CN117247440A - 一种改良植物性状的蛋白PalFLA11、核酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体提供了一种改良植物性状的蛋白PalFLA11，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，在木本植物中过表达，能显著提高转基因植株的纤维素和木糖含量，增厚了木质部厚度，增长了木质部木纤维细胞的长度，增强了转基因植株茎秆的抗拉强度，影响木材的发育，该蛋白PalFLA11的发现对于培育木材结构更加质密，木材材质更加坚硬和更抗病虫害，抗风沙的优良树木品种具有重要的理论及实践意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种改良植物性状的蛋白PalFLA11、核酸及其应用。
背景技术
木本植物指根和茎因增粗生长形成大量的木质部，而细胞壁也多数木质化的坚固的植物，其植物体木质部发达，茎坚硬，多年生。木材是木本植物通过次生生长所形成的木质化组织，是维管形成层近轴向分裂分化、加厚产生的次生维管组织的统称。木材作为一种可再生、可循环的环境友好型生物资源，对于人类生活起着很大的支持作用，影响着人类生活的方方面面。杨树属于木本植物中的一种，是一种在全球广泛分布的经济树种，具有早期速生、适应性强、分布广、品种多、易杂交、易改良遗传性、易繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。新疆杨(Populus alba varpyramidalis)是杨柳科杨属中银白杨的一个变种，落叶乔木，树型高大，具有生长迅速、适应性强、扦插繁殖容易等特点，用于城市造林，防风固沙和生态修复，是我国北方地区大规模栽培的优良杨树树种，具有极其重要的应用价值(Eckenwalder，1996)。现存新疆杨只有雄株，主要以扦插方式进行繁殖，生长迅速且不像其它杨树一样在春季产生种子絮状物，茎秆直立高大，生物量产量较高，用途较广，因此被广泛栽培和种植。
随着近年来遗传学、基因组学和分子生物学技术的发展，杨树成为了一种研究木材形成、多年生植物季节变化规律、生长发育、开花、性别决定以及生物互作的模式植物。但是，由于新疆杨材质较差，木质疏松，易受病虫害侵扰，而南方空气湿度大，适合各种病虫繁衍生长，导致了新疆杨在南方不易存活，极大的限制了新疆杨的分布范围。因此，如果能够改良新疆杨及其他部分木本植物的木材品质，改良新疆杨及其他部分木本植物的性状，扩大分布范围，将具有重要的经济价值和生态意义。
为了改良植物的性状，本领域技术人员做了诸多的研究，例如，发明专利CN105985421B公开了促进木本植物茎生长基因TcSG，还具有增加木本植物植株的高度、节间的长度和茎的粗度的效果；发明专利CN112513275B公开了一种miR396或其编码基因的突变体，能够在低氮条件下改良植物农艺性状。但是，目前并没有公开同时具有提高纤维素的含量、提高木糖的含量、降低木质素含量、降低半乳糖含量、增厚木质部厚度、增长木质部木纤维细胞长度、增强植物茎秆的抗拉强度等功能的基因，改良新疆杨的性状。
发明人发现PalFLA11基因具有提高纤维素的含量、提高木糖的含量、降低木质素含量、降低半乳糖含量、增厚木质部厚度、增长木质部木纤维细胞长度、增强植物茎秆的抗拉强度等功能。之后将基因PalFLA11通过转基因技术转入到新疆杨中，获得纤维素含量提高、抗拉强度增强、木材结构更加质密，木材材质更加坚硬、品质更加优良的新疆杨优质树木品种，具有广阔的应用前景。
参考文献：
Eckenwalder,JE.Systematics and evolution of Populus.In:Stettler,RF etal.,eds.Biology ofPopulus,and its implications for management andconservation.Ottawa,Canada:NRCResearch Press.1996.
Ma,J.,Wan,D.,Duan,B.,Bai,X.,Bai,Q.,Chen,N.,Ma,T.,2019.Genome sequenceand genetictransformation ofa widely distributed and cultivatedpoplar.PlantBiotechnol.J.17,451–460.Wang,H.,Wang,C.,Liu,H.,Tang,R.,Zhang,H.,2011.Anefficient Agrobacterium-mediatedtransformation and regeneration system forleaf explants of two elite aspen hybrid clonesPopulus alba×P.berolinensisand Populus davidia×P.bolleana.Plant Cell Rep.30,2037-2044.
发明内容
本发明的首要目的是提供一种改良植物性状的蛋白PalFLA11，所述的蛋白PalFLA11是如下S1)、S2)或S3)所示的蛋白质：
S1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白PalFLA11；
S2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
S3)在S1)或S2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
本发明的第二目的是提供一种生物材料，所述的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码蛋白PalFLA11的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
优选的，所述的表达载体为双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。
优选地，所述的可用于植物微弹轰击的载体为pCXSN，携带有本发明相关蛋白编码基因PalFLA11的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
本发明的第三目的是提供蛋白PalFLA11在如下(1)-(8)任一种的应用：
(1)提高纤维素的含量；
(2)提高木糖的含量；
(3)降低半乳糖的含量；
(4)降低木质素含量；
(5)增厚木质部厚度；
(6)增长木质部木纤维细胞长度；
(7)增强植物茎秆的抗拉强度；
(8)植物育种；
所述的蛋白PalFLA11为如下S1)、S2)或S3)：
S1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白PalFLA11；
S2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
S3)在S1)或S2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
优选的，所述的植物为木本植物。
优选的，所述的木本植物选自新疆杨、金合欢树、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃树、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、山杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树、枫香树、柏树、道格拉斯冷杉、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉中的一种或几种。
优选的，所述育种的目的为选育植物性状优良的植物。
本发明的第四目的是提供一种改良植物性状的方法，包括：提高受体植物中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的活性和/或含量，或，促进中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比植物性状改良的目的植物。
本发明的第五目的是提供一种培育转基因植物的方法，包括提高受体植物中中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的活性和/或含量，或，促进中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比植物性状改良的目的植物。
优选的，所述的转基因植物区别于所述的受体植物分别体现在如下(1)-(7)：
(1)转基因植物的纤维素含量高于受体植物；
(2)转基因植物的木糖含量高于受体植物；
(3)转基因植物的半乳糖含量低于受体植物；
(4)转基因植物的木质素含量低于受体植物；
(5)转基因植物的木质部厚度厚于受体植物；
(6)转基因植物的木质部木纤维细胞长度长于受体植物；
(7)转基因植物的茎秆抗拉强度强于受体植物。
本发明的第六目的是提供构建含有所述基因PalFLA11的表达载体的方法，其步骤如下：
(1)将所述的基因片段通过酶切连接方法连接到表达载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆；
(2)进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合PalFLA11基因的表达载体35S::PalFLA11的阳性菌株；
(3)从步骤(2)获得的阳性菌株中提取连接成功的质粒，转化到感受态的农杆菌GV3101中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株；
(4)挑取步骤(3)得到的阳性单克隆菌株，通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的农杆菌GV3101阳性菌株，用于侵染新疆杨。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种改良植物性状的蛋白PalFLA11，能显著提高转基因植株的纤维素和木糖含量，增厚了木质部厚度，增长了木质部木纤维细胞的长度，增强了转基因植株茎秆的抗拉强度，影响木材的发育，该蛋白PalFLA11的发现对于培育木材结构更加质密，木材材质更加坚硬和更抗病虫害，抗风沙的优良树木品种具有重要的理论及实践意义。
附图说明
此处应当说明的是附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1新疆杨PalFLAs基因家族的鉴定和系统发育树。
注：利用新疆杨PalFLAs基因家族的43个成员和拟南芥21个AtFLAs基因的氨基酸序列构建的ML(Maximum likelihood)树，bootstrap＝1000。
图2新疆杨PalFLA11基因组织表达模式和GUS染色。
注：(A)新疆杨PalFLA11基因组织表达模式；(B)新疆杨PalFLA11基因启动子序列GUS染色。
图3过表达载体pCXSN和pCXGUSP示意图注：A：pCXSN过表达载体示意图，35S::PalFLA11；B：pCXGUSP表达载体示意图，ProPalFLA11::GUS。
图4新疆杨基因PalFLA11过表达转基因新疆杨(Pal-OE)、敲除新疆杨(Pal-KO)和野生型新疆杨(WT)和茎秆抗拉强度测定注：A：不同处理方式的新疆杨情况，其中，野生型新疆杨(WT)，过表达转基因新疆杨(Pal-OE)、敲除新疆杨(Pal-KO)；B：茎秆抗拉强度测定
图5新疆杨基因PalFLA11过表达转基因新疆杨(Pal-OE)、敲除新疆杨(Pal-KO)和野生型新疆杨(WT)木材成分测定注：A：木质素含量的测定；B：纤维素含量的测定；C：半纤维素含量的测定，包括木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖；以上所有含量测定，每个株系取3个重复，每个重复至少测量3次，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图6新疆杨基因PalFLA11过表达转基因新疆杨(Pal-OE)、敲除新疆杨(Pal-KO)和野生型新疆杨(WT)茎组织切片和茎部木质部纤维细胞观察注：A：新疆杨茎石蜡切片横切面，红色双箭头表示木质部宽度，黑色短线表示比例尺200μm。B：茎部木质部纤维细胞观察，黑色短线表示比例尺1mm。C：木质部厚度统计结果，每个株系取3个重复，每个重复至少测量30次，*表示P<0.05，**表示P<0.01。D：纤维细胞长度统计结果。每个株系取3个重复，每个重复至少测量500个纤维细胞，**表示P<0.01。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为木本植物新疆杨(P.albavar.pyramidalis)，采自中国新疆，本实验室保存。
本发明所述的木本植物(woodyplant)是指根和茎因增粗生长形成大量的木质部，而细胞壁也多数木质化的坚固的植物。植物体木质部发达，茎坚硬，多年生。
实施例1新疆杨PalFLAs基因家族的鉴定及系统发育分析
我们首先用拟南芥的AtFLA1蛋白序列通过Blastp的方法在新疆杨蛋白序列数据库中比对查找FLA同源氨基酸序列，然后去掉冗余的基因并在Pfam和SMART数据库中分析了保守结构域，最终在新疆杨中鉴定出了43条FLAs基因序列，依次命名为PalFLA1-PalFLA43。为了进一步确定PalFLAs基因家族的系统发育关系，利用这43条新疆杨PalFLAs基因序列和21条拟南芥AtFLAs基因序列通过RAxML软件构建了ML系统发育树。结果表明，新疆杨PalFLAs基因家族成员聚为四个亚家族(I-Ⅳ)，并且新疆杨PalFLAs基因在第I亚家族中发生了明显的扩张，具体如图1所示。
实施例2新疆杨PalFLA11基因序列的克隆
利用RNA提取分离试剂Trizol，提取新疆杨叶片组织的总RNA，其具体方法是：称取新鲜的新疆杨叶片组织0.1g，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1ml Trizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中，室温放置10min；4℃，12000r/min离心10min，取上清到新的1.5ml离心管中；每使用1ml Trizol加0.2ml的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min；4℃，12000r/min离心15min，取上清到新的1.5ml离心管中，弃中下层；加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃，12000r/min离心10min沉淀RNA，弃上清；加入75％的乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃，12000r/min离心2min；晾干沉淀，溶解于50μL DEPC水，-80℃保存备用。
根据新疆杨因组(Ma et al.,2019)获取该PalFLA11基因的全长序列，然后利用Primer5.0软件，设计以下全长序列扩增引物：
上游引物F：5’-ATGAGAAAGCAACTCCTCTCCCCCT-3’
下游引物R：5’-TCATAGCTTCAATGAAATTGCTGCG-3’
通过反转录及PCR扩增获得PalFLA11基因序列，具体方法是：依据试剂盒PlantRT-PCR Kit 2.01(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl24μl；10×RNAPCRBuffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNase freeWater 8.5μl；dNTPMixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；Oligo dT-Adaptor 1μl)。混匀后，42℃30min；99℃5min；4℃5min，完成反转录反应。吸取1μl反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃5min后进入扩增程序，94℃50s，53℃50s 30min、72℃1min，38个循环后，72℃10min。经过上述流程，扩增得到PalFLA11基因的CDS序列，并且扩增得到的PalFLA11 CDS序列自起始密码子到终止密码子总长720个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例3新疆杨PalFLA11基因在不同组织中的表达模式分析
利用实施例2中的RNA提取方法，分别提取新疆杨不同组织：根、叶、木质部和韧皮部的总RNA，反转录成cDNA，然后利用Primer5.0软件，设计以下qRT-PCR引物：
上游引物F：5’-GGCGAGTTCCCGCTAAATG-3’
下游引物R：5’-TGCTGCCGCTGTACCAAAG-3’
具体方法是：依据试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，Japan)的用户手册进行。1μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(5×gDNAEraser Buffer 2.0μl，gDNAEraser 1.0μl，Total RNA 1μg，RNase Free dH2O up to10μl)。混匀后，42℃2min；4℃5min，完成第一步反转录反应。吸取10μl第一步反转录产物，再与剩余试剂混合(PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，5×PrimeScript Buffer 24.0μl，RNase Free dH2O 4.0μl)。混匀后，37℃15min；85℃5sec；4℃，完成qRT反转录反应。
将反转录产物作为模板，根据试剂盒TBPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseHPlus)进行qRT-PCR反应。具体方法是：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)10μl，PCR Forward Primer 1.0μl，PCR Reverse Primer 1.0μl，反转录产物1.0μl，灭菌水7.0μl。混匀后，Segment 1，95℃30sec，1Cycle；Segment 2，95℃5sec，60℃30sec，40Cycle；Segment 3，95℃1min，55℃30sec，95℃30sec，1Cycle，完成qRT-PCR反应。
qRT-PCR结果如图2A所示，新疆杨基因PalFLA11主要在木质部和根中高表达，表明基因PalFLA11基因在新疆杨木质部和木材发育过程中具有重要的作用。
实施例4新疆杨PalFLA11基因的启动子GUS染色
利用上游引物：5’-AGATTGTTTGGAAGCTAAACTAAT-3’和下游引物：5’-CGTTACAGGCTACGTAAGATTCTTG-3’克隆PalFLA11启动子序列(1500bp)，构建GUS表达载体：将PalFLA11基因的启动子片段通过酶切连接方法连接到pCXGUSP表达载体上(结构示意图如图3B所示)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L的卡那霉素筛选初步获得阳性克隆，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到融合GUS的表达载体ProPalFLA11::GUS和阳性菌株。提取融合GUS的质粒，转化农杆菌GV3101感受态中，经50mg/L的卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素初步筛选阳性克隆菌株，进一步挑取单克隆通过RCR扩增，测序验证，最终得到转化成功的GV3101农杆菌阳性菌株，用于侵染新疆杨。
农杆菌介导的叶盘转化法：将含ProPalFLA11::GUS质粒转化成功的GV3101阳性菌株在LB培养基中28℃200rpm培养至OD值约0.5左右，5000rpm离心10min收集菌体，在重悬液(10mM氯化镁，10mM MES，150μM乙酰丁香酮，PH＝5.6)中重悬后，重悬液黑暗培养3小时备用。取长势良好的新疆杨无菌组培苗叶片，在超净工作台中用无菌打孔器打成叶盘，将打好的叶盘放入黑暗培养后的重悬液中，浸泡10分钟，每隔2分钟摇晃一次。
转基因新疆杨不定芽的获得：取出上述步骤浸泡后的叶盘，放入愈伤诱导培养基中，暗培养10-15天，待愈伤组织长出后放入生芽培养基，培养2-3个月后诱导出不定芽，待不定芽长至1-2cm后从基部剪掉，接入生根培养基中。以上愈伤组织培养基，不定芽诱导培养基和不定根诱导培养基中均加入20mg/L的潮霉素进行筛选。
经过潮霉素筛选活下来的新疆杨幼苗按照前人的方法进行GUS染色(Wang etal.,2011)，野生型新疆杨WT作为对照，新疆杨幼苗能被GUS试剂染色的即为转基因阳性苗，和野生型新疆杨WT一样不能被GUS试剂染色的则为假阳性幼苗，直接舍弃。
GUS染色结果如图2B所示，新疆杨基因PalFLA11在叶、茎和根中均有表达，和qRT-PCR结果一致。
实施例5过表达新疆杨PalFLA11转基因新疆杨和PalFLA11基因敲除新疆杨的获得及阳性植株的鉴定
新疆杨PalFLA11基因过表达载体的构建：将测序验证过的实施例2得到的基因片段通过酶切连接方法连接到pCXSN二元表达载体上35S::PalFLA11(构建示意图如图3A所示)。利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，设计3个敲除靶点，根据前人方法构入pYLCRISPR/Cas9载体，转化农杆菌GV3101，侵染新疆杨。
转化农杆菌GV3101、农杆菌介导的叶盘转化法和转基因新疆杨不定芽的获得方法同实施例4中所述。
转基因新疆杨阳性植株的鉴定：上述步骤诱导产生的不定芽在生根培养基中培养1-2个月后，取叶片0.1g提取DNA，PCR扩增PalFLA11目的片段，测序验证。将验证好的阳性苗植株经过炼苗后移栽到土壤中，在光周期为16小时光照/8小时黑暗，25℃的温室中生长。
转基因新疆杨如图4A所示，获得的过表达PalFLA11转基因新疆杨，其外在表型与野生型新疆杨没有明显的变化；但基因PalFLA11敲除新疆杨茎秆出现明显的倒伏现象，进一步表明基因PalFLA11影响木材的发育。
野生型新疆杨WT的抗拉强度为8.43Mpa，过表达PalFLA11新疆杨OE的抗拉强度为11.38MPa，PalFLA11敲除新疆杨KO的抗拉强度为6.34MPa(图4B)，过表达PalFLA11新疆杨OE的抗拉强度显著增强，PalFLA11敲除新疆杨KO的抗拉强度显著降低。
实施例6过表达新疆杨PalFLA11转基因新疆杨的木材成分和抗拉强度测定
取苗龄为3个月，长势一致，由实施例5中获得的过表达PalFLA11转基因新疆杨、PalFLA11基因敲除新疆杨和野生型新疆杨茎秆在液氮中磨成粉末，用70％(v/v)乙醇、氯仿/甲醇(1:1v/v)和丙酮依次洗涤粉末制备成醇不溶物AIR(Alcohol-InsolubleResidue)。淀粉酶处理去除AIR中的淀粉，用水和丙酮清洗，45℃烘干测量木质素，纤维素和半纤维素含量。我们也通过拉力测试仪测定了苗龄为3个月，长势一致，由实施例5中获得的过表达PalFLA11转基因新疆杨、PalFLA11基因敲除新疆杨和野生型新疆杨茎秆的抗拉强度。
结果如图5所示，野生型新疆杨WT的木质素含量为97.03μg/mg，过表达PalFLA11新疆杨OE的木质素含量为86.76μg/mg，PalFLA11敲除新疆杨KO的木质素含量为92.47μg/mg(图5A)，过表达PalFLA11新疆杨OE的木质素含量显著降低；野生型新疆杨WT的纤维素含量为302.24μg/mg，过表达PalFLA11新疆杨OE的纤维素含量为521.55μg/mg，PalFLA11敲除新疆杨KO的纤维素含量为267.40μg/mg(图5B)，过表达PalFLA11新疆杨OE的纤维素含量显著升高，PalFLA11敲除新疆杨KO的纤维素含量降低；
野生型新疆杨WT的木糖含量为6.61μg/mg，过表达PalFLA11新疆杨OE的木糖含量为17.24μg/mg(图5C)，过表达PalFLA11新疆杨OE的木糖含量显著升高；野生型新疆杨WT的半乳糖含量为11.11μg/mg，过表达PalFLA11新疆杨OE的半乳糖含量为8.89μg/mg，PalFLA11敲除新疆杨KO的半乳糖含量为13.31μg/mg(图5C)，过表达PalFLA11新疆杨OE的半乳糖含量显著降低，敲除新疆杨KO的半乳糖含量显著升高；甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖在野生型新疆杨WT、过表达PalFLA11新疆杨OE和PalFLA11敲除新疆杨KO中无显著变化。结果表明，过表达PalFLA11新疆杨显著提高了纤维素和木糖的含量，降低了木质素和半乳糖的含量，并且显著增强了茎秆的抗拉强度。
通过上述的实施例我们可以得出，基因PalFLA11主要通过调控新疆杨的各种木材组分的生物合成，进而影响木材的发育，而新疆杨属于典型的木本植物。因此，发明人推断除了新疆杨和新疆杨之外，基因PalFLA11对其他具有木质部的木本植物均具有影响木材发育的作用，可以将基因PalFLA11通过基因工程的方法转化到其他木本植物中，也可以影响其他木本植物的木材发育。
实施例7过表达新疆杨PalFLA11转基因新疆杨茎组织化学观察
石蜡切片：新疆杨茎段切成0.5cm左右，浸泡在FAA固定液(70％乙醇：乙酸：福尔马林甲醛溶液＝90:5:5)中，4℃固定24h以上。70％、85％、95％乙醇逐级脱水各1h；无水乙醇30min，2次；无水乙醇/二甲苯1:1，1h；二甲苯，1h，二甲苯/石蜡1：1，2h；石蜡I，4h；石蜡II，过夜。将茎段取出于包埋框包埋，保存于4℃。修好的蜡块在切片机(Leica RM2235)上切10μm厚蜡带，固定于载玻片，42℃烘片4h以上。
木质部纤维细胞解离及番红染色：选取2cm左右茎段放入EP管中，加入1.5ml的冰醋酸/双氧水按1:1(V:V)混合均匀，于80℃水浴6h以上。待木质部细胞完全解离后，1000rpm离心1min，弃上清，蒸馏水洗涤3次，1％番红染色，显微镜观察，拍照。
甲苯胺蓝染色：将制备好的切片于0.1％的甲苯胺蓝溶液中染色10-15min，清水洗去浮色，37℃烘箱烘干。二甲苯中脱蜡2次，每次10-20min。中性树胶封藏，显微镜观察，拍照。
结果如图6所示，过表达PalFLA11新疆杨显著增厚了木质部厚度(图6A，6C)和木质部木纤维细胞长度(图6B，6D)。有助于增强新疆杨茎的抗拉强度，使木材材质更加质密坚硬。
综上所述，本发明提供了一种改良植物性状的蛋白PalFLA11，氨基酸序列如SEQID NO.2所示，能显著提高转基因植株的纤维素和木糖含量，增厚了木质部厚度，增长了木质部木纤维细胞的长度，增强了转基因植株茎秆的抗拉强度，影响木材的发育，该蛋白PalFLA11的发现对于培育木材结构更加质密，木材材质更加坚硬和更抗病虫害，抗风沙的优良树木品种具有重要的理论及实践意义。
Claims (10)
1.一种改良植物性状的蛋白PalFLA11，其特征在于，所述的蛋白PalFLA11是如下S1)、S2)或S3)所示的蛋白质：
S1)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白PalFLA11；
S2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
S3)在S1)或S2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.一种生物材料，其特征在于，所述的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码蛋白PalFLA11的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述的表达载体为双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体。
4.蛋白PalFLA11在如下(1)-(8)任一种的应用：
(1)提高纤维素的含量；
(2)提高木糖的含量；
(3)降低半乳糖的含量；
(4)降低木质素含量；
(5)增厚木质部厚度；
(6)增长木质部木纤维细胞长度；
(7)增强植物茎秆的抗拉强度；
(8)植物育种；
所述的蛋白PalFLA11为如下S1)、S2)或S3)：
S1)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白PalFLA11；
S2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
S3)在S1)或S2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物为木本植物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的木本植物选自新疆杨、金合欢树、桉树、角树、山毛榉、桃花心木、胡桃树、橡树、白蜡树、柳树、山胡桃树、桦树、栗树、杨树、赤杨、山杨、枫树、悬铃木、银杏树、棕榈树、枫香树、柏树、道格拉斯冷杉、冷杉、红杉、铁杉、雪松、杜松、落叶松、松树、红杉、云杉和紫杉中的一种或几种。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述育种的目的为选育植物性状优良的植物。
8.一种改良植物性状的方法，包括：提高受体植物中权利要求1中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的活性和/或含量，或，促进权利要求1中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比植物性状改良的目的植物。
9.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，包括提高受体植物中权利要求1中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的活性和/或含量，或，促进权利要求1中所述改良植物性状的蛋白PalFLA11的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比植物性状改良的目的植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的转基因植物区别于所述的受体植物分别体现在如下(1)-(7)：
(1)转基因植物的纤维素含量高于受体植物；
(2)转基因植物的木糖含量高于受体植物；
(3)转基因植物的半乳糖含量低于受体植物；
(4)转基因植物的木质素含量低于受体植物；
(5)转基因植物的木质部厚度厚于受体植物；
(6)转基因植物的木质部木纤维细胞长度长于受体植物；
(7)转基因植物的茎秆抗拉强度强于受体植物。
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