CN112931213A

CN112931213A - 一种杨树外植体脱毒试剂、脱毒方法及应用

Info

Publication number: CN112931213A
Application number: CN202110332124.XA
Authority: CN
Inventors: 陈肃; 于越; 刘智杰
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN112931213B

Abstract

本发明公开了一种杨树外植体脱毒试剂、脱毒方法及应用，属于林木遗传育种技术领域。所述脱毒试剂，包括：75％乙醇和100‑200mg/L头孢霉素溶液，采用两种试剂对所述杨树外植体进行交替处理。还具体公开了利用所述脱毒试剂进行杨树外植体脱毒的具体方法，通过该方法仅利用浓度为75％的乙醇和头孢霉素即可完成脱毒处理，简单易行，可以有效解决杨树扦插苗表面寄生细菌难以清除的难题，更快速的完成大量杨树外植体脱毒工作，节约时间和人力，此外，经过该方法脱毒处理的外植体有较强的生根性能，可为杨树无性繁殖和组织培养提供新的工作方法和育种材料。

Description

一种杨树外植体脱毒试剂、脱毒方法及应用

技术领域

本发明涉及林木遗传育种技术领域，涉及一种杨树外植体脱毒试剂、脱毒方法及应用。

背景技术

山新杨品种是以山杨为母本，新疆杨为父本，经过20多年的杂交组合得到的后代性状稳定的多倍体杨树。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，果序自然脱落不飞絮。该品种与对照品种新疆杨比较，适应性更强，抗逆性更好，耐低温，在北方大部分地区种植时无冻害发生。山新杨生根能力较差，常规扦插成活率低，扦插苗表面和内部寄生各种细菌及真菌。常规的杨树外植体脱毒方式主要使用叶片或茎尖作为外植体进行脱菌消毒处理，主要步骤包括灭菌、浸泡、冲洗、筛选、组织培养，操作过程繁琐，费时费力，可能因为操作不当导致消毒效果不彻底，出现外植体污染，污染率过高等情况。另外，常规外植体脱毒过程中使用消毒剂会破坏植物组织，增加成本，生根率也较差，很难大规模应用到后续移栽中。鉴于目前常规杨树外植体脱毒方法存在的各种问题，亟需一种简单易行并且能够解决上述技术问题的新的脱毒方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种杨树外植体脱毒试剂、脱毒方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，改变常规杨树外植体脱毒方法过程繁琐的缺陷，该方法减少外植体因实验操作和消毒剂造成的植物组织损伤，简单易行，可大大提高外植体脱菌效率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明一种杨树外植体脱毒试剂，包括：75％乙醇和100-200mg/L头孢霉素溶液，采用两种试剂对所述杨树外植体进行交替处理。

本发明还提供一种杨树外植体脱毒方法，包括用所述的杨树外植体脱毒试剂进行脱毒，具体包括以下步骤：

1)将杨树外植体用75％乙醇进行喷洒处理，再用100-200mg/L头孢霉素溶液进行浸泡处理；

2)经步骤1)浸泡处理后的杨树外植体用无菌水冲洗两次或两次以上，吸干杨树外植体表面水分后再用75％乙醇和100-200mg/L头孢霉素溶液依次进行浸泡处理，吸干水分后即完成杨树外植体消毒处理；

3)消毒处理完成后的杨树外植体，插入生根培养基，于25-30℃，黑暗和光照交替条件下进行培养，至长出良好根系；

4)从步骤3)长出良好根系的消毒外植体上剪下处于发育阶段的腋芽，重新插入生根培养基，再置于25-30℃，黑暗和光照交替条件下进行培养，长成植株后完成脱毒过程，可用于移栽。

优选的是，步骤1)中杨树外植体选自扦插30-40天杨树扦插苗上剪取，且带有腋芽健壮茎段，先用75％乙醇进行喷洒处理，再剪去叶片和叶柄，之后再用100-200mg/L头孢霉素溶液浸泡处理10-15min。

优选的是，步骤2)中用75％乙醇和100-200mg/L头孢霉素溶液依次浸泡15-20min，剪去两端1-2mm边缘茎段后完成外植体消毒处理。

优选的是，步骤3)和步骤4)中黑暗和光照交替条件为16h/8h，其中光照强度为2800–3000Lux。

优选的是，步骤3)和步骤4)中所述生根培养基包括以下质量浓度的组分：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.2g/L。

优选的是，步骤1)-3)中所用的杨树外植体剪去后的茎段均要保持在2-3cm，并且至少包括1-2个腋芽。

本发明还提供所述的杨树外植体脱毒试剂或所述的杨树外植体脱毒方法在无性繁殖和组培育苗中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的杨树外植体脱毒方法，仅利用浓度为75％的乙醇和头孢霉素即可完成脱毒处理，相对于现有杨树外植体脱毒技术，本发明提供的脱毒方法大大简化杨树外植体脱毒步骤，并且还避免使用次氯酸等化学消毒剂，以及消毒剂对于组织结构的破坏影响繁殖，可以实现较好的保持外植体生长活性，增加消除外植体表面寄生细菌的能力，提升外植体脱菌消毒的工作效率。本发明公开的方法，简单易行，可以有效解决杨树扦插苗表面寄生细菌难以清除的难题，更快速的完成大量杨树外植体脱毒工作，节约时间和人力，此外，经过该方法脱毒处理的外植体有较强的生根性能，可为杨树无性繁殖和组织培养提供新的工作方法和育种材料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为自扦插30d后山新杨外植体剪取的茎段；

图2为山新杨外植体脱毒后生根培养18d的根部生长图；

图3为山新杨腋芽生根培养6d的根部生长图；

图4为山新杨腋芽生根培养6d的根部以上植株正面培养图。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例杨树外植体采集于东北林业大学杨树种植基地的山新杨。

实施例1杨树外植体脱毒方法

(1)外植体获得：选择扦插后30d山新杨健壮茎段作为外植体来源，用75％乙醇喷洒外植体表面，剪去叶片和叶柄，保留1个腋芽。

(2)浸泡：外植体获得后在含有100mg/L头孢霉素溶液中浸泡，浸泡时长为10min。

(3)冲洗：用含有100mg/L头孢霉素溶液对浸泡后外植体进行两次冲洗，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分。

(4)消毒：用75％乙醇和含有100mg/L头孢霉素的无菌水依次浸泡处理15min，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分，剪去两端1mm边缘茎段后(剪去两端后茎段为2.5cm)完成外植体消毒处理。

(5)生根培养：消毒处理完成后的杨树外植体，插入生根培养基，于25℃，光周期为16h/8h，光照强度为2800Lux的温室内培养，长出良好根系。

增殖培养：从长出良好根系的消毒茎段上剪下处于发育阶段的腋芽，插入到新的生根培养基中，置于温度为25℃，光周期为16h/8h，光照强度为2800Lux的温室内培养，长成植株后可移栽到温室环境内土培种植。

生根培养基包括以下质量浓度的组分：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.2g/L，pH调至5.8。

实施例2杨树外植体脱毒方法

(1)外植体获得：选择扦插后35d山新杨健壮茎段作为外植体来源，用75％乙醇喷洒外植体表面，剪去叶片和叶柄，保留2个腋芽。

(2)浸泡：外植体获得后在含有150mg/L头孢霉素溶液中浸泡，浸泡时长为12min。

(3)冲洗：用含有150mg/L头孢霉素溶液对浸泡后外植体进行两次冲洗，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分。

(4)消毒：用75％乙醇和含有150mg/L头孢霉素的无菌水依次浸泡处理18min，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分，剪去两端1.5mm边缘茎段后(剪去两端后茎段为2.5cm)完成外植体消毒处理。

(5)生根培养：消毒处理完成后的杨树外植体，插入生根培养基，于28℃，光周期为16h/8h，光照强度为2900Lux的温室内培养，长出良好根系。

增殖培养：从长出良好根系的消毒茎段上剪下处于发育阶段的腋芽，插入到新的生根培养基中，置于温度为28℃，光周期为16h/8h，光照强度为2900Lux的温室内培养，长成植株后可移栽到温室环境内土培种植。

实施例3杨树外植体脱毒方法

(1)外植体获得：选择扦插后40d山新杨健壮茎段作为外植体来源，用75％乙醇喷洒外植体表面，剪去叶片和叶柄，保留2个腋芽。

(2)浸泡：外植体获得后在含有200mg/L头孢霉素溶液中浸泡，浸泡时长为15min。

(3)冲洗：用含有200mg/L头孢霉素溶液对浸泡后外植体进行两次冲洗，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分。

(4)消毒：用75％乙醇和含有200mg/L头孢霉素的无菌水依次浸泡处理20min，无菌滤纸或吸水纸吸干表面水分，剪去两端1.5mm边缘茎段后(剪去两端后茎段为3cm)完成外植体消毒处理。

(5)生根培养：消毒处理完成后的杨树外植体，插入生根培养基，于30℃，光周期为16h/8h，光照强度为3000Lux的温室内培养，长出良好根系。

增殖培养：从长出良好根系的消毒茎段上剪下处于发育阶段的腋芽，插入到新的生根培养基中，置于温度为30℃，光周期为16h/8h，光照强度为3000Lux的温室内培养，长成植株后可移栽到温室环境内土培种植。

对比例1

与实施例1不同之处在于：2)-4)将头孢霉素替换为次氯酸溶液。

其他步骤及操作均相同。

对比例2

与实施例2不同之处在于：2)-4)将头孢霉素替换为氯化汞溶液。

其他步骤及操作均相同。

经过实施例1-3山新杨外植体脱毒后生根培养18d，就能明显的看出有根生成(见图2)；再从长出良好的根系后的茎段上选取的山新杨腋芽再次进行生根培养6d，就能观察到1-3cm长的根系长出(见图3)，并且此时带叶片的小植株已形成(见图4)。

经过上述实施例1-3以及对比例1-2的脱毒方法后，现观测生根率和成活率，见下表1。

表1不同脱毒方法的生根率

样品	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2
						生根率	100％	100％	100％	70％	78％
成活率	100％	100％	99％	60％	70％

在进行小规模试验过程中发现，实施例3中实验样品均生根，但是出现1个重复试验样品死亡，经分析可能由于在进行腋芽生根培养过程中，选择腋芽的饱满度存在差异，导致最终在相同培养条件下，出现了个别重复的死亡。而对比例1-2之所以会出现生根率和成活率大幅度降低，可能源于次氯酸溶液和氯化汞溶液对于组织结构的破坏，虽然能够使得部分重复样品生根并且成活，但是由于其结构已经破坏，严重影响后期的生长，造成大量重复样品即使前期生根，但是后期不能对组织结构完全修复，其溶液脱毒仍存在刺激作用，因此，最终导致成活率降低较明显。

此外，本发明组培过程中无明显杂菌生长，将组培苗移栽到温室中时，可以正常生长，不会出现寄生菌致使杨树枯萎无法正常生长的情况，改变了常规杨树扦插苗表面寄生细菌难以清除的难题。并且本发明还能仅用乙醇和头孢霉素进行交替处理就能实现脱毒，相对于常规脱毒试验一方面不使用刺激性的化学试剂，可以有效避免对于杨树组织结构的破坏，另一方面还大大简化了试验步骤，缩短了脱毒时间，提高了脱毒效率，可以更快速的完成大量杨树外植体脱毒工作，节约时间和人力；经过该方法脱毒处理的外植体有较强的生根性能和成活率，可为杨树无性繁殖和组织培养提供新的工作方法和育种材料。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种杨树外植体脱毒试剂，其特征在于，包括：75％乙醇和100-200mg/L头孢霉素溶液，采用两种试剂对所述杨树外植体进行交替处理。

2.一种杨树外植体脱毒方法，其特征在于，包括用权利要求1所述的杨树外植体脱毒试剂进行脱毒，具体包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的杨树外植体脱毒方法，其特征在于，步骤1)中杨树外植体选自扦插30-40天杨树扦插苗上剪取，且带有腋芽健壮茎段，先用75％乙醇进行喷洒处理，再剪去叶片和叶柄，之后再用100-200mg/L头孢霉素溶液浸泡处理10-15min。

4.如权利要求2所述的杨树外植体脱毒方法，其特征在于，步骤2)中用75％乙醇和100-200mg/L头孢霉素溶液依次浸泡15-20min，剪去两端1-2mm边缘茎段后完成外植体消毒处理。

5.如权利要求2所述的杨树外植体脱毒方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中黑暗和光照交替条件为16h/8h，其中光照强度为2800–3000Lux。

6.如权利要求2所述的杨树外植体脱毒方法，其特征在于，步骤3)和步骤4)中所述生根培养基包括以下质量浓度的组分：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.2g/L。

7.如权利要求2所述的杨树外植体脱毒方法，其特征在于，步骤1)-3)中所用的杨树外植体剪去后的茎段至少保持在2-3cm，并且至少包括1-2个腋芽。

8.如权利要求1所述的杨树外植体脱毒试剂或如权利要求2-7任一项所述的杨树外植体脱毒方法在无性繁殖和组培育苗中的应用。