茎秆粗细；
图4：过表达转基因植株纤维长度分析
A是野生型毛白杨和超表达植株不同节间长度表型；B是第7节间野生型毛白杨和超表达植株节间长度统计；C是第8节间野生型毛白杨和超表达植株节间长度统计；D是第9节间野生型毛白杨和超表达植株节间长度统计；E是野生型毛白杨和超表达植株茎秆纵切，甲苯胺蓝染色图；
图5：过表达转基因植株解离后纤维长度统计分析
A是野生型毛白杨和超表达植株在不同发育时期单条纤维细胞长度表型；B是野生型毛白杨和超表达植株在不同发育时期每条纤维细胞长度统计图(DF:表示发育中纤维细胞，MF：表示成熟纤维细胞)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1转基因植株DNA提取及PCR分子检测
1、杨树DNA提取
主要采用CTAB法提取杨树基因组DNA，具体实验方法如下所示：
1)提取DNA之前的准备工作，首先准备足量的1.5mL EP管分别加入300μL已经预热的CTAB裂解液(含15μLβ-巯基乙醇)，同时加入2-3颗磁珠(磁珠保证组织充分破碎)；
2)利用组织破碎仪器破碎10min，观察破碎情况后，补加200μL已经预热的CTAB裂解液(含β-巯基乙醇)65℃水浴45min，每隔10min颠倒混匀；
3)水浴结束后，室温条件下，12000rpm，离心10min；
吸取上清液转移至新的1.5mL EP管中，分别加入与CTAB等体积的萃取液(氯仿:异戊醇，24:1，V/V)剧烈震荡后平放乳化10min；
4)室温条件下，12000rpm，离心10min；
5)吸取上清液转移至新的1.5mL EP管中，重复第4步，尽量除去蛋白等杂质；
6)吸取上清液转移至新的1.5mL EP管中，再加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒充分混合，会观察到出现白色絮状沉淀；
7)小心使用移液枪吸出EP管中上清液，再加入1mL 75％的酒精漂洗1次，12000rpm，离心5min后，倒出上清液(注意不要将白色沉淀倒出)；
8)重复第7步；
9)放在37℃烘箱中烘干；
10)待上述白色絮状沉淀变成透明状态时候，加入50μL ddH2O(含有DNase)，于37℃消化处理1h，置于-20℃保存；
11)提取得到DNA利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2、PCR分子检测
模板DNA为转基因杨树基因组DNA，通过扩增潮霉素标记基因Hyg(562bp)进行筛选。设计Hyg基因的特异性引物，序列如下：
Hyg-F：5′-ATCGGACGATTGCGTCGCATC-3′；
Hyg-R：5′-GTGTCACGTTGCAAGACCTG-3′
PCR反应体系同下表，1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
PCR的反应体系如下：
94℃，5min(预变性)；
94℃，30s(变性)；
根据设计引物的退火温度(一般为58℃)，30s；
72℃，延伸时间(根据片段长度确定，约1kb/min)，进行36个循环；
72℃，延伸10min；
扩增得到的PCR产物，取2μL利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
实施例2杨树总RNA提取和反转录合成cDNA
1、杨树总RNA提取
首先进行RNA提取前的准备工作，将药勺、研钵、研钵杵等用灭菌后的DEPC水洗净放于烘箱中烘干备用。隔天取出准备好的研钵等物品，加入适量石英砂，10mL无水乙醇燃烧，待冷却后进行RNA的提取。
实验过程中，所有操作均使用AXYGEN公司提供的无RNase枪头及1.5mL离心管。RNA的提取具体操作步骤参考植物总RNA提取试剂盒的说明书操作：
1)首先将500μL裂解液加入无RNase的1.5mL离心管中，同时加入约15μLβ-巯基乙醇，混合均匀；
2)将提前准备好植物材料约0.5g-2g，在液氮冰冻条件下快速研磨成粉末状后，分装至上述装有裂解液的管子中，剧烈震荡，混合均匀；
3)室温静置5min，后12000rpm离心10min，需要提前预冷离心机至4℃；
4)离心结束后轻拿，吸取大约400μL-500μL上清液(尽量吸取干净)加入到新的1.5mL离心管中，并加入上述1/2体积的无水乙醇，快速颠倒混匀，此时可能会略微看到絮状物；
5)将混匀后的液体转入带有吸附柱中的1.5mL收集管中，4℃，12000rpm离心1min；
6)将收集管中液体倒掉，向吸附柱中加入600μL的PG缓冲液，4℃，12000rpm离心1min；
7)再次将收集管中液体倒掉，同时向吸附柱中加入600μL的Wash Buffer清洗杂质，4℃，12000rpm离心1min；
8)重复步骤7)；
9)进行空离，12000rpm，离心5min，尽量去除Wash Buffer，以免Wash Buffer残留抑制下游反应；
10)将吸附柱转入至新的1.5mL离心管中，向吸附柱膜中央滴加RElution Buffer或者PH>7.0的DEPC水30μL-50μL，室温静置2min后，4℃，12000rpm离心1min；
11)将洗脱液重新吸取回吸附柱中，4℃，12000r/min离心1min，产物即样品总RNA，RNA需及时保存至-80℃冰箱备用。
2、杨树总RNA反转录合成cDNA
使用TakaRa公司的反转录试剂盒，根据其说明书来进行实验操作。该试剂盒主要有以下7种成员组成分别为①gDNAEraser、②5x gDNAEraserBuffer、③PrimeScript RTEnzymeMix I、④5x PrimeScript Buffer 2(for Real Time)、⑤RT Primer Mix、⑥RNaseFree dH2O、⑦EASY Dilution。
将上述提取的总RNA经反转录后最终得到单链的cDNA，反应产物保存在-20℃冰箱备用，具体反应体系如下表所示：
Procedure：
37℃15min；
85℃5s；
储存-20℃；
经反转所获得的单链cDNA用于基因表达荧光定量分析，同时也可以进行转录组测序分析。
实施例3 PCR引物的设计和PCR扩增获得目的片段
1、PCR引物设计
首先登陆PHYTOZOME(http://www.phytozome.com)，查询到杨树PtoPLT5a基因的CDS序列及启动子序列。设计了PtoPLT5a-CDS序列的特异性引物，PtoPLT5a片段的上游引物序列为：5′-CAGCATCAACAACAGATGGATTCTACTTCTCATCA-3′(SEQ ID No.4)，下游引物序列：5′-CTCGCCCTTGCCCATTTCCATTCCAAAAATAGGTG-3′(SEQ ID No.5)(目的片段1629bp)，proPLT5a启动子片段的上游引物序列为：5′-gccagtgccaagcttGCCGTTGTATTTGCTAAAGT-3′(SEQ ID No.6)，下游引物为5′-AGAAGTAGAATCCATCTGTTGTTGATGCTGGTGTA-3′(SEQ IDNo.7)，引物由华大基因(北京)代为合成。PCR所用反应试剂均为TaKaRa公司产品。使用HS高保真酶进行目的片段PCR扩增，扩增体系如下所示：
根据所需产物量的多少可适当扩大反应体系。
反应条件如下：预变性98℃，2min；变性98℃，10s；退火温度58°10s；延伸72℃，20s，进行36个循环；最后72℃延伸10min。根据PCR产物条带的大小选取用1％-2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
电泳检测结束后，观察到目标条带，条带清晰明亮后才可以进行目的片段的胶回收。胶回收选用BioFlux公司的胶回收试剂盒，该试剂盒主要有以下4种成员组成，分别为①Extraction Buffer(黄色PH<＝7.0)、②Wash Buffer、③Elution Buffer、④Spin Columns等。具体步骤如下所示。
1)用干净、锋利的刀片，将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放进1.5或者2.0mL离心管中；(切胶过程中尽量将凝胶去除干净)
2)按照1：3的比例(质量数：体积微升数)加入适量体积①；
3)将上述含有凝胶和①混合物的离心管放入50-60℃水浴锅中，直至凝胶融化(融化过程中，每隔2-3min中混匀一次)；
4)当所回收的目的基因片段小于500bp时，需要按照1:1的比例加入等体积的异丙醇，混合均匀；(片段大小大于500bp并且小于4kb则不需要添加异丙醇。)
5)待琼脂糖凝胶融化后，将混合液体全部转移至④中，12000rpm离心1min，并弃去收集管中废液；
6)接着向④中加入500μL①，12000rpm离心1min，并弃去收集管中废液；
7)向④中加入750μL②，12000rpm离心1min，并弃去收集管中废液；
8)重复步骤(7)；
9)再次进行空离，12000rpm，离心5min，尽量去除②，以免②残留抑制下游反应；
10)向④中加入30μL-50μL③、水或者TE溶液等，室温静置1min；
11)12000rpm离心1min，收集保存离心管内溶液；(重复过一次②)
胶回收完成后，取1μL产物进行电泳检测，观察条带大小及亮度。回收产物置于-20℃保存。
实施例4 proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP载体构建和转化农杆菌GV3101
1、proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP的载体构建
首先以毛白杨cDNA为模板，利用高保真Primstar酶扩增目的基因PtoPLT5a的编码序列(SEQ ID No.1)。以基因组总DNA为模板，扩增目的基因启动子序列(SEQ ID No.2)。扩增结束后分别将其产物进行胶回收，具体操作步骤与实施例3一致。将得到的上述回收片段利用双片段同源重组试剂盒连入终载体骨架中，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过PCR扩增目的基因片段和酶切验证，得到转化子，并保存菌种。以上完成自身启动子启动的植物超表达载体(SEQ ID No.3)。
1)首先挑取菌检呈阳性的单菌落接种于含对应抗生素的LB液体培养基中，置于37℃摇床，200rpm放大培养。
2)大肠杆菌质粒提取主要采用BioFlux公司的提质粒试剂盒，该试剂盒主要有以下7种成分组成，分别为①Resuspensionbuffer、②Lysis buffer、③NeutralizationBuffer、④Wash Buffer、⑤Elution Buffer、⑥RNase solution、⑦Spin columns。
3)取1mL已经过夜培养的菌液加入1.5mL的离心管中，12000rpm，离心1min，弃上清，收集菌体(根据实际需要，可多次重复，以收集更多菌体)；
4)加入250μL①，重悬细菌体沉淀(重悬至没有细菌团块)；
5)加入250μL②，轻柔颠倒4～6次(不能剧烈震荡，以防止基因组DNA断裂)；
6)加入350μL③，立即轻柔颠倒离心管4～6次(此时离心管内应该出现絮状沉淀)，室温12000rpm，离心10min；
7)吸取4)中上清液转移至⑦中，12000rpm，离心1min，弃去收集管中废液；
8)向⑦中加入650μL④Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃去收集管中废液；
9)重复8)一次；
10)进行空离，12000rpm/min，离心5min，尽量去除④，以免④残留抑制下游反应；
11)将上述⑦转移至新的1.5mL离心管中，加入30～50μl⑤、水或者TE溶液等，室温静置1min，12000rpm，离心1min；
12)溶液中含有质粒DNA，收集离心管中溶液。重复过一遍⑦，再次12000rpm，离心1min；
13)质粒DNA可直接用于各类下游分子实验，-20℃保存；
植物表达载体的构建：将阳性单克隆提取的质粒用预先设计好的内切酶酶切，将胶回收得到的大片段骨架与回收的目的片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布到含卡那霉素浓度为50mg/L的LB固体培养基上，以菌落PCR和核酸限制性内切酶切方式筛选阳性单克隆。
2、proPLT5a-ptoPLT5a-eYFP质粒转化农杆菌GV3101
分别提取从阳性转化子大肠杆菌中提取proPLT5a-ptoPLT5a-YFP质粒，步骤按照Plasmid Mini Kit试剂盒提取步骤，具体操作如下：
①取培养至对数期的菌液于EP管中，13400rpm离心1min收集菌体，弃上清。
②加入预冷的已加入RNase A的SolutionI 250μL涡旋重悬菌体混匀。
③加入250μL SolutionII动作轻柔上下颠倒5-6次，混匀后静置2min。
④加入350μL SolutionIII，上下颠倒5-6次至沉淀出现，13400rpm离心10min。
⑤取上清加入吸附柱(约700μL上清)，吸附柱放置于2mL的收集管中，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑥加入500μL HB Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑦加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑧重复第7步，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，弃液。
⑨将吸附柱放于收集管中，空管13400rpm离心2min。
⑩将吸附柱放于另外一支新的离心管中，加入30-50μL Elution Buffer，静置2min，13400rpm离心1min。于-20℃保存备用。
转化农杆菌的操作如下：
①取5μL proPLT5a-ptoPLT5a-YFP质粒分别于200μL的农杆菌GV3101感受态细胞中，混匀。
②立即在冰上放置30min，迅速放入液氮2min，37℃水浴5min。
③加入800μL空的YEP液体培养基，混匀后置28℃、200rpm培养4-6h。
④5000rpm离心8min，弃900μL上清液，将剩余100μL菌液混合，用消毒冷却的涂布棒将100μL菌液均匀涂于YEP+40mg/L Rif+50mg/L Kan固体培养基上，28℃条件下倒置培养2d。
⑤将菌命名为GV3101-proPLT5a-ptoPLT5a-YFP，加15％甘油保存于-80℃，用于后续遗传转化实验。
实施例5毛白杨遗传转化
转化材料为野生型的毛白杨叶片，采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法。
1)农杆菌的活化
将含有重组质粒的农杆菌GV3101接种到YEP固体培养基(含50mg/L Kan+40mg/LRif)上，28℃培养1～2d；挑取单菌落接种于含有50mg/L Kan、40mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃振荡培养至OD 600为0.8～1.0；取200μL活菌液转到新鲜的YEP培养基中，28℃振荡培养6～8h，当OD 600达到0.6～0.8时离心收集菌体，用添加了AS的WPM液体培养基30ml重悬后放入28℃摇床中振荡培养1～2h即可用于转化。
2)农杆菌的转化
选取组培瓶中无菌野生型杨树材料作为背景进行转化。首先剪适量嫩绿的叶片，在适量无菌水中，用无菌手术刀片将其切成小块叶片(确保产生光滑的切口，利于转化生长)；将适量切好的叶片转移到重悬的菌液中，侵染10min，期间每隔5min摇晃一次，使其刀切伤口充分接触重悬菌液。
3)毛白杨的共培养
将浸染过的叶片材料用镊子小心夹出吸干菌液，叶片背面向下平铺在WPM共培养培养基上，放置在室温25℃条件下，黑暗条件下培养2天。
4)毛白杨的选择培养
2天后将转化过的叶片移到WPM选择培养基上(按实验所需放在带有相应抗性培养基中)，在室温25℃，黑暗条件下培养3～4周，其间每5天更换一次培养基(在选择培养期间，需要多观察叶片的变化程度)。
5)毛白杨的生芽培养
当叶片的周围出现白色点状疏松愈伤组织时，将其移入到WPM生芽培养基上(按实验所需放在带有相应抗性培养基中)，在光照为2000～10000Lux，室温25℃条件下的光照培养架子上来诱导生芽，时间约4～5周，在生芽培养期间，仍需要观察愈伤生长的变化情况，如果发现愈伤不生长或者出现褐化，应及时更换培养基。
6)毛白杨的生根培养
当生芽培养基中愈伤组织生出不定芽，并且长度约3～4cm时，切下并转入WPM生根培养基中，在正常情况下，野生型生根时间为7天左右，带抗性的则生根较慢。
7)转基因毛白杨的移栽
当生根的幼苗长至约10cm且根系比较发达时，取出幼苗，用水洗净根部的琼脂，做好标记，移栽到温室中培养即可(此时注意，在组培瓶中移出的苗子需要一个适应外界环境的阶段，所以需要用保鲜膜密封，待适应后慢慢揭开膜)。
实施例6转基因植株表达量分析
首先将经过毛白杨遗传转化得到未鉴定的转基因植株进行DNA水平检测，方法同实施例1。
对16颗转基因植株进行PCR检测后，发现其中10颗(L1、L2、L3、L5、L6、L9、L11、L13、L15、L16)成功实现了外源DNA的转化。琼脂糖凝胶电泳检测结果，如附图一所示。
尽管成功进行了毛白杨的遗传转化，但是由于不同植株之间的个体差异性，导致相同基因的表达水平各不相同，因此需要对转基因植株进行表达量的检测。本发明中，随机选取了L1、L2、L3、L5四颗转基因植株进行检测。
将野生型毛白杨和获得的转基因阳性植株分别提取RNA后反转录成cDNA，方法同实施例2，设计内参基因UBQ引物：
qPCR-ptoPLT5a-F：5′-ATCAGAACTGGCTCGGTTTC-3′
qPCR-ptoPLT5a-R：5′-TTGGTCTACAGGCAGCTACT-3′
将野生型和转基因株系的cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系同实施例2-2中表内程序一致。将同一浓度的野生型和超表达株系的cDNA利用荧光定量PCR检测目的基因PtoPLT5a,进而分析PtoPLT5a基因在不同转基因植株中表达量高低。(扩增产物可以使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。)
荧光定量反应体系如下表所示：
其反应条件为：
95℃，30s；
95℃，5s；
60℃，1min；40个循环
95℃，15s；
60℃，30s；
95℃，15s。
定量检测结果如下表所示：
Mean SD
WT-1 1.075989575 0.065337535
proPLT5a-PLT5a-eYFP-L1 182.8487428 11.41714239
proPLT5a-PLT5a-eYFP-L2 169.5990603 1.880966342
proPLT5a-PLT5a-eYFP-L3 138.3238642 7.362109509
proPLT5a-PLT5a-eYFP-L5 64.78516744 6.764847519
(注释：Mean值取三次重复检测的平均值)
对上述定量检测结果分析，发现转基因植株L1、L2的表达量较高。
经过2个月的培养后，分别观察并比较了野生型毛白杨和转基因植株L1和L2的地上部分(茎+叶子)和地下部分(根系)的表型。结果发现，与野生型相比转基因植株长势较好，地上部分更加茂盛，地下部分存在明显差别。如附图中A,C所示。
接下来为了凸显ptoPLT5a基因的重要性，选择了表达量最高的L1株系进行后续表型统计分析。主要包括转基因生物量、株高、茎粗、节间数、节间长度、纤维长度等。
表型统计数据如下表所示：
根据上述数据可知，与野生型毛白杨相比，过表达ptoPLT5a造成转基因植株株高增加，节间数目变化较小，茎秆粗细增加。如附图3中E,F,G所示。
茎秆粗细增加，结合前文所观察到的转基因整体植株生长更茂盛，暗示着转基因植株地上部分生物量增加。为了探究过表达ptoPLT5a对植株生物量的影响，在相同培养时间、相同培养条件下，分别从露出地表部分开始取野生型毛白杨和过表达转基因植株地上部分(茎+叶)，地下部分(根)。
取材结束后，晾干表面水分，称量鲜重(湿重)，计数。(注：地下部分根系较多，且容易损失，注意需在水中进行清洗)
将不同材料装进牛皮纸信封，做好标记后，封口，放入烘箱中(70℃)进行脱水烘干。烘干两天以上效果更佳，此时材料容易破碎，小心取出，称量干重，计数。
根据上述数据可知，过表达ptoPLT5a后，转基因植株地上部分生物量显著增加。尽管地下部分生物量小，但结果显示并未影响地上部分的生长。如图3中B,D所示。
前文所提到，与野生型毛白杨相比，转基因的茎秆长度显著增加，这暗示这其内部纤维长度也有所增加。利用震荡切片机对转基因材料(第8节间)进行纵切，初步观察比较发现，转基因纤维细胞长度长于野生型。但仍需要进行更加精细的统计分析。如图4中A-E所示。
实施例7转基因植株纤维细胞解离与染色分析
解离过程主要使用Franklin溶液浸泡转基因材料，待一定时间后分离出单条纤维细胞。统计分析不同发育时期纤维细胞长度。具体操作步骤如下所示：
1)提前配制Franklin溶液。
2)分别取野生型及转基因植株相同节间茎段(9TH)，首先将茎段外表皮去掉，尽量去完整。
3)使用一次性刀片将已经剥皮的茎段纵向切割，尽量保证不要中途断掉。分别将切好的不同转基因材料泡在Franklin溶液中，避光处理1-2天。
4)使用玻璃小球震荡，并用无菌水进行冲洗5-6次，最后使用75％乙醇保存溶液中纤维细胞。
5)取保存溶液滴在载玻片上，使用甲苯胺蓝染色后，进行观察统计。
6)未着色为发育中纤维细胞，着色成功为成熟的纤维细胞。分别记录并统计野生型与转基因植株发育中纤维细胞和成熟纤维细胞的长度变化。
为了更加精细的探究过表达ptoPLT5a对纤维细胞长度的影响，需要将纤维细胞解离释放出来，再进行统计分析。为此使用Franklin溶液处理转基因材料(目标茎段)。方法同实施例7。
当成功将纤维细胞解离并释放，进行染色后，显微镜观察形态后拍照，最后使用Imagej软件进行统计分析。如图5-A所示。
纤维长度统计
/>
根据上述纤维长度统计数据，过表达ptoPLT5转基因植株，发育中纤维细胞长度(Development Fiber)和最终成熟的纤维细胞长度(Muture Fiber)均显著增加。如图5中B所示。

Claims (8)

1.毛白杨PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度中的应用，所述毛白杨PtoPLT5a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为在毛白杨中超表达毛白杨PtoPLT5a基因，从而提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度。
3. 含有权利SEQ ID No.1所示核苷酸序列的基因的表达载体在提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体还含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的启动子。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
6.一种提高毛白杨生物量或/和纤维细胞长度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建植物表达载体：扩增毛白杨基因 PtoPLT5a及上游启动子，将其与载体相连接，然后转化农杆菌；所述毛白杨基因 PtoPLT5a的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，上游启动子核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
（2）毛白杨的遗传转化：转化材料为野生型毛白杨叶片，采用农杆菌介导的叶盘法；
（3）转基因植株分子检测：以转基因植株的基因组DNA为模板，通过扩增潮霉素抗性标记基因 Hyg 进行阳性植株筛选，筛选出高生物量的白杨。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增毛白杨基因 PtoPLT5a的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，下游引物的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID No.5。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增上游启动子proPLT5a的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，下游引物的核苷酸序列如核苷酸序列如SEQ ID No.7。
CN202210926763.3A 2022-08-03 2022-08-03 PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用 Active CN116254290B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210926763.3A CN116254290B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210926763.3A CN116254290B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116254290A CN116254290A (zh) 2023-06-13
CN116254290B true CN116254290B (zh) 2024-05-07

Family

ID=86678095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210926763.3A Active CN116254290B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116254290B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101431888A (zh) * 2004-06-16 2009-05-13 巴斯福植物科学有限公司 编码wrinkled1样多肽的核酸分子及在植物中的使用方法
CN102373236A (zh) * 2011-11-14 2012-03-14 北京市农林科学院 一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法
CN102892888A (zh) * 2009-12-30 2013-01-23 先锋国际良种公司 在植物中导入并调节表达基因的方法和组合物
CN102939383A (zh) * 2009-12-30 2013-02-20 先锋国际良种公司 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物
CN107418954A (zh) * 2017-09-12 2017-12-01 西南大学 毛白杨基因PtomiR390a及其应用
CN112424365A (zh) * 2018-06-07 2021-02-26 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 核酸构建体及其使用方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010075143A1 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant enhancement
WO2012084756A1 (en) * 2010-12-20 2012-06-28 Basf Plant Science Company Gmbh Nematode-resistant transgenic plants

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101431888A (zh) * 2004-06-16 2009-05-13 巴斯福植物科学有限公司 编码wrinkled1样多肽的核酸分子及在植物中的使用方法
CN102892888A (zh) * 2009-12-30 2013-01-23 先锋国际良种公司 在植物中导入并调节表达基因的方法和组合物
CN102939383A (zh) * 2009-12-30 2013-02-20 先锋国际良种公司 用于靶向多核苷酸修饰的方法和组合物
CN102373236A (zh) * 2011-11-14 2012-03-14 北京市农林科学院 一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法
CN107418954A (zh) * 2017-09-12 2017-12-01 西南大学 毛白杨基因PtomiR390a及其应用
CN112424365A (zh) * 2018-06-07 2021-02-26 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心 核酸构建体及其使用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"PREDICTED: Populus trichocarpa AP2-like ethylene-responsive transcription factor AIL5 (LOC7488963), transcript variant X1, mRNA";NCBI;《genbank》;20180409;ACCESSION XM_024589557 *
"Auxin-mediated Aux/IAA-ARF-HB signaling cascade regulates secondary xylem development in Populus";Changzheng Xu 等;《New Phytol》;20190201;第222卷(第2期);第752-767页 *
"Cytokinin signaling localized in phloem noncell-autonomously regulates cambial activity during secondary growth of Populus stems";Xiaokang Fu 等;《New Phytol》;20210308;第230卷(第4期);第1476-1488页 *
"杨树miR319a调控侧根发育的分子机制研究";李建秋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (农业科技辑)》;20210115(第1期);D049-214 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116254290A (zh) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109384837B (zh) 一种杨树抗旱基因及其应用
CN103805632B (zh) 一种转基因茄子的制备方法
CN110713529A (zh) VvDUF642基因引起植物种子败育的用途
CN113278650A (zh) 一种农杆菌侵染银腺杨愈伤组织的遗传转化方法
CN117737078A (zh) MADS-box基因RhAGL6及其在调节月季花器官发育中的应用
CN116254290B (zh) PtoPLT5a基因在提高毛白杨生物量和纤维细胞长度中的应用
CN104673803B (zh) 基因甲基化在调控基因表达方面的应用
CN113603757A (zh) 一种岷江百合Dirigent类似蛋白基因LrDIR1及应用
CN108165555B (zh) 栽培茄SmHQT基因核心片段及其RNAi表达载体和应用
CN106676114B (zh) 水稻基因OsUEP3及抗病调控功能的应用
CN117821496A (zh) 过表达生长素转运蛋白PtoPIN1a基因在提高毛白杨生物量中的应用
CN116731139B (zh) 毛白杨PtoERF15基因在调控杨树抗旱上的应用
CN104560906B (zh) 纤维细胞中特异表达的蛋白质CYP734A1 like‑1及其应用
CN117025834B (zh) 一种转基因玉米vb15外源插入片段的旁侧序列及其应用
CN113817745B (zh) 一种促进木材形成的基因OreFLA11及其应用
CN113604475B (zh) 棉花gh_d03g1517基因在促进抗旱和耐盐中的应用
CN111500624B (zh) CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫以及非生物胁迫抗性中的用途
CN106754968B (zh) 水稻基因OsASR2及抗病调控功能的应用
CN116814652A (zh) ‘赣彤1号’CcMYB4_LIKE基因及其表达蛋白和应用
CN116355870A (zh) 玉米核糖核苷酸还原酶大亚基ZmLSC1基因在植物品种育种中的应用
CN117402911A (zh) 干扰毛白杨转录因子PtoMYB240表达在提高毛白杨生物量中的应用
CN117025632A (zh) CsKIC基因及其编码的蛋白在调控黄瓜白粉病抗性中的应用
CN116590301A (zh) 一种杂交鹅掌楸LhWUS基因及其表达蛋白和应用
CN116855528A (zh) 一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用
CN116063428A (zh) GhABF3基因在调控植物开花期中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant