CN113817745B - 一种促进木材形成的基因OreFLA11及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体提供了一种促进木材形成的基因OreFLA11，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；在新疆杨中过表达OreFLA11基因，能显著提高新疆杨茎部木质素和木糖含量，增厚木质部厚度和木质部纤维细胞次生壁厚度，增强茎秆的抗拉强度。该基因对于培育结构更加质密，品质更加坚硬的优质木材和抗病虫害，抗风沙的优良树种具有重要的理论及实践意义。

Description

一种促进木材形成的基因OreFLA11及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种促进木材形成的基因OreFLA11及其应用。
背景技术
木本植物指根和茎因增粗生长形成大量的木质部，而细胞壁也多数木质化的坚固的植物。植物体木质部发达，茎坚硬，多年生。木材是木本植物通过次生生长所形成的木质化组织，是维管形成层近轴向分裂分化产生的次生维管组织的统称，且木材对于人类生活起着很大的支持作用。根据木材不同的性质特征，人们将它们用于不同途径。杨树属于木本植物中的一种，是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。相对于利用常规杂交育种手段，分子技术育种手段，提供了快速、有效的途径。随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。而新疆杨(Populus alba var pyramidalis)属于杨树的经典品种，是一种落叶乔木，树型高大，具有生长迅速、适应性强、扦插繁殖容易等特点，用于城市造林，防风固沙和生态修复，是我国北方地区大规模栽培的优良杨树树种，具有极其重要的应用价值(Eckenwalder，1996)。但是，由于新疆杨材质较差，木质疏松，易受病虫害侵扰，而南方空气湿度大，适合各种病虫繁衍生长，导致了新疆杨在南方不易存活，极大的限制了新疆杨的分布范围。同时，新疆杨在北方作为防护林，其防风固沙作用显著，但由于其寿命较短，8-10年需重新更替一次，影响了防风固沙效果。因此，如果能够改良新疆杨及其他部分木本植物的木材品质，提高新疆杨及其他部分木本植物的抗病虫能力，扩大分布范围，延长寿命，增加防护效果，将具有重要的经济价值、社会价值和生态意义。
天目铁木(Ostrya rehderiana)，桦木科Betulaceae，铁木属Ostrya植物，濒危物种，为国家Ⅰ级重点保护野生植物，野生植株仅存5株。天目铁木不仅是我国特有种，而且是该属分布于我国东部的唯一种类，仅分布于浙江西天目山的山麓林缘或林旁。天目铁木木质色浅，纹理清晰，坚硬如铁，刀斧难入，耐水湿，花纹细腻美观，具有广泛的用途，可作为家具、室内装饰及雕刻用材等(赵明水和张华峰，2006)，但野生天目铁木数量极少，濒临灭绝。其主要原因一方面是树种分布区太窄，遭人为破坏后数量急剧下降；另一方面是植株结实率低而种子萌发和成苗立地条件要求苛刻。因此，为了保存物种，扩大种群群体，保护生物基因，促进生物多样性和林业的可持续发展，亦为了天目铁木的优良品质被有效利用，人工种植天目铁木林已成为趋势。
FLAs(Fasciclin-like arabinogalactan proteins)成束类似蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白，属于阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)。FLA不仅包含1-2个AGP-like糖基化区域，而且包括1-2个成束蛋白结构域。大多数FLAs在N-端含有25个氨基酸残基的信号肽，在C-端含有糖基磷脂酰肌醇膜锚定位点(Zang et al.,2015)。FLA基因家族在多种植物中已被鉴定，如拟南芥，水稻，小麦、新疆杨、毛果杨和桉树。但是，上述物种中的FLAs基因数量相对较少，且植株的性状不佳。
在天目铁木中，发明人首次鉴定到了35条Ore，并且首次发现天目铁木FLA基因在第Ⅱ亚家族中发生明显扩张。发明人在这35条基因中发现了OreFLA11具有优良的功效，在各个组织中都有表达，且具有提高木质素的含量、提高木糖的含量、提高阿拉伯糖的含量、降低纤维素含量、增厚木质部厚度、增厚木质部木纤维细胞次生壁厚度、增强植物茎秆的抗拉强度等功能。之后以新疆杨为研究对象，将天目铁木的基因OreFLA11通过转基因技术转入到新疆杨中，获得木质素含量提高、抗拉强度增强、木材结构更加质密，木材材质更加坚硬、品质更加优良，兼具天目铁木和新疆杨优点的转基因优良树木品种，首次完成了在新疆杨中的转化，具有重要的经济和社会意义。
参考文献：
赵明水，张华峰.天目铁木物理力学性质初步分析[J].浙江林业科技，2006(1):52-55.
Zang L.,Zheng T.,Chu Y.,Ding C.,Zhang W.,Huang Q.,&Su X.(2015).Genome-wide analysis of the fasciclin-like arabinogalactan protein genefamily reveals differential expression patterns,localization,and salt stressresponse in Populus.Frontiers in plant science 6,1140.
发明内容
本发明的目的是提供一种促进木材形成的基因OreFLA11，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
本发明的第二目的是提供含有所述基因OreFLA11的表达载体。
优选地，所述的表达载体为双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。
优选地，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pCXSN和pCXDG，携带有本发明相关蛋白编码基因OreFLA11的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
本发明的第三目的是提供含有所述基因OreFLA11的细胞系和宿主菌。
本发明的第四目的是提供所述的基因OreFLA11在用于改善性状的木本植物育种中的应用，所述的改善性状选自以下一种或几种：
(1)提高木质素的含量；
(2)提高木糖的含量；
(3)提高阿拉伯糖的含量；
(4)降低纤维素含量；
(5)增厚木质部厚度；
(6)增厚木质部木纤维细胞次生壁厚度；
(7)增强植物茎秆的抗拉强度。
优选地，所述的木本植物选自新疆杨、金合欢树、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃树、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、山杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树、枫香树、柏树、道格拉斯冷杉、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉。
优选地，所述的木本植物为新疆杨。
本发明的第五目的是提供一种所述的基因OreFLA11编码的蛋白质OreFLA11，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第六目的是提供构建含有所述基因OreFLA11的表达载体的方法，其步骤如下：
(1)将所述的基因片段通过酶切连接方法连接到表达载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆；
(2)进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合OreFLA11基因的表达载体35S::OreFLA11的阳性菌株；
(3)从步骤(2)获得的阳性菌株中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株；
(4)挑取步骤(3)得到的阳性单克隆菌株，通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种分离自濒危物种天目铁木的促进木材形成的基因OreFLA11，其定位于细胞核和细胞膜。在木本植物中过表达基因OreFLA11，能显著提高转基因植株的木质素和木糖含量，促进了木质部的发育，增厚了木质部厚度和木质部次生细胞壁的厚度，增强了转基因植株茎秆的抗拉强度。该基因的发现对于培育木材结构更加质密，木材材质更加坚硬和更抗病虫害，抗风沙的优良树木品种具有重要的理论及实践意义。
附图说明
此处应当说明的是附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1天目铁木OreFLAs基因家族的鉴定，基因结构及系统发育树。
利用OreFLAs基因家族的35个成员的氨基酸序列构建的ML(Maximum likelihood)树，bootstrap＝1000。利用OreFLAs基因家族的35个成员的核苷酸序列展示的基因结构图，蓝色长块代表外显子，黑色细线代表内含子。
图2天目铁木OreFLAs基因染色体定位及共线性分析。
图3天目铁木OreFLAs基因表达量热图。
图4构建的融合绿色荧光蛋白GFP的表达载体示意图，35S::GFP-OreFLA11。
图5天目铁木OreFLA11蛋白的亚细胞定位。
图6构建的pCXSN过表达载体示意图，35S::OreFLA11。
图7天目铁木木材形成基因OreFLA11过表达转基因新疆杨的三个株系OE2、OE3、OE5和野生型新疆杨WT。
图8 OreFLA11基因过表达转基因新疆杨(OE)和野生型新疆杨(WT)木材成分和茎秆抗拉强度测定。
图(A)木质素含量的测定；
图(B)纤维素含量的测定；
图(C)半纤维素含量的测定；
图(D)茎秆抗拉强度测定。
以上所有含量测定，每个株系取3个重复，每个重复至少测量3次，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图9 OreFLA11基因过表达转基因新疆杨(OE)和野生型新疆杨(WT)茎组织切片观察。
图(A)新疆杨茎石蜡切片横切面。红色双箭头表示木质部宽度，黑色短线表示比例尺200μm。
图(B)新疆杨木质部纤维细胞扫描电镜结果。红色箭头指示细胞壁增厚部位，白色短线表示比例尺10μm。
图(C)木质部厚度统计结果。每个株系取3个重复，每个重复至少测量30次，**表示P<0.01。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为天目铁木(Ostrya rehderiana)和新疆杨(P.alba var.pyramidalis)。
本发明所述的木本植物(woody plant)是指根和茎因增粗生长形成大量的木质部，而细胞壁也多数木质化的坚固的植物。植物体木质部发达，茎坚硬，多年生。
实施例1天目铁木OreFLAs基因家族的鉴定及系统发育分析
我们首先用拟南芥的AtFLA1蛋白序列通过Blastp的方法在天目铁木蛋白序列数据库中比对查找FLA同源序列，然后去掉冗余的基因并在Pfam和SMART数据库中分析了保守结构域，最终在天目铁木中鉴定出了35条FLAs基因序列，依次命名为OreFLA1-OreFLA35。为了进一步确定OreFLAs基因家族的系统发育关系，利用这35条天目铁木OreFLAs基因序列和21条拟南芥AtFLAs基因序列通过RAxML软件构建了ML系统发育树。结果表明，天目铁木OreFLAs基因家族成员聚为四个亚家族(I-Ⅳ)，并且天目铁木OreFLAs基因在第Ⅱ亚家族中发生了明显的扩张(图1)。为了进一步阐明天目铁木OreFLAs基因家族成员的特征，我们通过在线网站GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)预测了每条序列的基因结构，结果表明，大部分OreFLAs基因只含有一个外显子，并不包含内含子，只有少数OreFLAs基因含有2外显子。并且OreFLAs基因结构非常保守，除了第I亚家族外，其余每个亚家族成员的基因结构基本相同，具体如图1所示。
实施例2天目铁木OreFLAs基因染色体定位，共线性分析及在不同组织中的表达模式分析
天目铁木共有8条染色体，35条OreFLAs基因定位于7条染色体上，其中第3条染色体不包含任何一条OreFLAs基因，第2条染色体上的OreFLAs基因数量最多，共有18条，如图2所示。并且第Ⅱ亚家族中发生明显扩张的基因大部分位于第2条染色体上，并且这些基因为重复基因，相互之间存在共线性关系。OreFLA11和OreFLA12位于第8条染色体上，OreFLA11基因与位于第2条染色体上重复基因之间也存在着共线性关系。结合系统发育树、染色体定位和共线性分析，我们推测这些位于第2条染色体上的重复基因是通过OreFLA11基因复制产生的，OreFLA11基因有可能是这些重复基因的祖先序列。
我们根据天目铁木不同组织(根、叶、木质部和韧皮部)转录组数据，分析了OreFLAs基因在不同组织中的表达模式，如图3所示。结果表明，除了第Ⅱ亚家族外，其余亚家族的OreFLAs基因在不同组织中的表达模式基本相同。在Ⅱ亚家族中的重复基因在不同组织中的表达模式也基本相同，几乎在不同组织中都不表达。但是OreFLA11基因作为这些重复基因的祖先序列，其表达模式与这些重复基因完全不同，它们之间的表达模式发生了分化，并且OreFLA11基因主要在木质部和根中表达，表明OreFLA11基因在天目铁木木材形成过程中具有重要的作用。
实施例3天目铁木OreFLA11基因序列的克隆
利用RNA提取分离试剂Trizol，提取天目铁木叶片组织的总RNA，其具体方法是：称取新鲜的天目铁木叶片组织0.1g，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1ml Trizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中，室温放置10min；4℃，12000r/min离心10min，取上清到新的1.5ml离心管中；每使用1ml Trizol加0.2ml的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min；4℃，12000r/min离心15min，取上清到新的1.5ml离心管中，弃中下层；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃，12000r/min离心10min沉淀RNA，弃上清；加入75％的乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃，12000r/min离心2min；晾干沉淀，溶解于50μL DEPC水，-80℃保存备用。
根据天目铁木因组(Yang et al.,2018)获取该OreFLA11基因的全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物：
上游引物：5’-ATGAAGCAAGTCATTCACTTCTCG-3’
下游引物：5’-TAGCCAAAGGGAAAACAATGCAG-3’
通过反转录及PCR扩增获得OreFLA11基因序列，具体方法是：依据试剂盒PlantRT-PCR Kit 2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl2 4μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNasefree Water 8.5μl；dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；Oligo dT-Adaptor1μl)。混匀后，42℃30min；99℃5min；4℃5min，完成反转录反应。吸取1μl反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃5min后进入扩增程序，94℃50s，53℃50s 30min、72℃1min，38个循环后，72℃10min。经过上述流程，扩增得到OreFLA11基因的CDS序列，并且扩增得到的OreFLA11 CDS序列自起始密码子到终止密码子总长738个碱基，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例4天目铁木OreFLA11基因的亚细胞定位
每个基因翻译的蛋白在细胞中的定位不同，其相应的功能有可能也不相同，发挥的作用也完全不同。因此，我们也检测的天目铁木OreFLA11蛋白的亚细胞定位。
天目铁木OreFLA11基因融合绿色荧光蛋白GFP表达载体的构建：将测序验证过的实施例3得到的OreFLA11基因的CDS片段通过酶切连接方法连接到pCXDG表达载体上(结构示意图如图4所示)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合GFP的表达载体35S::GFP-OreFLA11和阳性菌株。提取融合GFP的质粒，转化农杆菌GV3101感受态中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的GV3101阳性菌株，用于侵染烟草。
烟草叶片的瞬时表达：将含35S::GFP-OreFLA11质粒转化成功的GV3101阳性菌株在LB培养基中28℃200r培养至OD值约0.5左右，5000r离心10min收集菌体，在重悬液(10mM氯化镁，10mM MES，150μM乙酰丁香酮，PH5.6)中重悬后，黑暗培养3小时，用1ml注射器将重悬菌液侵染烟草叶片，侵染好的烟草培养48-72小时后用激光共聚焦显微镜观察荧光。
结果如图3所示，天目铁木OreFLA11基因编码的蛋白定位于细胞核和细胞质膜上。
亚细胞定位实验结果说明，天目铁木OreFLA11基因定位于细胞核和细胞质膜上。
实施例5过表达天目铁木OreFLA11转基因新疆杨的获得及阳性植株的鉴定
天目铁木OreFLA11基因过表达载体的构建：将测序验证过的实施例3得到的基因片段通过酶切连接方法连接到pCXSN二元表达载体上(构建示意图如图6所示)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合OreFLA11基因的表达载体35S::OreFLA11的阳性菌株。从阳性菌种中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株，进一步挑取阳性单克隆菌株，通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
农杆菌介导的叶盘转化法：将含35S::OreFLA11质粒转化成功的GV3101阳性菌株在LB培养基中28℃200rpm培养至OD值约0.5左右，5000rpm离心10min收集菌体，在重悬液(10mM氯化镁，10mM MES，150μM乙酰丁香酮，PH5.6)中重悬后，重悬液黑暗培养3小时备用。取长势良好的新疆杨无菌组培苗叶片，在超净工作台中用无菌打孔器打成叶盘，将打好的叶盘放入黑暗培养后的重悬液中，浸泡10分钟，每隔2分钟摇晃一次。
转基因新疆杨不定芽的获得：取出上述步骤浸泡后的叶盘，放入愈伤诱导培养基中，暗培养10-15天，待愈伤组织长出后放入生芽培养基，培养2-3个月后诱导出不定芽，待不定芽长至1-2cm后从基部剪掉，接入生根培养基中。以上愈伤组织培养基，不定芽诱导培养基和不定根诱导培养基中均加入20mg/L的潮霉素进行筛选。
转基因新疆杨阳性植株的鉴定：上述步骤诱导产生的不定芽在生根培养基中培养1-2个月后，取叶片0.1g提取DNA，PCR扩增OreFLA11目的片段，测序验证。将验证好的阳性苗植株经过炼苗后移栽到土壤中，在光周期为16小时光照/8小时黑暗，25℃的温室中生长，转基因新疆杨如图7所示。获得的过表达OreFLA11转基因新疆杨，其外在表型与野生型新疆杨没有明显的变化。在过表达OreFLA11转基因新疆杨中，根据OreFLA11基因的表达水平，我们分别挑选了表达量高、中、低的三个过表达新疆杨株系OE2、OE3、OE5进行木材成分的测定。
实施例6过表达天目铁木OreFLA11转基因新疆杨的木材成分和抗拉强度测定
取苗龄为5个月，长势一致，由实施例5中获得的过表达OreFLA11转基因和野生型新疆杨茎秆在液氮中磨成粉末，用70％(v/v)乙醇、氯仿/甲醇(1:1v/v)和丙酮依次洗涤粉末制备成醇不溶物AIR(Alcohol-Insoluble Residue)。淀粉酶处理去除AIR中的淀粉，用水和丙酮清洗，45℃烘干测量木质素，纤维素和半纤维素含量。我们也通过拉力测试仪测定了苗龄为5个月，长势一致，由实施例5中获得的过表达OreFLA11转基因和野生型新疆杨茎秆的抗拉强度。
结果如图8所示，野生型新疆杨WT的木质素含量为187.34μg/mg，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的木质素含量分别为205.69、209.88和196.82μg/mg(图8A)，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的木质素含量显著升高；野生型新疆杨WT的纤维素含量为476.80mg/g，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的纤维素含量分别为413.22、384.46和354.36mg/g(图8B)，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的纤维素含量显著降低；野生型新疆杨WT的木糖含量为20.47μg/mg，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的木糖含量分别为23.37、20.65、24.60μg/mg(图8C)，过表达OreFLA11新疆杨OE2和OE5的木糖含量显著升高；野生型新疆杨WT的阿拉伯糖含量为3.34μg/mg，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的木糖含量分别为4.19、4.37、4.26μg/mg(图8C)，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的木糖含量显著升高；野生型新疆杨WT的抗拉强度为0.85Mpa，过表达OreFLA11新疆杨OE2、OE3和OE5的抗拉强度分别为1.53、1.28和0.88MPa(图8D)，过表达OreFLA11新疆杨OE2和OE3的抗拉强度显著增强。结果表明，过表达OreFLA11新疆杨显著提高了木质素、木糖和阿拉伯糖的含量，降低了纤维素含量，并且显著增强了茎秆的抗拉强度。
通过上述的实施例我们可以得出，OreFLA11基因主要通过调控天目铁木和新疆杨的各种木材组分的生物合成，进而促进木材的形成，而新疆杨属于典型的木本植物。因此，发明人推断除了天目铁木和新疆杨之外，OreFLA11基因对其他具有木质部的木本植物均具有促进木材形成的作用，可以将OreFLA11基因通过基因工程的方法转化到其他木本植物中，也可以促进其他木本植物的木材形成。
实施例7过表达天目铁木OreFLA11转基因新疆杨茎组织化学观察：石蜡切片和甲苯胺蓝染色，扫描电镜观察
石蜡切片：新疆杨茎段切成0.5cm左右，浸泡在FAA固定液(70％乙醇：乙酸：福尔马林甲醛溶液＝90:5:5)中，4℃固定24h以上。70％、85％、95％乙醇逐级脱水各1h；无水乙醇30min，2次；无水乙醇/二甲苯1:1，1h；二甲苯，1h，二甲苯/石蜡1：1，2h；石蜡I，4h；石蜡II，过夜。将茎段取出于包埋框包埋，保存于4℃。修好的蜡块在切片机(Leica RM2235)上切10μm厚蜡带，固定于载玻片，42℃烘片4h以上。
甲苯胺蓝染色：将制备好的切片于0.1％的甲苯胺蓝溶液中染色10-15min，清水洗去浮色，37℃烘箱烘干。二甲苯中脱蜡2次，每次10-20min。中性树胶封藏，显微镜观察。
扫描电镜观察：新疆杨茎段用戊二醛固定，乙醇梯度脱水，丁叔醇浸泡置换除去乙醇。材料临界点干燥，喷金后扫描电镜观察茎段横切面木质部纤维细胞。
结果如图9所示，过表达OreFLA11新疆杨显著增厚了木质部厚度(图9A，9B)和木质部木纤维细胞次生壁厚度(图9C)。有助于增强新疆杨茎的抗拉强度，使木材材质更加质密坚硬。
综上所述，本发明发现了一种分离自濒危物种天目铁木的促进木材形成的基因OreFLA11，其定位于细胞核和细胞膜。在新疆杨中过表达基因OreFLA11，能显著提高转基因新疆杨的木质素、木糖和阿拉伯糖含量，促进了木质部的发育，增厚了木质部厚度和木质部次生细胞壁的厚度，增强了转基因新疆杨茎秆的抗拉强度。该基因对于培育木材结构更加质密，木材材质更加坚硬和更抗病虫害，抗风沙的优良树木品种具有重要的理论及实践意义。
序列表
<110> 兰州大学
<120> 一种促进木材形成的基因OreFLA11及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 天目铁木(Ostrya rehderiana)
<400> 1
atgaagcaag tcattcactt ctcgtttctt atatttttca tcttcttcat ctgttgcacc 60
acaacctcag ctcaagctcc tgcagagtct cctgcggagt ctcctgcagc agtaccatca 120
ggccctatca aaatcatcgc aatcctcaag aagtccggcc atttcactac atttatccgg 180
ctgctaaaaa acaccgatat ggcggaacaa gtcaacggac agcttaaaaa gactaacatc 240
ggccgtacca tctttgcacc gcccgacagc ggcttctccg acctcaaatt aggcactcta 300
aactctctta gtggtagtga acagctccaa ctggtgcaat tccatgtcat ccctgcttac 360
ttatctgtgt tgcagctcca aactgctaca aaccctgtgc atacagtggc tggcgatagc 420
aacgagggcg atttccaact aaatgtaaca tcctcatcaa cacaagtcaa cataacaaca 480
ggggttgtaa atgcaacaat aaccgatacc ctatttaatg aaaacggccg gcttgctgtt 540
tatcaggtgg atcacgtgct tcttccactg aaactctttg ggacatctcc gctcacacca 600
ccgccgtcta agcctgagaa ggatgatggt ttaaacgcta ctgctccagc atcttccggt 660
gtagatccaa acagccaagt aacggcggca atatcggttg gagttgcggt tgctgcattg 720
ttttcccttt ggctatga 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 天目铁木(Ostrya rehderiana)
<400> 2
Met Leu Gly Val Ile His Pro Ser Pro Leu Ile Pro Pro Ile Pro Pro
1 5 10 15
Ile Cys Cys Thr Thr Thr Ser Ala Gly Ala Pro Ala Gly Ser Pro Ala
20 25 30
Gly Ser Pro Ala Ala Val Pro Ser Gly Pro Ile Leu Ile Ile Ala Ile
35 40 45
Leu Leu Leu Ser Gly His Pro Thr Thr Pro Ile Ala Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Thr Ala Met Ala Gly Gly Val Ala Gly Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ile
65 70 75 80
Gly Ala Thr Ile Pro Ala Pro Pro Ala Ser Gly Pro Ser Ala Leu Leu
85 90 95
Leu Gly Thr Leu Ala Ser Leu Ser Gly Ser Gly Gly Leu Gly Leu Val
100 105 110
Gly Pro His Val Ile Pro Ala Thr Leu Ser Val Leu Gly Leu Gly Thr
115 120 125
Ala Thr Ala Pro Val His Thr Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly Gly Ala
130 135 140
Pro Gly Leu Ala Val Thr Ser Ser Ser Thr Gly Val Ala Ile Thr Thr
145 150 155 160
Gly Val Val Ala Ala Thr Ile Thr Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ala Gly
165 170 175
Ala Leu Ala Val Thr Gly Val Ala His Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu
180 185 190
Pro Gly Thr Ser Pro Leu Thr Pro Pro Pro Ser Leu Pro Gly Leu Ala
195 200 205
Ala Gly Leu Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Ser Gly Val Ala Pro Ala
210 215 220
Ser Gly Val Thr Ala Ala Ile Ser Val Gly Val Ala Val Ala Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ser Leu Thr Leu
245

Claims (8)

1.一种促进木材形成的基因OreFLA11，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.含有权利要求1所述基因OreFLA11的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pCXSN或pCXDG。
5.含有权利要求1所述基因OreFLA11的细胞系或宿主菌。
6.如权利要求1所述的基因OreFLA11在用于改善性状的木本植物育种中的应用，其特征在于，所述的改善性状选自以下一种或几种：
（1）提高木质素的含量；
（2）提高木糖的含量；
（3）提高阿拉伯糖的含量；
（4）降低纤维素含量；
（5）增厚木质部厚度；
（6）增厚木质部木纤维细胞次生壁厚度；
（7）增强植物茎秆的抗拉强度；
所述的木本植物为新疆杨。
7.一种由权利要求1所述的基因OreFLA11编码的蛋白质OreFLA11，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
8.构建含有权利要求2-4任一项所述基因OreFLA11的表达载体的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）将所述的基因片段通过酶切连接方法连接到表达载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50 mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆；
（2）进一步挑取单克隆通过PCR扩增，测序验证，最终得到融合OreFLA11基因的表达载体35S:: OreFLA11的阳性菌株；
（3）从步骤（2）获得的阳性菌株中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50 mg/L的卡那霉素、50 mg/L利福平和50 mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株；
（4）挑取步骤（3）得到的阳性单克隆菌株，通过PCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
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