CN102283111A - 大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法 - Google Patents
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Abstract
大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法，它涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。体系建立：获得组培苗；含有LbDREB基因的工程菌的活化及外源基因的转化；脱菌后获得抗性芽；抗性芽生根及移栽；再生植株进行PCR和RT-PCR检测，选取阳性植株，即完成。扩繁：大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株进行分化培养，获得组培苗；进行PCR和RT-PCR检测，取阳性的根、茎段和叶片；三、重复操作2次，即完成。本发明可实现转基因大青杨的快速培育，为大青杨优良品种的开发奠定基础；产生的后代遗传稳定性好，对于实现大青杨转基因苗木的大规模、短周期、高繁殖率和低成本的工厂化生产有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。
背景技术
大青杨(Populus ussuriensis kom.)又名又称憨大杨、哈达杨，主要分布于黑龙江、吉林省，俄罗斯(远东地区)，朝鲜。是中国东北林区特有的乡土树种，木材轻软，材质洁白、致密、耐朽力强，是造纸及胶合板材极好的原料。
大青杨的造林地多为土壤干旱瘠薄、地力衰退严重的退耕还林地，致使大青杨造林成活率低，林木生长周期长，采用常规育种技术进行新品种选育所需时间长、见效慢。在以往的大青杨研究主要集中在种源试验、种子播种、航天育种、多倍体育种等常规育种，随着现代生物技术的飞速发展，利用农杆菌介导法转基因大青杨尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。
大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD600值为0.5～1.0，然后用移液枪吸3～5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2～3刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20～30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；
三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽；
四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；
五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。
大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现：一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；
三、重复操作步骤一和步骤二2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。
本发明大青杨转基因体系建立的方法，可实现转基因大青杨的快速培育，为大青杨优良品种的开发奠定基础，从而培育出速生、丰产、优质、抗逆的大青杨新种质，使该树种的生态效益、经济效益和社会效益得到迅速、充分发挥。
本发明大青杨转基因植株的扩繁方法，产生的后代遗传稳定性好，对于实现大青杨转基因苗木的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产和该树种的转基因植株田间试验和推广工作具有重要意义。
附图说明
图1为具体实施方式九中PCR扩增的电泳图，其中M表示DNA Marker DL2000，H表示水对照，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1-13表示转基因植株A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、B5、E3和B6；图2为具体实施方式九中RT-PCR检测的电泳图，其中M表示DNA Marker DL2000，H表示水对照，N表示阴性对照，P表示阳性对照，泳道1-7表示转基因植株A1、B1、C1、D1、E1、E2和E3。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD600值为0.5～1.0，然后用移液枪吸3～5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2～3刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20～30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；
三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽；
四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；
五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。
本实施方式中1/2MS培养基即MS培养基中大量元素浓度减半，成分如表1所示。
表1
本实施方式步骤二中LB培养基由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物和10g的氯化钠加入蒸馏水并定容至1000mL组成。
本实施方式步骤二中含有LbDREB基因的工程菌购买自东北林业大学林木遗传育种实验室。
本实施方式步骤五中含LbDREB基因的质粒DNA提取自含有LbDREB基因的工程菌。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡40s，灭菌水冲洗2遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒15min，灭菌水冲洗4遍。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中接种是将茎段直接放在培养基表面上；将叶片背面朝下放到培养基上。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤四中栽培基质按体积份数比由1份灭菌的沙子和3份灭菌的泥土组成。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤五中PCR扩增采用20μL反应体系，由下列成分组成：
PCR条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现：一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；
三、重复操作步骤一和步骤二2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。
本实施方式步骤一中大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，即为具体实施方式一的步骤五中最终所获得的大青杨转基因再生植株。
本实施方式中1/2MS培养基即MS培养基中大量元素浓度减半。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同是步骤一中接种是将茎段直接放在培养基表面上；将叶片背面朝下放到培养基上。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六的不同是步骤二中PCR扩增采用20μL反应体系，由下列成分组成：
PCR条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。
具体实施方式九：本实施方式大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s，灭菌水冲洗2遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10min，灭菌水冲洗3遍，再接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD600值为0.5～1.0，然后用移液枪吸5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；
三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养1个月，获得抗性芽；
四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为60μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；
五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。
本实施方式中一年生大青杨取自东北林业大学林木育种基地，采集时间为2010年的8月上旬8(日)至8月下旬26(日)。
本实施方式步骤三中暗培养至愈伤组织或不定芽形成的过程：为培养2周后茎节的两端开始膨大，叶片的伤口处开始变形，4周后开始长愈伤组织，个别个体3个月后开始长愈伤组织；6周后开始分化成芽，个别不太稳定的个体则4个月成芽。
本实施方式步骤五中PCR扩增的电泳图如图1所示，发现共有17个显示阳性，它们的编号分别是：A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、B1、C1、D1、E1、E2、E3、E4、F1；可见水对照(即ddH2O)没有扩增出任何目的基因片段，说明没有任何目的基因的外源污染；阴性对照(即未转化植株DNA)植株叶片的DNA没有扩增出任何的基因片段；A10也没有特异性扩增普带出现，说明这些植株虽能在选择压下正常生长，是假阳性现象，可能随着继续选择培养而去除；A1-A9、B5、E3、B6抗性植株叶片基因组DNA的PCR扩增带与阳性对照扩增带一致，位于稍大于1000Pb，与目的基因1071bp相同；PCR扩增结果证明了目的基因转化成功；但是B5、B6条带较暗，需要进一步研究。
步骤五中RT-PCR检测的电泳图如图2所示，可见水对照和阴性对照没有扩增出任何目的基因片段；A1植株也没有特异性扩增普带出现，说明即使将目的基因转入植物体基因组内，可能由于一些原因，不能在转录水平上表达；转基因植株B1、C1、D1、E1、E2、E3的cDNA的PCR扩增带与阳性对照扩增带一致，在1000bp附近，与目的基因1071bp相同；RT-PCR检测表明外源基因LbDREB转入大青杨的部分植株能在RNA转录水平上表达。
具体实施方式十：本实施方式大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现：一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；
三、重复操作步骤一和步骤二2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。
本实施方式步骤三中重复操作第2次完成后，获得的大青杨转基因植株全部为阳性，可见扩繁后产生的后代遗传稳定性好。
Claims (8)
1.大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD600值为0.5～1.0，然后用移液枪吸3～5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2～3刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20～30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；
三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽；
四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40～100μmol·m-2·s-1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；
五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。
2.根据权利要求1所述的大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于步骤一中将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡40s，灭菌水冲洗2遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒15min，灭菌水冲洗4遍。
3.根据权利要求1所述的大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于步骤一中接种是将茎段直接放在培养基表面上；将叶片背面朝下放到培养基上。
4.根据权利要求1所述的大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于步骤四中栽培基质按体积份数比由1份灭菌的沙子和3份灭菌的泥土组成。
5.根据权利要求1所述的大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于步骤五中PCR扩增采用20μL反应体系，由下列成分组成：
PCR条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。
6.如权利要求1所述大青杨转基因体系建立的方法所得大青杨转基因植株的扩繁方法，其特征在于大青杨转基因植株的扩繁方法按以下步骤实现：一、大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株，取其根、茎段和叶片接种到含0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；
二、分别取组培苗的根、茎段和叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的根、茎段和叶片；
三、重复操作步骤一和步骤二2次，即完成大青杨转基因植株的扩繁。
7.根据权利要求6所述的大青杨转基因植株的扩繁方法，其特征在于步骤一中接种是将茎段直接放在培养基表面上；将叶片背面朝下放到培养基上。
8.根据权利要求6所述的大青杨转基因植株的扩繁方法，其特征在于步骤二中PCR扩增采用20μL反应体系，由下列成分组成：
PCR条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。
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2011
- 2011-06-16 CN CN201110162303XA patent/CN102283111A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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