CN115399240A - 组培培养基、青杨雌株再生体系和转基因株系建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于青杨雌株的组培培养基及其应用，青杨雌株再生体系建立的方法以及青杨雌株转基因株系建立的方法。其中，用于青杨雌株的组培培养基，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6‑BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA0.1mg/L～0.7mg/L；生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA0mg/L～0.2mg/L，或者，生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA0mg/L～0.2mg/L。采用本发明提供的用于青杨雌株的组培培养基能够快速高效地获得青杨雌株和离体再生苗。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养领域，尤其涉及一种用于青杨雌株的组培培养基及其应用，一种青杨雌株再生体系建立的方法以及一种青杨雌株转基因株系建立的方法。
背景技术
杨树即杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物的统称，由于适应性强、分布广泛、再生能力强、树干直、成材快、基因组相对较小等特点，杨树在全球范围内都有大量种植，且在毛果杨基因组首次测序完成后，一直被作为林木分子研究的模式植株。青杨(Populus cathayana)性喜湿润或干燥寒冷的气候，木材纹理直，结构细，易加工，在我国各地常作人工林和行道树种植，在保障国家木材安全战略储备中具有重要地位。同时青杨也具备病虫害严重、对土壤营养成分依赖性强等缺点，通过育种获得性状优良的青杨品种对于提高青杨人工林成林速度，提高人工林产量具有重要意义。
对于生长周期较长的木本植物使用常规的杂家育种往往耗时极长，而诱变育种又突变频率低且变异方向不确定。随着基因工程技术的快速发展，分子遗传育种开始逐渐成为重要的物种遗传改良手段。通过基因工程的方式将基因导入或敲除，从而定向培育遗传新品种，可以高效迅速地获得性状优良的青杨品种，提高人工林产量加速极端地区的绿化工程。
目前，多种杨树已经完成了全基因组测序，大量杨树基因功能被研究，三倍体毛白杨、杂交银腺杨84K和杂交黑杨南林895已经具有成熟的遗传转化体系，但是关于离体再生能力相对较弱青杨的遗传转化体系建立的研究报告相对较少，因此急需建立青杨的稳定高效的遗传转化体系，为青杨在分子水平遗传改良提供理论依据和技术保障，对于杨树的分子研究成果的生产应用具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于青杨雌株的组培培养基。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种用于青杨雌株的组培培养基，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；
所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；
所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA0.1mg/L～0.7mg/L；
所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L。
作为一种实施方式，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，
所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L。
作为一种实施方式，所述愈伤组织诱导培养基、所述愈伤组织分化培养基和所述生根培养基的pH值均为5.8。
本发明的目的之二在于提供一种用于青杨雌株的组培培养基在建立青杨雌株再生体系中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种青杨雌株再生体系建立的方法，包括以下步骤：
1)外植体的选择和灭菌：选取青杨雌株叶片作为外植体，用自来水冲洗后在无菌环境下置于无菌瓶中，乙醇消毒、无菌水清洗后，用NaClO消毒、无菌水清洗，再用无菌滤纸吸干外植体材料表面的水分后，用无菌解剖刀将外植体切割成小块，并在块状外植体的背面切割数个伤口；
2)愈伤组织诱导：将步骤1)得到的块状外植体接种到固态的愈伤组织诱导培养基中，在黑暗环境中培养20天～30天，诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L，小块的叶片接种到所述愈伤组织诱导培养基上时，近轴面向上正置于所述愈伤组织诱导培养基上；
3)分化培养：将步骤2)形成的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基上，培养25天～35天，培养出青杨雌株不定芽；其中，所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；
4)生根培养：将步骤3)形成的青杨雌株不定芽取出，切下2cm～3cm的芽转接入生根培养基中，培养25天～35天，得到生根的青杨雌株无菌组培苗；其中，所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L；
5)组培苗炼苗移栽：将苗高在4.5cm～5.5cm青杨雌株组培苗移栽到无菌土中，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水。
作为一种实施方式，所述步骤1)中选择1个月大扦插苗顶端2～3片幼嫩叶片作为外植体；且/或，
所述步骤1)中采用75％乙醇对外植体消毒30s，且/或，
所述步骤1)中采用2％NaClO对外植体消毒5min，且/或，
所述步骤1)中用无菌解剖刀将外植体切割成大小为1×1cm的小块。
作为一种实施方式，所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；且/或，
所述步骤2)中的所述黑暗环境中温度为25℃，湿度为70％。
作为一种实施方式，所述步骤3)中采用的所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，
所述步骤3)中采用的所述愈伤组织分化培养基的pH值为5.8；且/或，
所述步骤3)中使接种到所述愈伤组织分化培养基上的愈伤组织在温度25℃、湿度70％、光照强度10000lux、光照时间14小时/天的条件下培养不定芽。
作为一种实施方式，所述步骤4)中采用的所述生根培养基由以下物质组成：WPM2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；且/或，
所述步骤4)中采用的所述生根培养基的pH值均为5.8；且/或，
所述步骤4)中使接种到所述生根培养基上的不定芽在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为10000lux、光照时间为14小时/天的条件下培养生根的组培苗。
作为一种实施方式，所述步骤5)中的所述无菌土为体积比为1：1的营养土和蛭石。
本发明的目的之四在于提供一种青杨雌株转基因株系建立的方法，包括上述的青杨雌株再生体系建立的方法，并在步骤5)之前、步骤4)之后包括步骤：
4-1)农杆菌浸染转化青杨雌株叶片；
4-2)转基因株系鉴定：取筛选得到Hyg抗性无菌幼苗叶片提取DNA，并使用Hyg抗性基因特异性引物进行PCR扩增，野生型叶片DNA作为阴性对照。
作为一种实施方式，所述步骤4-1)包括如下步骤：
4-1-1)准备农杆菌菌浸染液；
4-1-2)青杨雌株叶片浸染：选取无菌青杨雌株组培苗顶上的幼嫩叶片，在无菌环境切成0.5×0.5cm2的小块，放入已重悬好的农杆菌菌液中浸染10min～15min；
4-1-3)共培养：将叶片平铺在共培养培养基上，于25℃培养箱中暗培养3d；
4-1-4)愈伤选择培养：将转化过的外植体移到愈伤选择培养基上，在25℃培养箱中暗培养13d～15d，并于每7d更换一次愈伤选择培养基；
4-1-5)生芽选择培养：将叶片伤口处出现的愈伤组织移入生芽选择培养基上，在25℃，光照为10000Lux条件下的光照培养箱中诱导生芽，时间为4周～5周，并于每周更换一次生芽选择培养基；
4-1-6)生根选择培养：当不定芽长至2cm～3cm时，切下不定芽并转入生根选择培养基中，培养9d～11d。
作为一种实施方式，所述共培养培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3 mg/L+乙酰丁香酮100uM；且/或，
所述愈伤选择培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ0.1mg/L+IBA 0.3mg/L+乙酰丁香酮100uM+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L；且/或，
所述生芽选择培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.3mg/L+IBA 0.7mg/L+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L；且/或，
所述生根选择培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+IBA0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的青杨雌株再生体系建立的方法能够快速高效地获得青杨雌株和离体再生苗，可获得大量的再生植株，并且重复性高、培养周期短、再生苗健壮。并且，通过本发明提供的青杨雌株离体再生苗，能够进一步获得转基因株系，本发明所提供的青杨雌株转基因株系建立的方法具有操作简单、重复性高、培养周期短、阳性率高的优点。根据青杨雌株本身的特点，本发明提供的青杨雌株再生体系建立的方法选择叶片作为外植体，在不同培养阶段设置不同培养基和激素组合，提高青杨雌株脱分化、再分化效率，通过三步培养获得大量再生植株，成本低、效率高，同时可以通过继代培养快速扩繁。
附图说明
图1A和图1B为以青杨雌株叶片为外植体诱导培养获得的愈伤组织结果图；
图1C和图1D为以青杨雌株叶片为外植体分化培养获得不定芽的结果图；
图1E为以青杨雌株叶片为外植体生根培养获得的再生苗的结果图；
图1F为以青杨雌株叶片为外植体生根培养不定芽根生长情况结果图；
图2为青杨雌株叶片对Hyg的耐受性水平测试结果图；
图3A和图3B为青杨雌株选择培养过程愈伤生长情况，其中200mg/L Cef对农杆菌抑制作用不显著；
图3C和图3D为青杨雌株选择培养过程愈伤生长情况，400mg/L Cef抑制青杨雌株愈伤组织的生长；
图3E和图3F为青杨雌株选择培养过程愈伤生长情况，200mg/LTim能有效抑制农杆菌且不影响青杨雌株愈伤组织生长；
图4为青杨雌株选择培养过程不定芽和阳性苗生长情况。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明实施例提供的用于青杨雌株的组培培养基，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基。其中，愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+噻二唑苯基脲(TDZ)0.1mg/L～0.3mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L～0.5mg/L。愈伤组织分化培养基，以MS培养基为基本培养基，由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L～0.7mg/L+IBA0.1mg/L～0.7mg/L。生根培养基可以MS培养基为基本培养基，也可以WPM培养基为基本培养基。当生根培养基以MS培养基为基本培养基时，生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+萘乙酸(NAA)0mg/L～0.2mg/L；当生根培养基以WPM培养基为基本培养基时，生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L。本发明实施例提供的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织分化培养基和生根培养基中各个组分的配合及用量提高了青杨雌株的诱导率。如果没有特殊要求，本发明实施例采用的原料都是本领域技术人员常规购买所得。
本发明实施例提供的青杨雌株再生体系建立的方法包括以下操作步骤：
S1：选择合适的外植体进行清洗和消毒以获得无菌的外植体；
S2：将无菌外植体接种到愈伤组织诱导培养基培养诱导愈伤组织；
S3：将获得的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基培养，分化不定芽；
S4：将不定芽接种到生根培养基培养，诱导生根，获得生根的无菌幼苗；
S5：农杆菌侵染无菌苗叶片，潮霉素进行抗性筛选，通过愈伤诱导、不定芽分化和生根诱导，获得潮霉素抗性植株；
S6：幼苗炼苗移栽，获得完整植株。
其中，本发明实施例采用的青杨为杨柳科杨属青杨组树种。
具体操作方法如下：
(1)合适的外植体选择和消毒
选择1个月大扦插苗顶端2～3片幼嫩叶片作为外植体，用自来水冲洗30min；然后于超净工作台中转移到无菌瓶中，75％乙醇消毒30s，无菌水清洗2～3遍，2％NaClO(有效氯含量)消毒5min，无菌水清洗5～6遍，用滤纸吸干叶片表面水分；最后用无菌的解剖刀将叶片切割成大小约为0.5×0.5cm2的小块，并在背面切割数个细小伤口备用。
(2)愈伤组织诱导
将经过消毒处理的青杨雌株外植体接种到无菌的固态愈伤组织诱导培养基上，叶片接种时近轴面向上正置于愈伤组织诱导培养基上，然后置于人工气候箱中暗培养30天，温度为25℃，湿度为70％，培养诱导出愈伤组织。图1A和图1B为以青杨雌株叶片为外植体诱导培养获得的愈伤组织结果图，可见愈伤组织生长良好。
愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基础培养基，由以下物质组成：MS(4.74g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(6g/L)+TDZ(0.1mg/L～0.3mg/L)+IBA(0.3mg/L～0.5mg/L)。表1示出了愈伤组织诱导培养基中不同浓度的激素组合对青杨雌株愈伤组织诱导的影响。从表1中可以看出，浓度为0.1mg/L～0.3mg/L的TDZ能够大量促进青杨雌株叶片愈伤组织形成且能够继续分化得到少量不定芽，但TDZ浓度越高越不利于不定芽分化，浓度为0.3mg/L的IBA有利于促进愈伤组织形成，但浓度过高会使愈伤组织出现轻微褐化，当TDZ浓度为0.1mg/L、IBA的浓度为0.3mg/L，生成绿色愈伤且有部分不定芽，愈伤生长情况较佳。因此，TDZ浓度优选为0.1mg/L，IBA的浓度优选为0.3mg/L。作为一种较佳的实施方式，愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS(4.74g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(6g/L)+TDZ(0.1mg/L)+IBA(0.3mg/L)。其中，愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8。
表1
(3)分化培养
将获得的愈伤组织从培养瓶中取出，剔掉多余的愈伤组织诱导培养基，切除褐化部分，转接到新鲜的愈伤组织分化培养基上于人工气候箱中培养。培养条件为：温度25℃，湿度70％，10000lux光照14小时/天。分化培养30天左右后，培养出青杨雌株不定芽。图1C和图1D为以青杨雌株叶片为外植体分化培养获得不定芽的结果图，不定芽数量多且健壮。
愈伤组织分化培养基以MS培养基为基础培养基，由以下物质组成：MS(4.74g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(7g/L)+6-BA(0.1mg/L～0.7mg/L)+IBA(0.1mg/L～0.7mg/L)。表2为MS培养基和WPM培养基分别与不同浓度的激素组合对青杨雌株愈伤芽分化的影响。因为MS培养基营养成分更加丰富，青杨雌株不定芽在MS培养基上生长比WPM培养基上更佳，本发明实施例提供的愈伤组织分化培养基更有利于愈伤组织分化不定芽。
从表2中还可以看出，浓度在0.1mg/L～0.7mg/L范围内的6-BA能够促进青杨雌株不定芽分化足够的数量，但是当6-BA浓度越高时，不定芽抽茎效果越差越矮小；浓度在0.1mg/L～0.7mg/L范围内的IBA能够促进青杨雌株不定芽抽茎，且浓度越高抽茎效果越好，不定芽越高壮。由于不定芽数量越多越有利于获得大量再生植株，但是矮小不定芽不利于后续生根，为了不再另外进行壮苗培养延长培养周期和增加成本，在培养时一般选择出芽率和抽茎率相对较高的培养基进行培养。本发明实施例提供的愈伤组织分化培养基，当6-BA的浓度为0.1mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L时，外植体平均生芽数约为8、芽健壮，不定芽生长情况较佳，因此，6-BA的浓度优选为0.1mg/L、IBA的浓度优选为0.5mg/L。作为一种较佳的实施方式，愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS(4.74g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(7g/L)+6-BA(0.1mg/L)+IBA(0.5mg/L)。
表2
(4)生根培养
将青杨雌株丛生不定芽取出，切下2cm～3cm左右的芽转接入生根培养基中诱导生根，培养条件与分化培养阶段的条件相同，生根培养30天左右后，得到生根的青杨雌株无菌组培苗。图1E为以青杨雌株叶片为外植体生根培养获得的再生苗的结果图，图1F为以青杨雌株叶片为外植体生根培养不定芽根生长情况结果图，可见生根数量多且长、粗壮多须根。
生根培养基可以以MS培养基为基本培养基，也可以以WPM培养基为基本培养基。当生根培养基以MS培养基为基本培养基时，生根培养基由以下物质组成：1/2MS(2.87g/L)+蔗糖(20g/L)+琼脂(7g/L)+IBA(0mg/L～0.3mg/L)+NAA(0mg/L～0.2mg/L)；当生根培养基以WPM培养基为基本培养基时，生根培养基由以下物质组成：WPM(2.6g/L)+蔗糖(20g/L)+琼脂(7g/L)+IBA(0mg/L～0.3mg/L)+NAA(0mg/L～0.2mg/L)。其中，生根培养基的pH为5.8。表3示出了MS培养基和WPM培养基与不同浓度的激素组合对青杨雌株不定芽生根的影响，可以看出，本发明实施例提供的生根培养基能够提高青杨雌株不定芽的生根率。
其中，青杨雌株不定芽在WPM培养基中生根较快且多，浓度为0.1mg/L～0.3mg/L的IBA能够促进青杨雌株侧根的生长，浓度为0.05mg/L～0.2mg/L的NAA能够促进青杨雌株主根生长，两者组合使用更加有利于得到大量且粗壮的根，促进青杨再生苗生长，有利于提高后续炼苗移栽的成活率。从表3中可以看出，本发明实施例提供的以WPM培养基为基础培养基的生根培养基中，当IBA的浓度为0.1mg/L、NAA的浓度为0.2mg/L时，生根率为100％，并且生根快数量多且长，粗壮多须根，生根情况较佳，因此，IBA的浓度优选为0.1mg/L、NAA的浓度优选为0.2mg/L。作为一较佳的实施方式，生根培养基由以下物质组成：WPM(2.6g/L)+蔗糖(20g/L)+琼脂(7g/L)+IBA(0.1mg/L)+NAA(0.2mg/L)。
表3
(5)农杆菌浸染转化青杨雌株叶片
首先构建具备潮霉素(Hyg)抗性标记的基因过表达重组载体，本实例使用植物双元载体pCXSN，以35S强启动子驱动目的基因PtWRKY40表达。使用冻融法将载体pCXSN-PtWRKY40转化农杆菌EHA105感受态细胞，挑选含目的载体的阳性克隆-80℃保存备用。
使用Hyg对青杨进行抗性筛选，使用头孢(Cef)或特美汀(Tim)对农杆菌进行抑制。筛选青杨雌株叶片对Hyg的本底耐受性，发现在一周内，Hyg对青杨雌株叶片致死的最低浓度为10mg/L。筛选Cef对农杆菌的抑制作用发现，能完全抑制农杆菌外溢的浓度为400mg/L，但此条件为引起青杨外植体的褐化，而200mg/LTim能够有效抑制农杆菌外溢同时不影响青杨外植体的生长。
准备农杆菌菌浸染液：将低温保存的含有重组质粒的农杆菌EHA105划线接种于含50mg/LKan和20mg/L利福平(Rif)的YEP固体培养基上，28℃培养1～2d，直至长出大小均匀的单菌落；挑取单菌落接种于1mL含有50mg/LKan、20mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃振荡过夜培养至OD600为0.6～0.8；取500μL活菌液转到50mL新鲜的YEP培养基中，28℃振荡培养6～8h，至OD600为0.6～0.8；4℃离心收集菌体，用30mL MS重悬液(含4.42g/LMS，30g/L蔗糖，100uM乙酰丁香酮)，放入28℃摇床中避光振荡培养1～2h即可用于转化。
青杨雌株叶片浸染：选取无菌苗顶上的幼嫩叶片，在超净工作台上将其切成0.5×0.5cm2的小块，放入已重悬好的菌液(OD600为0.8)中浸染10～15min，期间每隔2min不断摇晃菌液使其与叶片充分接触。将浸染过的材料用镊子小心夹出放在含有无菌滤纸的平板上吸干菌液，将叶片背面向下平铺在MS共培养培养基上，于25℃培养箱中暗培养3d。共培养培养基由以下物质组成：4.42g/LMS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/L IBA+100uM乙酰丁香酮，pH＝5.8。
愈伤选择培养：3d之后将转化过的外植体移到愈伤选择培养基上，在25℃培养箱中暗培养约2周，其间每周更换一次培养基。愈伤选择培养基由以下物质组成：4.42g/LMS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.1mg/LTDZ+0.3mg/L IBA+100uM乙酰丁香酮+10mg/L Hyg+200mg/LTim。
生芽选择培养：2周后，叶片伤口处出现白色块状疏松愈伤组织时，将其移入生芽选择培养基上，在25℃，光照为10000Lux条件下的光照培养箱中诱导生芽，时间约4～5周，每周更换一次培养基。生芽选择培养基由以下物质组成：4.42g/L MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.3mg/L 6-BA+0.7mg/L IBA+10mg/LHyg+200mg/LTim。
生根选择培养：当不定芽长至约2-3cm时，切下并转入生根选择培养基中，10d左右即可生根。生根选择培养基由以下物质组成：2.6g/LWPM+20g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.2mg/LIBA+0.2mg/LNAA+10mg/L Hyg+200mg/L Tim。
上述结果参照图2至图4所示。
(6)转基因株系鉴定
经选择培养后，取获得的Hyg抗性无菌幼苗叶片提取DNA，并使用Hyg抗性基因特异性引物进行PCR扩增，野生型叶片DNA作为阴性对照。引物序列为：Hyg-F(GTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCC),Hyg-R(GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG)。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测有一段约586bp条带出现的株系则为阳性植株。然后通过定量PCR测定过表达基因表达水平变化。
(7)移栽炼苗
将高约5cm的生根培养获得的再生苗从培养瓶中取出，洗净根部残留的生根培养基，移栽到无菌土中(其中，营养土和蛭石的体积比为1：1)，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水时，正常移栽到需要的条件下进行培养。或者，将高约5cm的生根选择培养获得的再生苗从培养瓶中取出，洗净根部残留的生根选择培养基，移栽到无菌土中(其中，营养土和蛭石的体积比为1：1)，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水时，正常移栽到需要的条件下进行培养。
另外，表4和表5分别示出了MS培养基的成分和WPM培养基的成分。
表4
表5
本发明实施例提供的青杨雌株再生体系建立的方法能够快速高效地获得青杨雌株离体再生苗，可获得大量的再生植株，并且重复性高、培养周期短、再生苗健壮。并且，通过本发明实施例提供的青杨雌株离体再生苗，能够进一步获得转基因株系，本发明实施例提供的青杨雌株转基因株系建立的方法具有操作简单、重复性高、培养周期短、阳性率高的优点。根据青杨雌株本身的特点，本发明实施例提供的青杨雌株再生体系建立的方法选择叶片作为外植体，在不同培养阶段设置不同培养基和激素组合，提高青杨雌株脱分化、再分化效率，通过三步培养获得大量再生植株，成本低、效率高，同时可以通过继代培养快速扩繁。本发明为杨树的细胞工程、基因工程、遗传改良研究，特别是对杨树性别决定研究提供了理想的实验体系。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于青杨雌株的组培培养基，其特征在于，包括用于诱导外植体形成愈伤组织的愈伤组织诱导培养基、用于诱导愈伤组织生长不定芽的愈伤组织分化培养基和用于诱导不定芽生根的生根培养基；
所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L；
所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；
所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的用于青杨雌株的组培培养基，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，
所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L。
3.一种青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外植体的选择和灭菌：选取青杨雌株叶片作为外植体，用自来水冲洗后在无菌环境下置于无菌瓶中，乙醇消毒、无菌水清洗后，用NaClO消毒、无菌水清洗，再用无菌滤纸吸干外植体材料表面的水分后，用无菌解剖刀将外植体切割成小块，并在块状外植体的背面切割数个伤口；
2)愈伤组织诱导：将步骤1)得到的块状外植体接种到固态的愈伤组织诱导培养基中，在黑暗环境中培养20天～30天，诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L～0.3mg/L+IBA 0.3mg/L～0.5mg/L，小块的叶片接种到所述愈伤组织诱导培养基上时，近轴面向上正置于所述愈伤组织诱导培养基上；
3)分化培养：将步骤2)形成的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基上，培养25天～35天，培养出青杨雌株不定芽；其中，所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L～0.7mg/L+IBA 0.1mg/L～0.7mg/L；
4)生根培养：将步骤3)形成的青杨雌株不定芽取出，切下2cm～3cm的芽转接入生根培养基中，培养25天～35天，得到生根的青杨雌株无菌组培苗；其中，所述生根培养基由以下物质组成：1/2MS 2.87g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L，或者，所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA0mg/L～0.3mg/L+NAA 0mg/L～0.2mg/L；
5)组培苗炼苗移栽：将苗高在4.5cm～5.5cm青杨雌株组培苗移栽到无菌土中，上覆保鲜膜保湿，7天后开始逐渐部分掀开保鲜膜，直到幼苗叶片完全暴露在空气中不会脱水。
4.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤1)中选择1个月大扦插苗顶端2～3片幼嫩叶片作为外植体；且/或，
所述步骤1)中采用75％乙醇对外植体消毒30s，且/或，
所述步骤1)中采用2％NaClO对外植体消毒5min，且/或，
所述步骤1)中用无菌解剖刀将外植体切割成大小为0.5×0.5cm2的小块。
5.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ0.1mg/L+IBA0.3mg/L；且/或，
所述步骤2)中采用的所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8；且/或，
所述步骤2)中的所述黑暗环境中温度为25℃，湿度为70％。
6.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤3)中采用的所述愈伤组织分化培养基由以下物质组成：MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA0.1mg/L+IBA 0.5mg/L；且/或，
所述步骤3)中采用的所述愈伤组织分化培养基的pH值为5.8；且/或，
所述步骤3)中使接种到所述愈伤组织分化培养基上的愈伤组织在温度25℃、湿度70％、光照强度10000lux、光照时间14小时/天的条件下培养不定芽。
7.根据权利要求3所述的青杨雌株再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤4)中采用的所述生根培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L；且/或，
所述步骤4)中采用的所述生根培养基的pH值均为5.8；且/或，
所述步骤4)中使接种到所述生根培养基上的不定芽在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为10000lux、光照时间为14小时/天的条件下培养生根的组培苗。
8.一种青杨雌株转基因株系建立的方法，其特征在于，包括如权利要求5至10任一项所述的青杨雌株再生体系建立的方法，并在步骤5)之前、步骤4)之后包括步骤：
4-1)农杆菌浸染转化青杨雌株叶片；
4-2)转基因株系鉴定：取筛选得到Hyg抗性无菌幼苗叶片提取DNA，并使用Hyg抗性基因特异性引物进行PCR扩增，野生型叶片DNA作为阴性对照。
9.根据权利要求8所述的青杨雌株转基因株系建立的方法，其特征在于，所述步骤4-1)包括如下步骤：
4-1-1)准备农杆菌菌浸染液；
4-1-2)青杨雌株叶片浸染：选取无菌青杨雌株组培苗顶上的幼嫩叶片，在无菌环境切成0.5×0.5cm2的小块，放入已重悬好的农杆菌菌液中浸染10min～15min；
4-1-3)共培养：将叶片平铺在共培养培养基上，于25℃培养箱中暗培养3d；
4-1-4)愈伤选择培养：将转化过的外植体移到愈伤选择培养基上，在25℃培养箱中暗培养13d～15d，并于每7d更换一次愈伤选择培养基；
4-1-5)生芽选择培养：将叶片伤口处出现的愈伤组织移入生芽选择培养基上，在25℃，光照为10000Lux条件下的光照培养箱中诱导生芽，时间为4周～5周，并于每周更换一次生芽选择培养基；
4-1-6)生根选择培养：当不定芽长至2cm～3cm时，切下不定芽并转入生根选择培养基中，培养9d～11d。
10.根据权利要求9所述的青杨雌株转基因株系建立的方法，其特征在于，所述共培养培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.3mg/L+乙酰丁香酮100uM；且/或，
所述愈伤选择培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+TDZ 0.1mg/L+IBA 0.3mg/L+乙酰丁香酮100uM+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L；且/或，
所述生芽选择培养基由以下物质组成：MS 4.42g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.3mg/L+IBA 0.7mg/L+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L；且/或，
所述生根选择培养基由以下物质组成：WPM 2.6g/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+Hyg 10mg/L+Tim 200mg/L。
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