CN116855528A - 一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用，涉及植物基因工程技术领域，LoZAT12基因为东方百合‘西伯利亚’锌指蛋白类转录因子基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述LoZAT12基因编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述LoZAT12基因的3’端非翻译区(3’‑UTR)序列如SEQ ID NO.3所示。LoZAT12基因在调控百合花朵衰老中的应用，包括如下步骤：(1)LoZAT12的表达模式分析；(2)LoZAT12基因的全长和3’‑UTR克隆；(3)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时沉默；(4)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时过表达；(5)LoZAT12基因在拟南芥中的稳定过表达。本发明突破了传统育种手段的障碍，为百合花朵衰老调控提供了重要的基因工程的方法。

Description

一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种从东方百合‘西伯利亚’(Lilium oriental hybrid‘Siberia’)中分离、克隆的一个锌指蛋白(Zinc finger)类转录因子基因LoZAT12，还涉及LoZAT12基因在调控百合花朵衰老中的应用。
背景技术
百合(Lilium spp.)为百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生球根花卉，是世界上经济价值较高的单子叶鳞茎植物之一(Bakhshaie et al.,2016)，在国际鲜切花市场上占有突出地位，因其优雅外观和迷人香味成为世界广受欢迎的花卉种类(Shi et al.,2018)。百合花作为一种重要的园艺作物和观赏植物，因其花色、图案、形状和香味的多样性而受到消费者的青睐(Gong et al.,2014；Yuan et al.,2021)。在世界花卉贸易中，切花是重要组成部分，其贸易额达到550亿美元(Mwangi,2019)。在我国，2015年百合鲜切花种植面积达到8,823.85公顷，切花产量14.31亿支，销售额35.00亿元，其中销售额排在主要切花种类第一位(农业部统计数据)。由于产销两地分离，鲜切花长期存在长时间、远距离运输的难题，然而大多数切花不耐贮运，在我国，切花采后损耗通常高达20％，造成巨额的经济损失(杨明珊等，2020)。鉴于百合较高的观赏价值和经济价值，人们投入了大量精力，致力于研究栽培和采后保鲜技术对百合花朵衰老的调控，以延缓它的衰老(Aziz et al.,2020；Zhouet al.,2023)，然而其深入的作用机制还不明确。
根据形成原因的不同，植物的衰老可分为自发型和诱导型。自发型衰老受植物自身遗传调控，即在植物正常衰老生长过程中，年老的叶片中细胞丧失分裂能力，仅存的细胞逐渐老化，无法应对逐渐积累的有毒有害物质，因而启动衰老进程，将分解的养分输送到其他幼叶或果实中，从而实现物质的高效循环利用(Woo et al.,2019)。诱导型衰老是指高温、干旱和病虫害等环境胁迫下，植物加速衰老进程，通过牺牲老叶来保护幼嫩的新叶和果实，这有助于提高植物对环境的适应性(Luo et al.,2021)，植物利用这一机制巧妙地实现了生长和逆境响应之间的平衡(Zhang et al.,2019)。
在花朵开放后期，衰老表现为花瓣的萎蔫(Horibe and Makita,2019)、脱落(Liang et al.,2020)或褪色(Teppabut et al.,2018)，微观层面表现为细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)。在植物细胞的衰老过程中，有上百个衰老相关基因(Senescence-associated gene,SAG)协同参与了这一过程的调节。SAG基因是一类统称，编码的蛋白包括NAC、WRKY、MYB等转录因子、PP2C磷酸酶、蛋白酶、核酸酶等，它们从转录调控、转录后调控和生物大分子降解等多个层面共同构成复杂的植物衰老调控网络(Guo etal.,2021)。
转录因子是基因转录调控的主开关，有广泛报道表明，NAC、WRKY、Zinc finger、MYB、bHLH和AP2等转录因子参与了植物衰老过程的调节(Xu et al.,2021；Chen et al.,2022；Negi et al.,2023)。转录因子基因的转录可能受上游转录因子的调控(Li et al.,2023)或表观调控(Li et al.,2022)，在转录后受到miRNA的调控(Baulies et al.,2022)；蛋白水平上，在蛋白酶和E3泛素连接酶的作用下发生降解(Marchingo and Cantrell,2022)，在激酶/磷酸酶的作用下呈现激活/失活的状态(Wu etal.,2022b)，多方面协同作用下处于相对平衡的稳态。在转录因子的参与下，下游进一步影响到活性氧的水平(Meng etal.,2022)、叶绿素降解(Luo et al.,2022)和核酸降解(Chen et al.,2022b)等过程，从多个方面共同调控了植物的衰老。
已报道的棉花(Gossypium hirsutum)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中锌指蛋白类ZAT基因主要参与非生物逆境的响应(Chen et al.,2021；Fan et al.,2021；Rehmanet al.,2021)。本发明申请人鉴定了百合中首个锌指蛋白基因LoZAT12。LoZAT12过表达后显著促进百合花朵的衰老和拟南芥叶片的衰老，沉默后延缓百合花朵的衰老，并且在LoZAT12过表达样本中，水杨酸合成基因AIM1、EDS5和ICS1、脱落酸合成基因NCED1和病程相关基因PR4.1等都受到显著诱导，暗示LoZAT12基因从多个方面协同调控了百合花朵的衰老。
鉴于花朵衰老过程中调控网络的复杂性，深入了解百合花朵衰老过程中调节机制，筛选和鉴定关键调控基因，进一步通过分子育种和外源激素处理来延缓百合切花的衰老具有重要理论价值和应用价值。在花卉分子育种方面，前人通过将蝴蝶豌豆(Clitoriaternatea)中的A3’5’GT基因和风铃草(Campanula medium)中的F3’5’H基因转入菊花(Chrysanthemummorifolium)，培育出转基因蓝色菊花(Noda et al.,2017)。
然而鉴定的百合中首个调控花朵衰老的锌指蛋白基因LoZAT12还未见报道，为此，本发明提供一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用，其未来有望利用基因工程在百合中进行LoZAT12基因的干涉或敲除，这将在延缓百合花朵衰老方面有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因及应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因，所述LoZAT12基因为东方百合‘西伯利亚’锌指蛋白类转录因子基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述LoZAT12基因编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述LoZAT12基因的3’端非翻译区(3’-UTR)序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种LoZAT12基因在调控百合花朵衰老中的应用，包括如下步骤：
(1)LoZAT12的表达模式分析；
(2)LoZAT12基因的全长和3’-UTR克隆；
(3)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时沉默；
(4)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时过表达；
(5)LoZAT12基因在拟南芥中的稳定过表达。
与现有技术相比，本方案的有益效果：
1、本发明的方案利用转基因技术为延缓花朵衰老提供了重要的基因工程方法，且突破了传统育种手段的障碍；
2、本发明方案中的基因在拟南芥中性状稳定，能够为花朵衰老分子机制研究提供理论依据。
附图说明
图1为本发明的技术流程图；
图2为本发明的LoZAT12基因在不同组织部位中(A)和不同开放阶段(B)的表达分析；
图3为本发明的LoZAT12基因在ABA和SA处理后基因表达，其中(A)为ABA和SA处理百合花朵，(B)为ABA和SA处理百合花被圆片，(C)为ABA和SA处理百合花朵瓶插寿命，(D)为ABA处理百合花朵中ZAT基因的表达分析，(E)为SA处理百合花朵中ZAT基因的表达分析；
图4为本发明的LoZAT12基因在GA3处理后基因表达，其中(A-D)为GA3处理百合花朵的表型变化(A)、离子渗透率(B)、H2O2含量(C)和瓶插寿命(D)，(E)为GA3处理百合花朵中ZAT基因的表达分析；
图5为本发明的LoZAT12基因的系统进化分析图，其中使用LoZAT12的蛋白序列和129个同源蛋白序列进行系统进化分析，基于序列相似度，将130个ZAT蛋白聚为6个类群；
图6为本发明的LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时沉默，其中(A-E)为pTRV2和pTRV2-LoZAT12处理的百合花朵的表型观察(A)、LoZAT12基因的表达分析(B)、MDA含量测定(C)、离子渗透率(D)和H2O2含量(E)；
图7为本发明的pSuper1300-LoZAT12表达载体的构建图谱；
图8为本发明的LoZAT12在百合花朵中的瞬时过表达，其中(A)为GFP荧光观察，各组内上排为GFP荧光图，下排为同视角明场，每个处理各3个重复，(B)为表型图，(C)为离子渗透率，(D)为H2O2含量；
图9为本发明的LoZAT12过表达百合花朵样本中基因表达量分析，其中(A)为LoZAT12的表达量，(B)为SA合成相关基因的表达量，(C)为ABA合成和受体基因，(D)为PR基因的表达量，(E)为SAG基因的表达量；
图10为本发明的LoZAT12在拟南芥中的过表达，其中(A-E)为pSuper1300和pSuper1300-LoZAT12转基因拟南芥的表型观察(A)、LoZAT12基因的表达分析(B)、叶绿素含量测定(C)、离子渗透率(D)和H2O2含量(E)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实施例1LoZAT12基因的表达模式分析
(1)LoZAT12基因的筛选
以东方百合‘西伯利亚’为试验材料，使用热硼法(Ma et al.,2006)提取花被片RNA，使用全式金反转录试剂盒(货号：AE311-03)合成cDNA，方法参考试剂盒说明书。
基于已完成的东方百合‘西伯利亚’二代+三代转录组测序(Luo etal.,2021)，在差异表达基因中有143个C2H2型锌指蛋白基因，进一步从C2H2型锌指蛋白中找了11个在花朵衰老后期高表达的ZAT基因(表1)。
表1 11个ZAT基因在百合花朵开放四个不同时期的基因表达水平
(2)荧光定量PCR检测LoZAT12基因的表达
基于二代+三代转录组测序获得的11个ZAT基因序列，用Primer Premier 5软件设计特异引物(表2)，用于进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)。
表2 11个ZAT基因的荧光定量PCR引物
参考前人对百合中基因表达的研究，使用LoActin基因作为内参基因，引物序列为：
LoActin qRT F：5'-GGTTGGGATGGGTCAGAAAG-3'
LoActin qRT R：5'-TGTACGACCACTGGCATACAGG-3'
通过qRT-PCR分析ZAT基因表达，模板为东方百合‘西伯利亚’花朵正常开放不同阶段(花苞期S1、初开期S2、盛开期S3、衰老期S4)和盛花期不同组织部位(根、茎、叶、花、衰老叶片)。使用艾德莱的2×SYBR Green qPCR Mix试剂(货号：PC3302)检测11个ZAT基因的表达，实时荧光定量PCR反应在罗氏96PCR仪中进行。
荧光定量PCR扩增条件见表3。使用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)进行数据的处理。
表3荧光定量PCR扩增条件
结果表明，随着开花进程的推进，11个ZAT基因均在百合花朵和衰老的叶片中具有较高的表达水平(图2A)，并在百合花朵开放S4衰老期表达水平急剧上升(图2B)。均表明ZAT基因在百合花被片衰老过程中受到明显诱导。
激素在花朵衰老过程中发挥了重要的调节作用。使用100mg/L的ABA和200mg/L的SA对百合S3级(盛开期)的花朵进行处理。结果表明，ABA和SA处理均明显加速百合花朵的衰老，对照在处理4d后可见轻微的衰老，而ABA和SA处理2d即可见明显的衰老变化，处理4d后衰老非常明显，并且ABA比SA的衰老更明显，瓶插寿命更短(图3A-C)。通过qRT-PCR对ABA和SA处理样本进行11个ZAT基因的表达量分析，结果表明多个ZAT基因的表达明显受到ABA和SA的诱导(图3D-E)。
使用50、100、150、200mg/L的GA3对百合S3级的花被片进行处理。结果表明，GA3处理均显著延缓百合花朵的衰老，对照在处理8d后衰老，而GA3处理后的花朵瓶插寿命比对照明显延缓了约2-3d，50mg/LGA3处理样本在12d才衰老，而且花被片开始脱落(图4A,D)，离子渗透率和H2O2含量也明显降低(图4B,C)，综合来看，50mg/L GA3效果较好。进一步对50mg/LGA3处理24h后的百合花被片样本中的ZAT基因进行qRT-PCR分析，结果表明11个ZAT基因的表达均明显受到GA3的显著下调(图4E)。
实施例2分离LoZAT12基因
(1)LoZAT12(ZAT6)基因全长的克隆
以东方百合‘西伯利亚’为试验材料，使用热硼法(Ma et al.,2006)提取花瓣RNA，使用全式金反转录试剂盒(货号：AE311-03)合成cDNA，方法参考试剂盒说明书。
基于11个ZAT基因的表达模式分析，选择在衰老的花朵和叶片中表达水平较高的ZAT6基因作为候选基因。以二代+三代转录组测序获得的ZAT6(i0_LQ_lily14_c12733/f1p0/571)基因片段为参考序列，使用Primer premier 5.0软件设计特异引物：
ZAT6 ORF F：5’-ATGAAGAGATTCAGATTTGGAGAAAAAG-3’
ZAT6 ORF R：5'-CTAATCCAGCGGAGGAAAGTTC-3'
以东方百合‘西伯利亚’衰老期花朵的cDNA为模板，用金牌mix(擎科生物，货号：TSE101)进行PCR扩增，PCR反应体系见表4。
表4 PCR反应体系
PCR扩增条件见表5。
表5 PCR扩增条件
将扩增得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，使用全式金胶回收试剂盒(货号：EG101-01)回收目标条带，方法参考试剂盒说明书。将回收的PCR产物连入TOPO克隆载体(货号：C5852-50)，并转化大肠杆菌感受态，通过PCR筛选阳性克隆并测序，获得了ZAT6基因全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，长度411bp，编码了136个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。将ZAT6的蛋白序列提交到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)中进行Protein Blast分析，查找到129个同源蛋白的序列。使用ClustalX 1.83对ZAT6及其129个同源蛋白进行系统进化分析，将比对结果文件上传到Chiplot在线分析网站(https://www.chiplot.online/)进行可视化分析。根据系统进化树比对结果显示，‘西伯利亚’百合中ZAT6与莎草科康藏嵩草(Carex littledalei)中ZAT12-like(accession NO.KAF3331667.1)、石刁柏(Asparagus officinalis)中ZAT12-like(accession NO.XP_020275551.1)和香蕉(Musa acuminata)中ZAT12-like(accessionNO.XP_009402337.1)等多个ZAT12蛋白序列相似度较高，因此将‘西伯利亚’百合的ZAT6基因命名为LoZAT12(图5)。
(2)LoZAT12基因3’-UTR的克隆
以二代+三代转录组测序获得的LoZAT12(i0_LQ_lily14_c12733/f1p0/571)基因片段为参考序列，使用Primer premier 5.0软件设计特异引物，扩增LoZAT12的3’非翻译区(3’-UTR)序列。
LoZAT123’-UTRF：5’-AGAAATCTGAGGTTGGGAAGATG-3’
LoZAT123’-UTR R：5’-TCCTCCTGTAATTTGCGTCATG-3’
以东方百合‘西伯利亚’衰老期花朵的cDNA为模板，用金牌mix(擎科生物，货号：TSE101)进行PCR扩增。扩增体系和条件见表4和表5。
经过测序验证，从东方百合‘西伯利亚’中克隆得到442bp的LoZAT123’-UTR序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
实施例3LoZAT12在百合花朵中的瞬时沉默
(1)LoZAT12沉默载体的构建
为了验证LoZAT12在百合花朵衰老过程中的功能，使用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术，通过烟草脆裂病毒(Tobacco rattlevirus,TRV)的介导，在百合花被片中进行LoZAT12的瞬时沉默。在pTRV2载体的多克隆位点(Multiple Cloning Sites,MCS)区域进行酶切位点分析，选择EcoR I和Kpn I两个酶切位点用于载体的构建。
基于从东方百合‘西伯利亚’中克隆得到的442bp的LoZAT123’-UTR序列设计重组引物，上游带酶切位点和15bp的重组位点。
LoZAT12 VIGS F(+EcoR I)：
5’-gtgagtaaggttaccGAATTCGAAATCTGAGGTTGGGAAGATG-3’
LoZAT12 VIGS R(+Kpn I)：
5’-gagacgcgtgagctcGGTACCTCCTCCTGTAATTTGCGTCATG-3’
用重组引物扩增带重组位点的LoZAT123’-UTR。
通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，使用胶回收试剂盒回收目标条带。
用限制性内切酶EcoR I和Kpn I对病毒载体pTRV2进行酶切过夜，分离和回收目标条带，酶切体系见表6。
表6酶切体系
使用诺唯赞的同源重组试剂盒(货号：C112-01)对LoZAT12的3’-UTR和pTRV2载体酶切产物进行重组反应，方法参考试剂盒说明书。
(2)TRV2-LoZAT12转化百合花被片
使用冻融法将pTRV1、pTRV2、pTRV2-LoZAT12三种质粒分别转化农杆菌GV3101感受态，涂布在含有终浓度为50mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板上，28℃培养箱中倒置培养48h；
在超净工作台中挑单菌落摇一次菌，经过PCR检测阳性后，在500mL三角瓶中加100mL LB培养基，其中含2-吗啉乙磺酸(MES，终浓度10mmol/L)、乙酰丁香酮(AS，终浓度20μmol/L)和Kan(终浓度50mg/L)，并加入100μL一次菌，在28℃摇床上以200r/min转速二次摇菌过夜；
5000r/min离心10min集菌；
配制侵染液，其中含MES(终浓度10mmol/L)、MgCl2(终浓度10mmol/L)、AS(终浓度25μmol/L)，调pH至5.6；
用侵染液将菌块打散，用分光光度计测量菌液浓度，调节OD600nm＝1.0，使pTRV1、pTRV2、pTRV2-LoZAT12三种菌液OD值相近，随后分别按1:1比例混合pTRV1与pTRV2以及pTRV1与pTRV2-LoZAT12的菌液,得到两种混合菌液，暗处静置4h；
从附近的花卉市场购买新鲜的百合‘西伯利亚’切花，1h内运到实验室，将花枝基部浸泡在去离子水中，用锋利的枝剪在水中剪掉基部部分茎段，保留40cm长茎段，备用。
选取开放状态一致的初开期(S2)百合花朵，用1mL注射器，去掉针头后进行注射。用针头在百合花被片背面轻轻划破一个小伤口，然后注射菌液，操作过程小心细致，避免对花朵造成较大损伤，注射后将侵染区域进行标记，23℃暗培养3d后记为0d，在体式荧光显微镜下观察GFP荧光，分别在0d和2d时拍照进行表型观测和取样进行生理指标测定和RNA提取。
如图6所示，0d和2d时，LoZAT12沉默处理和pTRV2空载处理在表型上无明显差异，在4d时，pTRV2处理的百合花被片已经出现了明显的衰老，而pTRV2-LoZAT12沉默花被片只有轻微衰老的迹象，可见衰老速度明显慢于pTRV2对照组(图6A)。通过qRT-PCR测定该基因沉默后的转录水平，结果表明，在处理0d、2d和4d时，LoZAT12沉默样本中的LoZAT12基因表达量较对照样本显著下降(图6B)。丙二醛(MDA)含量、离子渗透率和H2O2含量等生理指标测定结果(图6C-E)也显示，LoZAT12沉默样本的衰老显著慢于对照组。以上结果说明LoZAT12沉默后显著延缓了百合花朵的衰老。
实施例4LoZAT12在百合花朵中的瞬时过表达
(1)LoZAT12过表达载体的构建
所使用的过表达载体为pSuper1300，由pCAMBIA1300载体改造而来。在pSuper1300载体中，将驱动目的基因表达的35S启动子替换成表达活性更强的Super启动子，并且在多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS)区后面插入了绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein,GFP)，用于监测目的基因的正确表达和定位。为保证目的基因后面的GFP能正确翻译，不产生移码错误，在MCS区选取Sal I和Kpn I两个酶切位点对载体进行双酶切，酶切体系见表6。
基于LoZAT12基因的编码区(Open Reading Frame,ORF)序列和pSuper1300载体序列，设计带重组位点的LoZAT12全长引物(去掉终止密码子)，序列如下：
pSuper-LoZAT12-F：
5’-ctgcaggggcccgggGTCGACATGAAGAGATTCAGATTTGGAG-3’
pSuper-LoZAT12-R：
5’-gcccttgctcaccatGGTACCATCCAGCGGAGGAAAGTTC-3’
用重组引物扩增带重组位点的LoZAT12的全长序列。
通过琼脂糖凝胶电泳分离目标条带，使用胶回收试剂盒回收目标条带。
使用诺唯赞的同源重组试剂盒(货号：C112-01)对带重组位点的LoZAT12全长和pSuper1300载体酶切产物进行重组反应，方法参考试剂盒说明书。
将重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于LB+卡那霉素(Kanamycin,Kan)平板，在37℃培养箱中倒置培养15-16h；
从菌板上挑取阳性菌摇菌，经过PCR阳性检测和测序验证，获得构建成功的pSuper1300-LoZAT12载体(图7)。
(2)pSuper1300-LoZAT12转化百合花朵
使用冻融法将pSuper1300、pSuper1300-LoZAT12质粒转化农杆菌GV3101感受态，涂布在LB+kan的平板上，28℃培养箱中倒置培养48h；
挑单菌落摇一次菌并进行阳检，使用的检测引物为：
SuperF：5'-GGATAAATAGCCTTGCTTCC-3'
GFP R：5'-GAACTTGTGGCCGTTTACG-3'
pSuper-LoZAT12-F：
5’-ctgcaggggcccgggGTCGACATGAAGAGATTCAGATTTGGAG-3’
pSuper-LoZAT12-R：
5’-gcccttgctcaccatGGTACCATCCAGCGGAGGAAAGTTC-3’
选取检测阳性的农杆菌，取200μL菌液加入到200mL新鲜的LB液体培养基中(50mg/L Kan+10mmol/L MES+20μmol/L AS)中，于28℃，200r/min摇床过夜培养。
将菌液转入50mL离心管中，5000r/min离心7min，弃上清收集菌体，加入侵染液(10mmol/L MES，10mmol/L MgCl2，25μmol/LAS，pH＝5.6)重悬菌体，调节OD600nm＝0.5。混匀后黑暗静置4h后进行侵染。
参照实施例3，进行百合‘西伯利亚’切花的处理和花朵的侵染。
如图8A所示，侵染后的百合花被片中都表现出不同程度的GFP荧光，且LoZAT12瞬时过表达样本较pSuper1300空载样本呈现出较亮的荧光，而未侵染的圆片几乎没有荧光。从LoZAT12基因在百合花被片中瞬时过表达的结果来看，2d时的pSuper1300载体对照样本的花被片开始出现出轻微的衰老，而LoZAT12 OE样本的花被片已发生较严重的衰老(图8B)。离子渗透率和H2O2含量的测定结果也表明LoZAT12 OE样本中的细胞膜系统损伤更为严重(图8C-D)。综上所述，LoZAT12基因过表达后促进了‘西伯利亚’百合花朵的衰老。
进一步通过qRT-PCR检测了pSuper1300空载和pSuper1300-LoZAT12过表达样本中LoZAT12基因和SA合成、ABA合成等相关基因的表达。与对照相比，LoZAT12基因在衰老的百合花被片中的表达量显著增加，上调了45倍(图9A)。通过课题组前期研究发现，SA在百合花朵衰老过程中含量急剧上升，ABA也呈现先降低后升高的趋势，在衰老时期显著上升，为了解LoZAT12过表达后是否会影响到SA和ABA的合成，进一步通过qRT-PCR对LoZAT12过表达样本中5个SA合成相关基因、8个ABA合成相关基因、7个病程相关基因(Pathogenesis-relatedgene,PR)和11个SAG基因的表达量进行分析。结果表明，与空载对照相比，SA合成关键基因AIM1、EDS5、ICS1、PAL2(图9B)，ABA合成关键基因NCED1(图9C)，PR4.1在过表达样本中的表达显著上调(图9D)，SAG基因中，SAG2、SAG7、SAG8、SAG9和SAG11的表达都受到了显著诱导(图9E)。
实施例5LoZAT12在拟南芥中的过表达
(1)拟南芥的侵染
将构建好的过表达载体pSuper1300-LoZAT12和空载pSuper1300农杆菌在LB固体培养基(50mg/L Kan)上划线活化，28℃培养2d。用牙签沾取少量农杆菌菌液在LB+Kan(50mg/L)培养皿上划线，28℃培养2d，获得单克隆菌落，置于600μL LB+Kan(50mg/L)液体培养基中，200r/min，28℃摇床，避光过夜培养，进行菌液PCR阳性检测。
取200μL菌液加入到200mL LB+Kan(50mg/L)液体培养基中，于200r/min，28℃摇床过夜培养，直到菌液OD600nm值为2左右。
将菌液转入50mL离心管中，5000r/min，7min，弃上清，用5％蔗糖和0.02％的活性剂Silwet L-77溶液重悬菌体，使菌液OD600nm＝0.8，混匀后黑暗静置1-2h。提前准备野生型拟南芥幼苗。拟南芥培养环境条件如下：恒温20～25℃，光暗周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100mol m-2s-1，相对湿度为80％。第一次侵染时将长势好的拟南芥提前一天充分浇水，使得气孔充分张开。选取5～6周抽薹拟南芥，剪去果荚和全开放花序，只保留露白花序。将整株花序浸泡在侵染液中30s，将侵染后的拟南芥室温避光黑暗培养24h后正常光照培养，隔一周后侵染一次，一共侵染3次。将侵染完成的拟南芥放置于生长室生长，花序长高后立上支柱进行固定防止倒伏，成熟后收集转基因拟南芥T0代种子装入离心管中并加入适量干燥剂。
(2)转基因拟南芥阳性苗的筛选
将收集的T0代种子置于2mL离心管中，加入1mL消毒液(无菌水含6％NaClO)，震荡混匀10min后倒掉上清，用无菌水清洗5-6次直至透明，用1mL枪头将种子均匀分散铺于含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，等吹干水分后封膜。用黑色塑料袋包裹培养皿，倒置放于4℃黑暗春化3d后，置于光照生长室生长10d左右。
将子叶为绿色、根部较长的阳性苗移栽至土里。培养土通常为基质土加蛭石混合，转移前充分润湿培养土，枪头做预制孔，镊子轻轻转移。用旁土覆盖根系，在培养土表面喷水后盖上盖子，待幼苗长一周左右再取下盖子。直至植株长大收种。
筛选至第三代纯合株系进行表型观测和生理指标测定等后续实验。
待转基因拟南芥T3代植株长大后，进行形态观察、衰老相关生理指标测定和基因表达量的检测。与pSuper1300空载对照相比，LoZAT12转基因株系在第30d都表现出叶片早衰，而且第四和第五莲座叶端开始变黄，而pSuper1300的同期叶仍然是绿色的，这些叶子的变黄在LoZAT12OE转基因株系中迅速发展，并且它们中的大多数在37d后完全变黄，在这个阶段，pSuper1300株系仅叶子的尖端发生微弱变黄。该结果显示拟南芥衰老症状通常始于莲座丛的顶端和外缘(图10A)。在pSuper1300空载和转基因株系样本中通过qRT-PCR和半定量进行LoZAT12基因的检测，发现其表达量有很大程度的上调(图10B)。叶绿素含量测定证实了表型观测，显示与pSuper1300空载对照植株相比，LoZAT12过表达拟南芥转基因株系的叶绿素含量显著降低(图10C)。此外，也对拟南芥过表达株系中的离子渗透率和H2O2含量进行测定，发现其细胞膜系统损伤更严重(图10D-E)。以上结果均表明，过表达LoZAT12显著促进了拟南芥的衰老。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (2)

1.一种调控百合花朵衰老的LoZAT12基因，其特征是：所述LoZAT12基因为东方百合‘西伯利亚’锌指蛋白类转录因子基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述LoZAT12基因编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述LoZAT12基因的3’端非翻译区(3’-UTR)序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的LoZAT12基因在调控百合花朵衰老中的应用，其特征是：包括如下步骤：
(1)LoZAT12的表达模式分析；
(2)LoZAT12基因的全长和3’-UTR克隆；
(3)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时沉默；
(4)LoZAT12基因在百合花朵中的瞬时过表达；
(5)LoZAT12基因在拟南芥中的稳定过表达。
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